miR-6824-3p通过靶向NRAS调控巨噬细胞TNF-α分泌抑制乙型肝炎病毒复制

摘要

目的 探讨miR-6824-3p对巨噬细胞功能的调控作用及其抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制的分子机制,为阐明HBV持续感染的免疫调控机制提供实验依据。方法 将miR-6824-3p模拟物(miR-6824-3p mimic)和miR-6824-3p抑制剂(miR-6824-3p inhibitor)转染至人急性单核白血病细胞(THP-1)诱导的巨噬细胞,通过定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、中性红摄取、活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成及荧光乳胶微粒吞噬实验,评估miR-6824-3p对巨噬细胞炎症因子分泌及功能状态的影响。结合生物信息学、双荧光素酶报告基因实验、蛋白质免疫印迹(Western blot)及siRNA干扰技术预测并鉴定miR-6824-3p的靶基因,检测其对下游信号通路的影响。qRT-PCR、Western blot检测miR-6824-3p调控的巨噬细胞对HepAD38细胞中HBV DNA、前基因组RNA(pregenomic RNA, pgRNA)、共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)及HBV相关抗原水平的影响,并通过中和抗体实验鉴定关键效应因子。结果 miR-6824-3p mimic显著促进巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)等促炎因子的表达与分泌(P<0.001),同时降低ROS生成水平及荧光乳胶微粒吞噬率(P<0.05),但不影响其基础胞饮功能。miR-6824-3p可显著下调巨噬细胞中NRAS的表达,并伴随丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路活性(p-MEK、p-ERK)的降低。与对照组相比,经miR-6824-3p调控的巨噬细胞可显著降低HepAD38细胞中HBV DNA、pgRNA、 cccDNA及HBV相关抗原乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的表达(P<0.01);在miR-6824-3p调控的巨噬细胞条件培养基和巨噬细胞与HepAD38肝癌细胞系共培养体系中均能观察到类似的抑制效应。进一步加入TNF-α中和抗体后,上述抗病毒作用明显减弱(P<0.001)。结论 miR-6824-3p可以通过靶向NRAS影响下游MAPK信号通路,调控巨噬细胞免疫功能,其诱导的TNF-α是抑制HBV复制的关键分子之一。本研究为进一步阐明miRNA通过调控免疫微环境从而影响HBV复制的分子机制积累了证据。

关键词

HBV / miR-6824-3p / 巨噬细胞 / TNF-α / NRAS / MAPK信号通路