连作对纹党生长、生理特性及自毒物质的影响研究

Research on effects of continuous cropping on the growth， physiological characteristics and autotoxic substances of Codonopsis pilosula var. modesta

摘要

为探究纹党连作障碍效应及发生机制，以正茬（CK）和连作1年（CC₁）、连作2年（CC₂）及连作3年（CC₃）土壤为试验对象，开展盆栽试验，动态研究连作对纹党生长、抗氧化酶系统及叶绿素的影响，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析了不同连作年限土壤中自毒物质的种类及含量。结果显示，苗期、开花期、生长旺盛期及收获期各个生育时期内，连作对纹党的生长均存在抑制作用，且随连作年限的延长作用逐渐加强；同一连作年限，随着生育进程的推进，叶片中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性先增加后下降，过氧化物酶（POD）活性先下降后增加再下降，但在同一生长阶段，3种抗氧化酶活性均随连作年限增加逐年下降，而丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖含量和相对电导率均逐年增加；从CK、CC₁、CC₂和CC₃中分别鉴定出5、17、13和4种化学物质，主要包括：邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯、邻苯二甲酸二丁酯、丙酸乙酯和油酸酰胺等物质，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯在各种处理土壤中均存在，其相对含量均较高。连作可以通过破坏纹党植株中抗氧化酶系统，降低叶片叶绿素含量抑制纹党生长，产生连作障碍；连作条件下自毒作用是导致纹党发生连作障碍的主要原因之一。

Abstract

In order to explore the continuous cropping obstacle effect of Codonopsis pilosula var. modesta and its mechanism， pot experiments were conducted in the soil of normal crop （CK）， and continuous cropping 1 year （CC₁）， continuous cropping 2 years （CC₂） and continuous cropping 3 years （CC₃） as experimental objects. The effects of continuous cropping on the growth， antioxidant enzyme system and chlorophyll of C. pilosula var. modesta were evaluated， and the types and levels of autotoxic substances in the soil of different continuous cropping years were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results showed that continuous cropping had an inhibitory effect on the growth of C. pilosula var. modesta at the seedling stage， flowering stage， peak growth stage and harvest stage， and the effect gradually strengthened with increase in the number of continuous cropping years. In the same continuous cropping years， with the advancement of growth process， the activities of catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） in leaves initially increased and then decreased， and the activities of peroxidase （POD） initially decreased and then increased and then decreased again， but at the same growth stage， the activities of the three antioxidant enzymes all decreased year by year， and but the levels of malondialdehyde （MDA）， proline （Pro）， soluble sugar and the relative conductivity all increased year by year. The results of GC-MS showed that 5， 17， 13 and 4 chemical substances were identified from CK， CC₁， CC₂ and CC₃， respectively， including di-2-ethylhexyl phthalate， dibutyl phthalate， ethyl propionate and oleamide， among which di-2-ethylhexyl phthalate was found in all treatments with relatively high levels. It can be seen that continuous cropping can inhibit the growth of C. pilosula var. modesta by disrupting the antioxidant enzyme system and reducing the leaf chlorophyll content， resulting in continuous cropping disorders. The autotoxicity under continuous cropping is one of the main causes for continuous cropping disorders in C. pilosula var. modesta.

Graphical abstract

关键词

纹党 / 连作障碍 / 生理生化 / 化感自毒作用 / 气相色谱-质谱分析

Key words

Codonopsis pilosula var. modesta / continuous cropping obstacles / physiology and biochemistry / allelopathic autotoxicity / gas chromatography-mass spectrometry

纹党，为桔梗科（Campanulaceae）植物素花党参（Codonopsis pilosula var. modesta）的干燥根，是甘肃省道地药材，具有补中益气、健脾益肺、养血生津的功效^［1］。纹党主要分布于四川省和甘肃省交界地带，主产区在甘肃省陇南文县。据统计，至2022年，陇南文县纹党种植面积达7300 hm²，年产量6950 t，产值达29000万元^［2］。然而，近年来随着纹党市场需求量的逐年上升，部分种植户盲目追求经济效益，加上纹党本身适生范围狭窄，种植土地有限等诸多因素导致了纹党连作现象频发，产量和品质严重降低。数据显示，连作3年后的地块再次种植纹党后其减产量高达65%以上^［2］，可见连作障碍已成为限制纹党产业可持续发展的重要因素。研究表明，约70%的块根类中药材存在严重的连作障碍问题^［3］，如人参（Panax ginseng）连续种植7年后，其株高、主根长和须根数均有所下降，植株抗氧化酶系统遭受破坏，生长受到抑制^［4］；半夏（Pinellia ternata）连作1年后，其株高、块茎直径、地上及地下部分生物量均低于同时期轮作植株，产量和品质均下降^［5］；茅苍术（Atractylodes lancea）连作3年，种植土壤产生的自毒物质能抑制后茬植株的生长，诱导植株体内抗氧化酶活性的改变，扰乱代谢过程，最终导致产量的下降^［6］。由此可见，连作会影响药用植物生长及生理特性，并造成自毒物质的积累。基于此，本研究利用盆栽试验动态研究了不同连作年限土壤对纹党植株生长、生理特性及自毒物质种类和含量的影响，初步揭示纹党连作障碍效应及生理机制，以期为缓解纹党连作障碍提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纹党幼苗为甘肃省陇南文县当地药农自行培育的一年生纹党种苗，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为桔梗科植物素花党参。

1.2 试验设计

试验共设正茬（3年内未种植过纹党）、连作1、2和3年4个处理，不同处理土壤于2022年10月均取自陇南文县相应地块耕层土壤，均为壤土，分别标记为CK、CC₁、CC₂和CC₃。4种处理中土壤碱解N分别为：15.03、15.59、15.28及15.87 mg·kg^-1，土壤速效P分别为：16.72、17.21、16.98及17.69 mg·kg^-1，土壤速效K分别为：54.89、63.53、64.95及72.74 mg·kg^-1。将不同处理土壤肥力补充一致后，于2023年3月20日选择性状优良、大小均一的纹党种苗，消毒（在浓度为3 mg·mL^-1的高锰酸钾溶液中灭菌10 min，再用无菌蒸馏水冲洗2~3次）后移栽至装有10 kg土壤的营养盆（32 cm×21 cm×28 cm）中，每盆10株，每个处理重复5次，每个重复3个平行，随机排列放置室外，全生育期正常管理。

1.3 测定指标及方法

于苗期（40 d）、开花期（90 d）、生长旺盛期（140 d）及收获期（180 d）分别取样进行生长指标、抗氧化酶活性、渗透调节物质及叶绿素含量的测定；于生长旺盛期分析不同处理土壤中自毒物质的种类及含量。

1.3.1 生长指标的测定

随机选取不同处理各3盆，每盆随机选取3株，分别使用卷尺测定植株的藤长和根长，用游标卡尺测定其根直径，用万分之一天平称量其根鲜重和干重。

1.3.2 抗氧化酶活性的测定

采用紫外吸收法^［7］测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性；采用愈创木酚显色法^［8］测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用氮蓝四唑光氧化还原法^［9］测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.3.3 渗透调节物质及细胞膜透性相关指标的测定

采用酸性茚三酮法^［7］测定脯氨酸（proline，Pro）含量；采用蒽酮比色法^［10］测定可溶性糖含量；采用硫代巴比妥酸显色法^［7］测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用浸泡法^［11］测定相对电导率。

1.3.4 叶绿素含量的测定

分别取各处理同一部位成熟叶片，使用丙酮-乙醇混合液提取法^［12］提取叶绿素，采用分光光度法^［12］测定叶绿素含量。

1.3.5 化感自毒物质的检测

取各处理新鲜根际土壤500 g，加入适量蒸馏水超声提取2 h后浸泡24 h，4000 r·min^-1离心20 min，抽滤上清液，0.45 µm微孔滤膜过滤后浓缩至少量，用3倍量体积的乙酸乙酯萃取后减压浓缩至0.5 mL，0.22 µm微孔滤膜过滤后，用于气质联用色谱技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测。

检测条件：美国Agilent公司7890B型气相色谱-5977B型质谱联用仪，色谱柱为HP-5MS（30 m×250 µm×0.25 µm），程序升温（起始温度50 ℃，保持1 min；以10 ℃·min^-1的速率升温至130 ℃，保持2 min；以4 ℃·min^-1的速率升温至160 ℃，保持2 min；以5 ℃·min^-1的速率升温至180 ℃，保持3 min；以5 ℃·min^-1的速率升温至200 ℃，保持5 min；以4 ℃·min^-1的速率升温至250 ℃，保持8 min；以10 ℃·min^-1的速率升温至280 ℃，保持14 min；以8 ℃·min^-1的速率升温至300 ℃结束），进样口温度250 ℃，载气为He，进样量1 µL，流速1.0 mL·min^-1，离子源温度230 ℃，电离电压70 eV，全扫描，扫描范围为m/z 50~550。

检测结束后，比对NIST14.L数据库，分析质谱图识别结果，利用峰面积归一化法^［13］计算各成分相对含量。

借鉴Jaccard相似系数公式，比较不同处理土壤中化合物的相似度（J）。其计算公式为：

J(\mathrm{\%})=\frac{e}{a+b+c+d+e}\times \mathrm{100}

式中：a、b、c、d分别为CK、CC₁、CC₂和CC₃根际土壤中特有组分的数目；e为共有组分数目。a、b、c、d所代表组分相对含量大于1%；e所代表4个处理共有组分中至少有1个组分的相对含量大于1%。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2010软件处理原始数据，绘制图表，利用SPSS 17.0软件对试验数据进行方差分析与显著性检验。

2 结果与分析

2.1 连作对纹党生长指标的影响

连作抑制了纹党植株的生长（表1）。在4个生长阶段，随连作年限的延长，纹党各生长指标均有所下降。苗期，CC₁中根长、根直径、根鲜重、根干重和藤长较CK分别下降了16.27%、9.32%、29.77%、60.61%和30.03%，CC₂中分别下降了29.01%、27.12%、48.63%、65.65%和35.90%，CC₃中分别下降了34.05%、48.31%、55.25%、69.99%和50.21%，且与CK相比除CC₁根直径外，其余生长指标均差异显著（P<0.05）。此外，该时期CC₃与CC₁相比，其根长、根直径、根鲜重、根干重及藤长也分别下降了21.24%、42.99%、36.28%、23.81%和28.84%，除根干重外其余指标间差异均达显著水平（P<0.05）。开花期、生长旺盛期和收获期，所有连作处理中除开花期CC₁和CC₂的藤长和收获期CC₁的藤长外，其余各生长指标较CK均显著下降（P<0.05），且随连作年限的延长，下降程度不断加强。

2.2 连作对纹党叶片生理特性的影响

2.2.1 连作对纹党抗氧化酶活性的影响

同一生育时期内，随连作年限的增加，纹党植株CAT、POD和SOD活性均表现出逐年下降趋势（图1~3）。相同连作年限下CAT活性随生育阶段的变化呈先增加后下降的趋势，开花期达到最大值，该时期CC₁、CC₂和CC₃处理的CAT活性较CK分别显著下降了14.61%、15.34%和15.37%（P<0.05）；随生育时期的推进，POD活性表现出先下降后增加又下降的变化趋势，生长旺盛期达到最大值，这一时期CC₁、CC₂和CC₃处理的POD活性较CK分别显著下降了22.42%、26.13%和35.28%（P<0.05）；SOD活性的变化趋势与CAT活性一致，同样在开花期达到最大值，此时期CC₁、CC₂及CC₃处理的SOD活性较CK分别显著下降了15.26%、35.98%和43.47%（P<0.05），与CAT变化相比，二者之间存在差异性，即开花期CC₁、CC₂和CC₃之间CAT活性差异不显著，而SOD活性差异均显著（P<0.05）。由此可见，连作可以影响纹党叶片的抗氧化酶活性，且对不同酶的影响程度有所差异。

2.2.2 连作对纹党细胞膜透性及渗透调节物质的影响

同一生长阶段，随连作年限的增加，纹党叶片MDA、Pro、可溶性糖含量以及相对电导率均逐年增加（图4~7），收获期CC₁与CK相比，其叶片MDA、Pro、可溶性糖含量和相对电导率分别显著增加了22.27%、15.47%、14.68%和25.61%（P<0.05），同时期CC₃较CC₁其叶片MDA、Pro、可溶性糖含量和相对电导率也分别显著增加了34.28%、34.63%、40.18%和47.66%（P<0.05），且全生育阶段CC₃与CC₁相比，除苗期MDA和Pro含量差异不显著外，其余指标均显著增加（P<0.05），可见连作年限越长，纹党叶片细胞膜受到的破坏程度越强。此外，从苗期、开花期、生长旺盛期到收获期，不同连作年限处理下纹党叶片的MDA、Pro、可溶性糖含量和相对电导率均呈不断增加趋势，收获期达到最大值，这一现象可能与收获期连作土壤中积累的自毒物质含量有关。收获期纹党根系分泌的自毒物质不断累积，含量增大，从而对纹党植株细胞膜的破坏作用增强，MDA含量增加，电解质外渗量增加，相对电导率提高。

2.2.3 连作对纹党叶片叶绿素含量的影响

同一生长阶段，随连作年限的延长，纹党叶片中叶绿素含量呈不断下降趋势（图8），所有连作处理叶绿素含量与CK相比均显著下降（P<0.05）。其中，CC₁处理在苗期、开花期、生长旺盛期及收获期，其叶绿素含量较CK分别显著下降了24.87%、26.07%、23.08%和14.49%（P<0.05），CC₃处理在4个时期其叶绿素含量较CK也分别显著下降了33.13%、42.84%、38.53%和32.99%（P<0.05），且CC₃与CC₁相比，4个时期叶绿素含量差异也均达显著水平（P<0.05）。由此可见，连作对纹党植株叶绿素含量具有一定的抑制作用，且这种作用伴随在整个生育期内。

2.3 连作土壤中自毒物质的鉴定

采用GC-MS分析不同处理中潜在的化感自毒物质。结果发现，CK中检测出5种化合物，主要包括：邻苯二甲酸二丁酯、丙烯醛、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯等物质；CC₁中检测出17种化合物，主要包括：邻苯二甲酸二丁酯、丙酸乙酯和邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯等；CC₂中鉴定出13种化合物，主要包括：2， 4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯、丙酸乙酯等物质；CC₃中检测到4种化合物，包括：丙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、油酸酰胺和邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（表2~5）。

计算不同处理纹党土壤中相对含量大于1%组分的相似系数。结果显示，4种处理土壤中所含化合物的相似系数为15.38%，邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯为各处理土壤共存化合物，且相对含量均较高，前者在CC₁、CC₂和CC₃中相对含量均为最高成分，分别为44.73%、64.15%和86.01%，而在CK中占到4.82%；后者在CC₁、CC₂和CC₃中相对含量分别为10.10%、12.18%和5.74%，而在CK中相对含量高达72.14%。表2~5中列出的化学物质均为GC-MS分析匹配度大于80%的化合物。CK、CC₁、CC₂和CC₃处理土壤浸提液的GC-MS色谱图见图9。

3 讨论与结论

3.1 连作对纹党植株生长的影响

植物通过根系吸收土壤中的营养与水分，从而进行自身的生长，生长指标可直接反映连作对纹党生长的影响。赵振利等^［14］研究发现，连续种植2和3年白花泡桐（Paulownia fortunei），其各项形态指标均小于正茬。刘诗蓉等^［15］研究发现，半夏连作二茬后，其植株叶片宽度、叶片长度、根长、株高、块茎直径等生长指标均呈下降趋势，且下降现象表现在整个生育时期内。本研究还发现，在纹党的4个生长阶段内，其根长、根直径、根鲜重、根干重及藤长均随连作年限的增加逐年减小，这一结果与上述结论相一致。

3.2 连作对纹党逆境生理指标的影响

CAT、POD和SOD可以清除植物体内过多的活性氧，提高植物抵抗逆境的能力，从而有益于植物在逆境环境下生存^［16］。本研究发现，在苗期、开花期、生长旺盛期和收获期等每一生育时期内，纹党叶片CAT、POD和SOD活性均随连作年限的增加呈逐年下降的趋势，说明连作条件下纹党叶片细胞中抗氧化酶不足以清除过多的自由基，从而加剧叶片细胞的受损程度，这与师桂英等^［17］在研究连作对兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）叶片各生育时期抗氧化酶活性的变化结果相一致。纹党植株叶片中MDA、Pro、可溶性糖含量及相对电导率在各个生育时期内均随连作年限的延长而不断增加，说明逆境下，植物为抵抗连作对自身细胞造成的伤害，需要通过积累大量的渗透调节物质，以力争稳定细胞膨压，维持原有代谢过程。但是，随着连作年限的增加，纹党植株受到的胁迫程度不断增大，从而引起纹党叶片中MDA、Pro、可溶性糖含量以及相对电导率随着连作年限的延长而不断增加。此外，本研究还发现，各生育时期内，所有连作处理中纹党叶片的叶绿素含量较CK均显著下降，这一现象与杨雪等^［18］研究连作苦荞（Fagopyrum tataricum）和杨科等^［19］研究连作藜麦（Chenopodium quinoa）时的现象一致，说明连作后纹党的光合作用能力有所减弱，有机物的积累减少，从而影响了纹党的生长，导致连作障碍发生。

3.3 连作障碍与自毒作用

引起药用植物连作障碍发生的原因很多，诸如土壤理化性状的改变、土壤供肥的不足、土壤微生物多样性的变化以及土壤中化感自毒物质的累积等多种因素^［20-23］。研究显示，化感自毒物质引起的自毒作用是导致药用植物连作障碍发生的重要原因之一^［24-27］。基于此，本试验在对连作下纹党植株的生长及生理特性进行研究的基础上，对不同连作年限纹党土壤中的自毒物质种类进行了鉴定。结果显示，从CK、CC₁、CC₂和CC₃处理土壤中分别检测出5、17、13和4种化学成分，化学物质的种类随连作年限的延长反而减少，未呈现出物质种类的累积趋势，造成这一结果的原因可能存在3个方面。第一，不同的化学物质间可能会发生一定的化学反应，且生成物可能不具有挥发性，故仅利用GC-MS技术未能完全检出；第二，生长指标和自毒物质检测结果提示，部分自毒物质并非直接作用于植物，可能通过微生物的转化而间接作用于植物，从而造成生长指标的下降；第三，本研究仅利用了GC-MS技术检测了土壤中的挥发性、低极性物质，鉴定结果提示纹党连作土壤中极有可能还存在中、强极性的其他化学物质，故在后续研究中将进一步利用液质联用非靶向代谢组学技术对纹党连作土壤中的中、强极性物质进行检测。此外，本试验还发现，所有处理土壤中均存在邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯，且相对含量均较高，故推测邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯可能为纹党连作土壤中的低极性典型自毒物质，其自毒效应及作用机制将在后续试验进行研究。

综上所述，连作可以通过抑制纹党植株抗氧化酶活性破坏细胞膜结构，通过降低纹党叶片叶绿素含量影响光合作用能力，降低有机物的合成和累积，进而影响纹党植株的生长，引起连作障碍的发生。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82160714)

甘肃省自然科学基金项目(21JR1RA271)

国家重点研发计划项目(2018YFC1706305)

甘肃省高等学校产业支撑引导项目(2021CYZC-40)

2023年研究生“创新之星”项目(2023CXZX-764)

敦煌医学与转化教育部重点实验室项目(DHYZX20-13)