盐生草HgS5基因的克隆与抗旱性鉴定

Gene cloning and drought resistance identification of the gene HgS5 in Halogeton glomeratus

摘要

为应对日益严峻的干旱环境问题，发掘植物体内的抗旱基因具有重要意义。基于前期盐生草转录组测序数据分析结果，盐胁迫后HgS5基因的表达量与差异倍数最高，故选其为研究对象，对目的基因编码的蛋白进行生物信息学分析并进行亚细胞定位；通过qRT-PCR检测目的基因在拟南芥植株叶片和根系的相对表达量，并利用农杆菌完成拟南芥异源表达，以验证目的基因的抗旱能力。结果表明，HgS5基因中碱基对的数量为1738，编码370个氨基酸，编码蛋白为酸性亲水性蛋白且没有跨膜区；具有116个启动子顺式作用元件；HgS5基因和巨人柱、苋菜和甜菜相关同源基因拥有相同的A_thal_3526保守结构域；亚细胞定位显示HgS5基因主要在细胞膜上表达； 荧光定量结果显示HgS5基因主要在拟南芥根系表达，处理第6天表达量与其他组别差异显著（P<0.05）；抗旱鉴定结果显示过表达拟南芥的抗旱性明显增强，具体表现为植株枯萎程度减缓；基因HgS5通过影响酶活性来对抗干旱环境，过表达拟南芥根系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性在干旱胁迫后期整体高于野生型。综上所述，基因HgS5在抗旱过程中起到了积极的调控作用。研究结果旨在为进一步探索HgS5基因应对干旱胁迫的分子响应机制提供理论依据。

Abstract

To address environmental challenges involving escalating frequency and severity of drought， it is of utmost importance to develop a deep understanding of drought-resistance genes in plant genomes. Based on our initial laboratory analysis of transcriptome sequencing data from Halogeton glomeratus， the HgS5 gene exhibited the highest expression level and differential fold change following salt stress. This study focused on the HgS5 gene， conducting bioinformatics analysis and subcellular localization of the protein encoded by this target gene. We employed qRT-PCR to assess the relative expression of the target gene in the leaves and roots of Arabidopsis thaliana， and achieved heterologous expression in A. thaliana using Agrobacterium as a vector. In this experiment， we cloned the HgS5 gene from H. glomeratus and validated its drought resistance in A. thaliana. It was found that the HgS5 gene comprises 1738 base pairs， encoding 370 amino acids. The encoded protein is acidic and hydrophilic， lacking a transmembrane region. Featuring 116 promoter cis-acting elements， the HgS5 gene shares a A_thal_3526 conserved domain with homologous genes related to Carnegiea gigantea， Amaranthus tricolor， and Beta vulgaris. Subcellular localization indicated that the HgS5 gene is primarily expressed on the cell membrane. Fluorescence quantitative analysis showed that the HgS5 gene is predominantly expressed in the roots of A. thaliana， with a significantly increased expression level compared to other groups at 6 days （P<0.05）. The drought resistance assessment revealed a notable enhancement in drought tolerance in A. thaliana overexpressing the HgS5 gene， evident in a slower wilting rate of the plants. The HgS5 gene conferred resistance to dry conditions by influencing enzyme activity， initially increasing and subsequently decreasing the activities of superoxide dismutase， peroxidase， and catalase in the roots of A. thaliana. To summarize， the gene HgS5 plays a pivotal role in the process of drought resistance. The aim of this study was to provide a theoretical basis for further exploration of the molecular response mechanism of the HgS5 gene to drought stress.

Graphical abstract

关键词

盐生草 / 基因家族 / 生物信息学分析 / 基因克隆 / 抗旱性鉴定

Key words

Halogeton glomeratus / gene families / bioinformatics analysis / gene cloning / drought resistance identification

土壤干旱是影响植物最不利的环境因素之一，导致全球化的农业生产损失^［1］。在干旱和半干旱地区，植物根系的蒸发和向上吸水导致盐分集中在土壤表层，从而提高了近地表土壤的含盐量。因此土壤盐度通常会与干旱成为叠加的负面环境影响因素^［2］。有研究认为干旱逆境会使细胞膜首先受到伤害，导致植物体内大量富集活性氧，防御系统无法及时清除导致自体平衡被破坏，膜上出现孔隙增加胞内大分子电解质外渗^［3-4］，造成剧烈的活性反应，氧化还原酶类中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）^［5］活性变化最明显。

盐生草（Halogeton glomeratus），一年生藜科（Chenopodiaceae）草本植物，广泛分布于中亚和中国西北干旱地区^［6］。其在盐渍化土壤生态系统中具有天然生存优势，广泛分布于我国西北地区的荒漠戈壁地带。这种植物以其细长而有蜡质结构的叶片著称，这些叶片表面光滑，不易受到病虫害侵袭，并且能有效减少水分蒸发，展现出卓越的耐盐、耐高温和抗旱特性^［7］。盐生草作为极具潜力的耐旱植物，其蕴藏的与干旱相关的基因若得到有效挖掘和应用，将推动抗旱作物的研究进程，从而为应对干旱环境挑战提供更多解决方案。

植物为抵御逆境而产生的抗逆反应，受环境与植物体内激素的调控，调控的源头正是抗性基因的表达。关于抗性基因的挖掘，其试验体系目前已成熟运用在各作物之中，马铃薯（Solanum tuberosum）^［8］、大豆（Glycine max）^［9］、玉米（Zea mays）^［10］、烟草（Nicotiana tabacum）^［11］、水稻（Oryza sativa）^［12］和棉花（Gossypium spp）^［13］中均有报道；同时基因挖掘也是培育具有优良抗性种质的重要手段。基因的表达情况随着逆境的不同而出现差异，目前有水通道蛋白、渗透调节蛋白等基因^［14］受干旱胁迫诱导。盐生草作为耐盐耐旱优良植物，目前已报道的基因多集中于盐胁迫机理研究，包括盐生草叶中分时段影响钠钾离子泵转运的HgNHX1和HgSOS1基因^［15-17］；还有一种在盐生草中高度保守的管家基因“Actin基因”^［18］；还有具有调节盐生草耐盐性功能的HgAKR6C基因^［19］等，对于盐生草干旱胁迫响应基因及其分子调控机制研究还有待补充。课题组前期以盐生草盐胁迫转录组数据为基础（BioProject ID： PRJNA388267），筛选表达量与差异倍数最高^［20］的候选基因，发现HgS5基因在盐胁迫下上调表达，为了进一步验证盐生草HgS5基因是否正向调控植物干旱胁迫，本研究通过生物信息学分析和亲缘关系初步了解该基因的基础特性，并进行了基因表达量差异分析和亚细胞定位，同时结合拟南芥异源表达分析初步研究该基因的功能，对转基因拟南芥进行抗旱表型评价和相关酶活性指标测定，结果显示HgS5基因在拟南芥和盐生草响应干旱胁迫中具有正向调控作用。以期为后期HgS5 基因的耐旱调控机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及种植方法

试验材料中盐生草种子来自甘肃省会宁县盐碱地（35°26′ N、104°31′ E），2022年4月点播于无菌水浸透的培养基质（蛭石∶细沙=1∶1）中，每天浇灌一次Hoagland’s营养液，保持土壤湿润。

野生型拟南芥Col-0（wild type， WT）种子保存于实验室种子柜，同年种植，步骤参照盐生草播种方法，培养基质为添加吡虫啉溶液的全营养土，培养至抽薹前期用于遗传转化。

本氏烟草（Nicotiana benthamiana）于2022年4月点播在甘肃农业大学人工气候室盆栽中，具体方法参照盐生草播种方法。

1.2 HgS5基因克隆及生物信息学分析

以基因HgS5的cDNA为模板（1738 bp），设计引物见表1。采集盐生草45 d叶片和根系样本，试剂盒提取RNA（TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit），反转录步骤参考说明书（天根反转录试剂盒）。PCR反应体系：2 µL dNTP Mixture 2.5 mmol·L ^-1、2.5 µL 10×Ex Taq Buffer Mg²⁺ Plus、正反向引物（10 µmol·L ^-1）各1 µL、0.2 µL Ex Taq酶、1 µL cDNA、17.3 µL ddH₂O。PCR反应程序：95 ℃ 5 min、94 ℃ 50 s、59 ℃ 50 s、72 ℃ 90 s（Go To Step 2循环36次）、72 ℃ 10 min、4 ℃取出。电泳后选择合格条带，进行胶回收（大连宝生物工程有限公司Gel Extraction Mini Kit试剂盒），将回收产物与pMD19-T Vector（大连宝生物工程有限公司）载体连接。转化大肠杆菌（Eschrichia coli）感受态细胞DH5α，蓝白斑筛选后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。采用在线软件ProtParam、NovoPro分析目的基因蛋白的理化性质和一、二级结构；采用NetPhos 3.1和Signalp预测磷酸位点和信号肽跨膜区等。

1.3 系统进化树分析

使用NCBI在线网站CD Search确定目的基因保守结构域，筛选前50个具有相同保守结构域的基因，整理汇总Faste格式；使用软件MEGA 11对前50个同源蛋白进一步比对，输入Muscle命令，利用TBtools软件中 trimAL Wrapper进行修剪，采用最大似然法（bootsrap replications默认500）构建系统发育进化树，使用ITOL在线软件进行可视化展示。

1.4 启动子顺式作用元件分析

使用 Plant CARE 软件预测分析启动子顺式作用元件。

1.5 亚细胞定位分析

使用克隆得到的目的基因，用pCambia2301作为表达载体，设计表1中亚细胞定位载体引物，提取质粒（天根质粒提取试剂盒，反应见说明书），双酶切过夜，反应体系：质粒 8 µL、XBa I和Kpn I各1 µL、10倍M Buffer 3 µL和dd H₂O 7 µL。通过T4连接酶连接载体PBI-121-GFP，转化DH5α，筛选蓝白斑，PCR检测步骤同1.2。双酶切验证（XBa I和Kpn I），电泳筛选合适的质粒，制备LBA 4404农杆菌并活化，将重组质粒PBI-121-GFP-HgS5转入感受态农杆菌LBA 4404中，PCR验证同1.2。合适的菌液按1%添加进100 μg·mL^-1卡那霉素LBA培养基，每h测一次OD值，OD值为0.45~0.55时离心30 s，弃上清，制备农杆菌浸染液。注射转化烟草叶片，使用激光共聚焦扫描显微镜（蔡司ZEISS LSM 800 3D，德国）观察亚细胞定位。

1.6 遗传转化拟南芥

使用1.5中的方法将HgS5基因连接到pCambia2301载体上，构建重组载体pCambia2301-HgS5。双酶切体系：10 µL质粒DNA、Kpn I和BamH I各1 µL、3 µL 10×T和5 µL ddH₂O。双酶切验证（Kpn I和BamH I）后，转入农杆菌LBA4404，挑菌进行PCR验证，同1.2。检测合适的菌液制备农杆菌浸染液，用浸花法^［21］浸染刚抽薹的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株，间隔一周二次浸染，收获的种子消毒后培养于MS培养平板上（含40 mg·L^-1卡那霉素），长出真叶后用1.2的方法进行PCR鉴定，条带明亮清晰的为阳性植株，鉴定引物见表1。继续培养至收获单株种子T₂代。

1.7 组织特异性分析

在自然干旱0、3、6、9、12 d取样转基因和野生型拟南芥叶片和根系各0.5 g。用柱式法RNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA（具体步骤参考说明书），反转录cDNA进行荧光定量PCR（real-time PCR）检测，3次重复。qRT-PCR检测通过天根Super Real荧光定量预混试剂盒进行，体系与反应程序参考两步法。待扩增完成后绘制熔解曲线，基因相对表达量以2 ^－△△Ct 法计算 ^［22］。

1.8 干旱胁迫下转HgS5基因拟南芥发芽率测定

将消毒后的T₂代转基因与野生型拟南芥种子在MS培养平板上萌发，PEG（聚乙二醇polyethylene glycol）浓度设置：0%、5%、10%、15%和20%，在0、3、5、7和9 d采样，取3次重复，统计发芽率。

1.9 转HgS5基因拟南芥生理指标和土壤含水量测定

T₂代转基因拟南芥盆栽两周后进行自然干旱处理，第0、3、6、9和12天测定盆栽中拟南芥生理指标，同时测定土壤含水量（VM-210S便携式土壤水分仪，中国）。用氮蓝四唑光还原法测定SOD活性；用愈创木酚法测定POD活性；用紫外吸收法测定CAT活性^［23］，测定拟南芥样品根部的SOD、POD和CAT活性，设计3次重复。

1.10 数据处理

使用 Microsoft Excel 2017对试验数据进行统计并作图，利用SPSS 26进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 HgS5基因的克隆及生物信息学分析

本研究克隆得到目的基因HgS5，PCR扩增产物符合测序结果（图1A），HgS5基因序列的全长是1738个碱基对，编码370个氨基酸，其目的基因编码区（coding sequences，CDS）编码蛋白分子式为： C₁₇₄₉H₂₇₂₉N₄₇₃O₅₆₉S₁₆，相对分子质量为39999.70。不存在信号肽和跨膜区（图1B）；编码蛋白是酸性亲水性蛋白（图1C）；蛋白质的二、三级结构预测如图1D，E所示，含有64.05%无规则卷曲结构和1.62%的β-转角结构。

2.2 系统进化树分析

根据自展值可信度范围隐藏不足70的进化分支，对拥有相同保守结构域的盐生草HgS5基因和其他物种基因采用ML（bootsrap replications默认500）最大似然法构建系统发育树。通过构建聚类树展示同源性最高的前50个样本（图2），结果显示，HgS5基因与仙人掌科、巨人柱属中唯一的物种巨人柱（Carnegiea gigantea，KAJ8444719.1）同属一个分支，图中自展值为87，属于可信范围。此同源区间内还包括苋科苋属一年生草本植物苋菜（Amaranthus tricolor，XP_057531325.1）和甜菜（Beta vulgaris，XP_010668228.1），都具有一致的保守结构域A_thal_3526，该保守结构域有57个残基，大多数在蛋白质N端被发现，该结构域属于未表征的植物特异性结构域，功能未知，初步推测参与抗旱机制。

2.3 启动子顺式作用元件分析

盐生草HgS5基因启动子区域含有116个顺式作用元件（图3），除未命名和无功能的调控元件外，其转录因子都存在核心元件 TATA-box 和增强元件 CAAT-box，具备真核生物基因启动子的基本结构特征^［24］。目的HgS5基因内含与分生组织表达相关的元件CAT-box、赤霉素响应元件TATC-box和光响应元件G-box，其同时具有3个干旱诱导相关MYB结合位点MBS，推测该基因在抗旱性方面存在重要作用。

2.4 亚细胞定位分析

软件预测结果表明细胞核内无定位，推测主要在细胞膜上表达，为进一步验证亚细胞定位，将目的基因表达载体PBI121-GFP-HgS5转化烟草，使用空载体PBI121-GFP为对照，由图4可以看出绿色荧光蛋白在细胞膜表达，未见其他位置表达，明场通道显示细胞状态良好，符合预测结果。得出结论：HgS5基因定位在细胞膜。

2.5 HgS5基因遗传转化

利用目的基因从mRNA反转录而得到的DNA和表达载体pCambia2301，成功构建表达载体pCambia2301-HgS5（图5A），双酶切得到HgS5基因和质粒骨架（图5B）。转化农杆菌后浸花法浸染拟南芥，收获过表达拟南芥T₀代种子，平铺在卡那霉素MS抗性平板上，筛选后得到10株T₁代阳性转化株，将抗性苗移栽长大后进行PCR阳性鉴定，选取条带清晰明亮的单株（图5C）继续种植，用相同的方法筛选T₂代过表达植株。

2.6 HgS5基因组织特异性分析

利用qRT-PCR方法分析， WT和过表达HgS5基因拟南芥（over expression of HgS5 gene，OE）株系的叶片和根系在0、3、6、9和12 d自然干旱胁迫下HgS5基因的相对表达量（图6）。结果表明，干旱胁迫处理下，目的基因在根系中的表达量整体高于叶片，具有组织特异性。随着干旱时间的延长，两个部位的表达量均在第6 天达到峰值，此时根系和叶片的相对表达量分别是0 d的22.75和20.62倍。

2.7 功能验证

2.7.1 干旱胁迫下的萌发分析

由图7可知，在第3天无论是野生型（WT）还是过表达型（OE），在未经特殊处理的情况下均开始发芽。然而，当PEG处理浓度20%时，两者均未能成功发芽。第5天在PEG处理浓度为0和5%的条件下，WT和OE的发芽情况几乎无差异；但在10%~20%的PEG浓度下，情况开始发生变化，OE的发芽数量显著增加（P<0.05），这一差异在15%的PEG浓度下达到峰值。当处理时间延长至7 d时，在20%PEG浓度下，OE的发芽率达到了63.33%，而WT的发芽率仅为98.89%，这一差异达到了显著水平（P<0.05）。其他浓度下的差异则相对不明显。经过9 d的处理后，在20%PEG浓度下，OE的发芽率相较于WT高出了21.00%，这一显著差异再次证明了OE的抗旱性更强（P<0.05）。综上所述，在干旱胁迫的条件下，OE的发芽率普遍高于WT，并且随着干旱程度的增加，OE表现出更强的抗旱能力。目的基因HgS5的过表达确实能够增强拟南芥在干旱处理下的发芽能力，从而证明了该基因具有显著的抗旱能力。

2.7.2 转HgS5基因拟南芥耐旱性表型鉴定

经测定初始土壤含水量，WT为50.82%，OE为50.82%（表2），处理3 d时WT土壤含水量为44.50%，OE为44.44%，WT抗旱性与HgS5保持一致；处理第6天，WT土壤含水量减少约14%，OE土壤含水量同样减少约14%，WT植株叶片开始蜷缩，OE株系未发生明显变化，表明OE抗性更强；处理9 d，土壤含水量继续下降约23%，WT已经呈严重缺水，部分叶片出现坏死，转基因拟南芥叶片仍保持活跃状态；处理第12天时，土壤含水量下降至5%左右，WT完全死亡，OE组叶片萎缩但仍保持生命活动，由此得出，T₂代转基因拟南芥植株具有更强抗旱性（图8）。

2.7.3 转HgS5基因拟南芥干旱生理指标分析

处理当天，WT和OE根系中SOD活性基本一致；处理3 d后发生变化，变化幅度较弱；处理6 d，WT的SOD活性达到峰值，OE中SOD活性还在持续增加；处理9 d，WT中SOD活性急剧减少至35.67 U·g^-1 FW，OE的SOD活性达到最大值，差异显著（P<0.05）；处理12 d，WT中SOD活性降至最低点12.67 U·g^-1 FW，小于初始值，OE中SOD活性虽然是下降趋势，但测定数值47.00 U·g^-1FW仍高于初始值（图9）。

处理3 d，WT中POD活性每min从24.00 ΔOD₄₇₀·g^-1 FW上升到40.50 ΔOD₄₇₀·g^-1 FW，对比OE上升趋势明显；处理第6天时，两者体内POD活性均达到最高点；处理第9天，WT中POD活性开始减少，而OE仍为74.17 ΔOD₄₇₀·g^-1 FW·min^-1，与3 d前保持一致；在处理的第12天，OE体内的POD活性高于WT（P<0.05）。

CAT活性在根系中整体变化趋势为先增加后减少，但在野生型和OE中增幅不同。干旱胁迫处理的第3~9天，OE体内CAT活性整体低于WT，并在第6天达到显著水平（P<0.05），处理的第6天，OE和WT体内的CAT活性均达到最高，分别是215.00和391.33 g FW·min^-1；在处理的第9和12天，OE根系内的CAT活性均高于WT，差异显著（P<0.05）。

3 讨论

盐逆境通过影响植物体内的离子平衡、造成水分胁迫、增加活性氧自由基的产生、调节资源分配以及渗透调节等方式，产生大量的活性氧自由基伤害细胞膜，间接引发细胞失水，从而产生内部干旱胁迫^［25-26］。这种交互作用使得植物在遭受盐胁迫时，也面临着干旱胁迫的挑战。盐生草作为西北盐碱地改良的代表植物之一，关于其形态特征及生理生化特性的研究已趋于完善，但对于相关抗旱基因的发掘尚显单调，新基因的挖掘工作仍存在着较大的空白领域。通过转录组数据筛选盐生草HgS5基因，其在盐胁迫下基因表达量差异最大，为了进一步研究HgS5基因抵御干旱的能力，对其进行克隆，利用分子生物技术探究了盐生草的耐旱分子机制，并通过软件分析，初步了解其结构特征；其编码蛋白属于酸性、亲水性蛋白；相较于稳定的α螺旋和β转角结构，分析其二级结构无规则卷曲占比最多，属于不稳定蛋白，且没有信号肽和跨膜区；亚细胞软件预测细胞核内无定位，烟草叶片亚细胞定位试验中，在激光共聚焦显微镜下观察到了明显的细胞膜定位，符合分析软件结果，预测HgS5基因在细胞膜具有清除活性氧自由基的可能性。

启动子逆境胁迫响应顺式作用元件通过与转录因子结合调控靶基因转录表达，植物体内渗透胁迫发生时，跨膜蛋白感受胁迫会氧化猝发双组分系统，Ca²⁺、IP₃（肌醇三磷酸inositol 1，4，5-trisphosphate）和CDPK（钙依赖性蛋白激酶calcium-dependent protein kinase）会在MAPK（丝裂原活化蛋白激酶mitogen-activated protein kinase）信号通路收到脱落酸（abscisic acid，ABA）途径作用信号，进而引发相关抗逆基因的表达，如MYB/MYC的干旱响应调控途径^［27］。目前在苜蓿（Medicago sativa）中MvDREB1基因存在启动子DRE元件，推测在干旱逆境中结合转录因子，影响下游基因表达^［28］。系统进化树分析得出HgS5基因与巨人柱、苋菜和甜菜等抗旱植物的同源基因具有相同保守结构域A_thal_3526，该结构尚未表征功能，初步推测参与抗旱性调控。HgS5基因的保守结构域结合预测到的特异性干旱响应顺式元件MYB，进一步说明HgS5基因在应对干旱胁迫中具有重要作用。

研究表明，植物抵御干旱的方法之一是调节自身形态变化^［29］，其中根部的变化对其生长发育具有重大意义。陈倩等^［30］通过对不同时间不同浓度盐胁迫下的盐生草叶片和根系进行检测发现，盐生草HgWRKYs家族的基因表达量会随着胁迫加深而随之变化。本研究采集了自然干旱胁迫下的盐生草叶片和根系，进行实时荧光定量PCR检测组织特异性表达，发现在不同时期（0、3、6、9、12 d），目的基因在根系中表达量均高于叶片，作为水分吸收最敏感的部位，植物的根部变化与干旱程度呈正相关，符合前人研究；处理第6天时达到显著差异水平（P<0.05），表明此时HgS5基因在干旱条件下的调控作用尤为显著，并且在盐生草根部发挥主要作用，具有组织特异性。这一发现进一步验证了HgS5基因能够增强植物抗旱能力，但具体作用机制仍需更深入研究。

干旱胁迫会诱发植物氧化应激反应，进而产生大量的活性氧（reactive oxygen species， ROS），次级代谢物主要清除ROS，以保护植物细胞免受脂质过氧化影响，并在其他防御相关活动中发挥重要作用^［31］。本试验遗传转化表明，T₂代转基因拟南芥对比野生型拟南芥，表型萎蔫程度更轻，其抗旱性明显增强。在酶活性的研究中，植物的抗逆性体现在对于造成细胞氧化损伤的清除能力^［32］，为消除因干旱在植物体内积累的大量自由基，植物会迅速提升3种关键酶的活性（SOD、CAT和POD）。但是，当胁迫条件变得更为严峻时，植物中的其他代谢过程将逐渐减弱，而这3种酶的活性也会随之下降，下降幅度变化略有差异^［33］。在本研究中，随着干旱处理天数的增加，拟南芥根系中3种氧化还原酶活性均先增加后减少，符合前人研究结论^［34-35］。使用PEG模拟干旱处理的后期，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥发芽率远高于前者，同时长出真叶的植株在遭受干旱胁迫时表现出了更低的受害程度；在SOD、CAT、POD活性变化中，OE整体变化时间晚于WT，且第12 天三者含量均高于WT，说明初期OE受到干旱抑制的程度优于WT，后期OE酶活性更高，证明HgS5转基因拟南芥抗旱性增强；综上所述，说明HgS5基因能增强植物耐旱性，为盐生草根系基因在抗旱研究方向提供了理论基础和事实依据。

4 结论

本研究从盐生草盐胁迫转录组数据中筛选出候选HgS5基因，对其生物信息学进行初步分析得出：该编码蛋白为酸性亲水性蛋白，不存在跨膜区，存在38个磷酸化位点，亚细胞定位在细胞膜；系统发育树表明同源基因出现在巨人柱和苋菜等相关物种，具有相同保守结构域A_thal_3526，初步推测该蛋白家族参与干旱胁迫；具特异性干旱响应顺式作用元件MYB，初步推测HgS5基因具抗旱性功能。用qPCR验证候选基因的组织特异性，发现HgS5基因主要在根系表达；遗传转化拟南芥，并检测相关氧化还原酶活性，转基因拟南芥在处理后期酶活性均优于野生型。本研究初步探究了盐生草HgS5基因在干旱胁迫应答过程中的功能，可为进一步挖掘耐旱植物干旱响应功能基因提供理论基础。

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基金资助

甘肃省优秀研究生“创新之星”项目(2022CXZXS-020)

国家自然科学基金项目(31960072)

国家自然科学基金项目(32001514)

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目(CARS-05-04B-2)

甘肃省教育厅：产业支撑计划项目(2021CYZC-12)

甘肃省青年基金项目(22JR5A880)

甘肃省自然基金项目(20JR10RA507)

甘肃农业大学伏羲青年英才计划(Ganfx-04Y11)

甘肃农业大学伏羲青年英才计划(Ganfx-03Y06)

甘肃农业大学国家级大学生创新创业训练计划重点支持领域项目(202110733001)