紫花苜蓿GLK基因家族鉴定及渗透胁迫下的表达分析

Genome-wide identification of the GLK gene family in alfalfa and their transcript profiles under osmotic stress

摘要

GLK （Golden2-like或G2-like）属于GARP超家族，是植物生长发育过程中的重要转录因子，在调节植物叶绿体发育、叶绿素生物合成和非生物胁迫响应等方面发挥着重要作用。目前，GLK基因家族成员已在多个物种中被系统鉴定，但在四倍体紫花苜蓿全基因组水平上仍然知之甚少。利用生物信息学的方法，在“新疆大叶”紫花苜蓿基因组中鉴定到100个GLK基因（MsGLKs），并对其理化性质、染色体定位、系统进化关系、启动子顺式作用元件以及渗透胁迫和外源脱落酸（ABA）处理下的表达模式进行了分析。结果显示，100个MsGLK基因在32条染色体上不均匀分布，蛋白序列长度为201~860个氨基酸。根据系统发育分析结果，将MsGLK家族成员分为13个组。共线性分析表明，在紫花苜蓿基因组中共发现193个MsGLK基因重复事件，基因非同义替代数/同义替代数（Ka/Ks）分析显示，大部分重复基因对经历了纯化选择。MsGLK基因启动子的顺式作用元件广泛参与了植物生长发育、激素响应和胁迫反应。基因表达数据显示，12个基因的表达具有组织特异性，25个基因在所有组织中表达。RT-qPCR检测发现，MsGLK基因在干旱胁迫、盐胁迫和外源ABA处理下均有一定程度的响应。研究结果将为进一步探索 MsGLK基因的功能和紫花苜蓿抗逆性遗传改良提供参考。

Abstract

GLK （Golden2-like or G2-like） transcription factors belong to the GARP superfamily， whose members play crucial roles in plant growth and development. Members of the GLK gene family play important roles in regulating plant chloroplast development， chlorophyll biosynthesis， and the abiotic stress response. The GLK gene family has been systematically identified in many plant species， but not yet in tetraploid alfalfa （Medicago sativa）. In this study， we used bioinformatics methods to identify 100 GLK genes （MsGLKs） in the genome of the alfalfa cultivar “Xinjiang Daye”. Further analyses were conducted to explore the physicochemical properties of their putative encoded products， chromosome localization， phylogenetic relationships， cis-acting elements in their promoter regions， and transcript profiles under osmotic stress and exogenous abscisic acid （ABA） treatment. The results showed that the 100 MsGLK genes were unevenly distributed on the 32 chromosomes， and encoded polypeptides with sequence lengths ranging from 201 to 860 amino acids. In a phylogenetic analysis， the MsGLK family members were divided into 13 groups. A collinearity analysis detected 193 MsGLK gene duplicates in the alfalfa genome， and a analysis of the ratio of the number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site to the number of synonymous substitutions per synonymous site （Ka/Ks） revealed that most of the duplicated gene pairs have undergone purification selection. A range of cis-acting elements were detected in MsGLK gene promoter regions， and were involved in plant growth and development， hormone responses， and stress responses. Analyses of gene transcript profiles revealed that 12 MsGLKs showed tissue-specific expression patterns， and 25 MsGLKs were expressed in all tissues. Further RT-qPCR analyses revealed that some MsGLK genes were activated to some degree in response to drought stress， salt stress， and exogenous ABA treatment. The results of this study provide reference information for further research on the function of MsGLK genes and for the genetic improvement of stress resistance in alfalfa.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / GLK基因 / 生物信息学 / 渗透胁迫 / 表达模式

Key words

alfalfa / GLK gene / bioinformatics / osmotic stress / expression patterns

转录因子（transcription factors， TFs）是指能够与特定DNA序列结合并对基因的转录有激活或抑制作用的蛋白质，在信号转导和基因表达调控中起着至关重要的作用^［1］。作为发育过程和应激反应的重要调节因子，TFs通过调节下游胁迫响应基因的时空表达模式，在多种非生物胁迫反应中扮演着重要的角色^［2］。GLK属于GARP（Golden2、ARR-B、Psr1）超家族，在陆地植物中广泛存在，是植物生长发育中的重要转录因子^［3］。GLK基因在GARP家族中是单系的，基因复制在单子叶和双子叶植物中独立发生^［4］。典型的GLK蛋白通常包括两个高保守性区域，分别为Myb-DNA结合结构域（Myb-DNA binding domain， DBD）和位于C端的GLK/C-terminalbox（GCT-box）^［5］。

GLK转录因子与植物叶绿体形成与发育、叶绿素生物合成密切相关^［6］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和小立碗藓（Physcomitrella patens）中，GLK1和GLK2基因以成对形式冗余地参与叶绿体的形成^［7］。拟南芥glk1/2双突变体表现为淡绿色，叶肉细胞叶绿体发育不良，类囊体膜稀少，基粒堆叠缺陷，叶绿素合成和光捕获相关的基因表达水平降低^［8］。而在玉米（Zea mays）和高粱（Sorghum bicolor）中，GLK基因存在组织表达特异性，即GLK1和 GLK2分别在维管束鞘（bundle sheath， BS）细胞和叶肉（mesophyll， M）细胞中表达，推测可能与部分C₄植物叶绿体发育特性相关^［9］。茶树（Camellia sinensis）CsGLKs能参与紫外线-B（UV-B）介导的叶绿素合成和类黄酮积累的调节^［10］。大量研究发现，GLKs可以与叶绿体光合电子传递链中的核编码基因（PhANGs）结合，特别是光系统Ⅰ和Ⅱ以及叶绿素生物合成途径中的基因^［11］。除叶片外，GLKs也影响着果实和部分非绿色组织中的叶绿体发育。在番茄（Solanum lycopersicum）中，过量表达SlGLK1和SlGLK2能够使未成熟果实中叶绿体数量和叶绿素含量增加，并且与CsGLKs类似，SlGLK2可以在UV-B的辐射下通过诱导SlUVB8从而促进果实叶绿体的发育^［12-13］。在水稻（Oryza sativa）中的研究发现，OsGLK1的异位表达可以诱导非绿色组织中叶绿体的产生^［14］。

GLK转录因子也可以通过优化不同生物和非生物环境胁迫条件下的光合作用，参与多种应激反应和抗病过程^［15］。AtGLK1被证明能够增加拟南芥对禾谷镰刀菌的非宿主抗性，并参与对黄瓜（Cucumis sativus）花叶病毒感染的防御过程^［16-17］。AhGLK1b的异位表达可以增强植物对真菌和细菌病原体以及其他环境压力的抗性^［18］。马铃薯（Solanum tuberosum）病毒X（PVX）激活的细胞内免疫受体Rx1与NbGlk1相互作用，介导烟草（Nicotiana benthamiana）的抗病毒活性^［19］。另外，在干旱和低温胁迫下，过量表达GhGLK1拟南芥植株对两种胁迫的抗性增加，而GhGLK1基因敲除的陆地棉（Gossypium hirsutum）植株抗旱性和抗寒性均降低^［20］。AhGLK1还可通过调节叶绿素合成，间接影响花生（Arachis hypogaea）在干旱后的恢复过程^［21］。而在耐霜转基因甘蓝型油菜（Brassica napus）中，GLK1的积累参与了植物的冷驯化过程^［22］。莲藕（Nelumbo nucifera）的研究显示，GLK1和多酚氧化酶基因PPO1在非生物胁迫的响应中存在互作效应^［23］。此外，GLK基因也参与了脱落酸（abscisic acid， ABA）的信号通路。拟南芥glk1/2双突变体在种子萌发和幼苗发育阶段对ABA 敏感性增加，在幼苗时期表现出渗透胁迫抗性；GLK1/2与WRKY40能够进行特异性结合，在ABA信号转导中起负调控作用，有助于提高植物在非生物胁迫下的适应性^［24］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上最重要、经济价值最高的饲料作物之一，具有粗蛋白含量高、营养成分丰富、适口性好、适应性强等特点^［25］。干旱和盐分是威胁牧草生长发育的重要非生物胁迫因子，制约着牧草产业和草食畜牧业的快速发展^［26］。截止目前，GLK转录因子已在玉米^［22］、小麦（Triticum aestivum）^［27］、番茄^［28］、谷子（Setaria italica）^［29］、大豆（Glycine max）^［30］、烟草^［31］等植物中进行了相关鉴定，但在紫花苜蓿中未见报道。对于GLK转录因子的研究目前多集中在植物光合功能方面，对于其在非生物胁迫尤其是渗透胁迫相关的研究相对较少。本研究利用生物信息学的方法，对四倍体紫花苜蓿基因组中GLK基因家族进行鉴定和表征，在此基础上利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， RT-qPCR）技术，分析该基因家族成员在紫花苜蓿特定生长阶段中响应干旱、盐、ABA等非生物胁迫下的表达模式，为进一步研究紫花苜蓿GLK基因家族生物功能提供理论依据，并期望在此基础上为紫花苜蓿种质的改良提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 紫花苜蓿GLK基因家族成员的鉴定

本研究使用的拟南芥GLK基因家族的蛋白质序列下载自拟南芥信息资源数据库（the arabidopsis information resource，TAIR，https：//www.arabidopsis. org/）。紫花苜蓿（新疆大叶）的全基因组文件、蛋白序列和基因组注释文件由figshare数据库（https：//figshare.com/articles/dataset/genome_fasta_sequence_and_annotation_files/12327602）取得。GLK蛋白的保守结构域（PF00249）文件从Pfam数据库（http//pfam.xfam.org/）下载得到^［32］。以拟南芥的GLK蛋白序列作为查询序列，通过TBtools v 2.010的Blastp功能在紫花苜蓿蛋白数据库中进行比对，并利用HMMER 3.0软件的hmmsearch命令鉴定紫花苜蓿GLK蛋白序列，设置E-value<1e^-10。将两种方法获得的结果取并集，使用NCBI的CDD工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行结构域验证，保留含有完整GLK特征结构域的序列。

1.2 紫花苜蓿GLK家族成员蛋白理化性质、亚细胞定位及染色体定位

利用TBtools的Protein Paramter功能分析候选蛋白序列的长度、分子量、等电点等信息^［33］。通过WoLF PSORT网站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）预测紫花苜蓿GLK蛋白的亚细胞定位。基于紫花苜蓿的基因组和注释文件，通过TBtools获得GLK基因的染色体分布及其位置图谱。根据染色体定位信息将筛选出的基因命名为MsGLK1~MsGLK100。

1.3 紫花苜蓿GLK家族成员系统发育分析、基因结构和基序分析

使用MEGA 11软件，利用MUSCLE将紫花苜蓿和拟南芥的全部GLK蛋白序列进行多序列比对，采用邻接法（neighbor-joining， NJ）构建系统发育树，设置重复值（bootstrap replications）为1000次^［34］。在MEME工具（https：//meme-suite.org/meme /index.html）中分析保守基序，最大基序数设为10，最佳基序宽度为10~50。从紫花苜蓿gff3注释文件中获得基因结构信息。利用TBtools的Gene Structure View功能将上述信息进行综合可视化。

1.4 紫花苜蓿GLK基因启动子顺式作用元件分析

从紫花苜蓿gff3注释文件中提取目标基因编码区（coding sequence， CDS）上游2000 bp的推定启动子序列，提交PlantCare网站（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/）进行启动子顺式作用元件预测。利用TBtools对顺式作用元件的数量及分布进行可视化显示。

1.5 紫花苜蓿GLK基因重复事件和共线性分析

通过TBtools的MCScanX插件分析紫花苜蓿GLK基因重复事件，对共线性分析结果进行可视化处理。利用TBtools的Ka/Ks Calcular功能计算非同义替代数（number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site， Ka）和同义替代数（number of synonymous substitutions per synonymous site， Ks）及其比值，过滤无效数据，推断基因进化过程中的选择模式。

1.6 紫花苜蓿GLK基因在不同组织的表达模式分析

从NCBI数据库下载到紫花苜蓿花、叶、根、根瘤、短茎、伸长茎6个组织中的转录组数据（SRP055547），以及干旱胁迫、盐胁迫和外源ABA处理下MsGLK基因的转录组学数据（SRR7091780-SRR7091794和SRR7160313-SRR7160357）^［35］，利用Hisat2建立基因组索引，将clean reads对比到参考基因组上，获得用于估计基因表达量的每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本TPM（transcripts per kilobase per million）值，使用TBtools对数据进行归一化处理，并绘制热图。

1.7 紫花苜蓿GLK基因在渗透胁迫和外源ABA处理下的RT-qPCR分析

试验选用新疆大叶紫花苜蓿种子，于2023年10月底在河南科技大学农学院分子生物学实验室开展。挑选大小均匀、饱满完整的种子，选择营养土作为培养基质，放置于22 ℃，光照16 h黑暗8 h的培养箱中进行盆栽培养。对培养5周后的幼苗分别用30%的PEG-6000、300 mmol·L^-1的NaCl和100 μmol·L^-1的ABA进行处理，分别在处理1、3、6、12、24、48 h对幼苗的根组织进行取样。以正常条件下幼苗作为对照，每个处理重复3次。取得的样品用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

利用TRIZOL （TaKaRa， 9108Q）试剂提取总RNA，利用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa， RR036）反转录获得cDNA。使用Primer 5.0设计引物，选择MsActin（AA660796）作为内参基因^［36］。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。RT-qPCR分析在CFX96 Touch Real-time PCR Detection System （Bio-Rad， Hercules， CA， 美国）进行，反应体系参考2×Ultra SYBR Green qPCR Mix （CISTRO，广州）试剂盒说明书，基因相对表达水平由2 ^-ΔΔCt方法计算^［37］。

1.8 数据处理

使用Excel 2021进行基因表达量数据的计算，利用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，绘图采用Excel 2021和Adobe Illustrator 2024。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿GLK基因家族成员的鉴定与染色体定位

通过HMM和Blast检索，从“新疆大叶”紫花苜蓿基因组中共鉴定到GLK基因100个。“新疆大叶”紫花苜蓿为同源四倍体，具有32条染色体。染色体定位分析结果表明，这100个基因中有 3个基因未能定位到染色体上，剩余97个基因在32条染色体上不均匀分布（图1）。根据MsGLK基因在染色体上的分布顺序，将97个基因命名为MsGLK1~MsGLK97，未能定位到染色体上的3个基因命名为MsGLK98~MsGLK100。每条染色体上MsGLK家族成员的数量从1~7个不等，其中chr2.4染色体上有7个家族成员，分布数量最多，其次为chr2.1、chr2.2、chr2.3、chr7.1、chr7.2和chr7.3染色体，各有6个家族成员，而chr3.1、chr4.2、chr4.3、chr4.4、chr5.2、chr6.2、chr6.3和chr6.4染色体仅有1个家族成员。此外，MsGLK基因中存在一个串联重复基因对：MsGLK94和MsGLK95，位于chr8.4染色体。

2.2 紫花苜蓿GLK基因家族成员的理化性质分析

MsGLK蛋白相对较小，序列长度为201（MsGLK9）~860（MsGLK17）个氨基酸，对应的蛋白质分子量（molecular weight）为23.51~94.37 kDa。蛋白质的理论等电点（theoretical isoelectric point， pI）为4.73（MsGLK1）~9.78（MsGLK79），其中酸性蛋白质与碱性蛋白质数量大致相等，可见MsGLK蛋白质的酸碱分布相对均匀。此外，亚细胞定位的预测结果显示，2个MsGLK蛋白位于细胞质中，4个位于叶绿体中，剩余94个均定位于细胞核中（表2）。

2.3 紫花苜蓿GLK基因家族成员的系统发育分析、基因结构和基序分析

为进一步探究GLK家族的进化关系，基于来自拟南芥^［38］与紫花苜蓿的GLK蛋白序列构建NJ系统发育树（图2）。根据进化关系和基序分析，将GLK家族成员分为13个组，同一亚组的成员亲缘关系相近，并具有相似的结构。各组成员数量不等，最大组为第Ⅴ组，含有18个MsGLK蛋白和11个AtGLK蛋白，最小组为第Ⅵ组和Ⅺ组，第Ⅵ组含有4个MsGLK蛋白，而第Ⅺ组含有3个MsGLK蛋白和1个AtGLK蛋白，表明其在进化过程中经历了动态变化。MsGLK蛋白在所有亚组中皆有分布，AtGLK蛋白仅在第Ⅵ组中未有分布，表明该组成员可能具有物种特异性。

根据MsGLK蛋白序列单独构建NJ系统发育树，这些蛋白也被分为13个亚组（图3）。通过在线工具MEME预测了MsGLK蛋白的保守基序，共鉴定了10个潜在的基序（基序1~基序10），长度为28~50个氨基酸。基序1存在于所有蛋白中，而基序2仅在MsGLK84和MsGLK67中未被鉴定到，说明两个基序在MsGLK蛋白中高度保守。通过NCBI的CD检索工具对基序 1、2进行注释，发现二者覆盖了GLK基因特异性基序Myb-SHLQKYF。除上述2个保守结构域外，还观察到第Ⅵ~Ⅷ组蛋白均存在基序3，该基序被注释为Myb-CC-LHEQLE，被认为参与磷酸盐饥饿信号等多种胁迫的信号传导^［39］。同一亚组内的基序组成相近，表明这些蛋白功能具有相似性，而不同组间基序的差异则揭示了MsGLK蛋白功能的多样性。

基因结构分析表明，MsGLK基因的外显子数量从1~17个不等，内含子数量为0~16个，其中MsGLK64、MsGLK70和MsGLK77不含内含子。不同组间的基因结构存在差异，内含子数量差别较大，第Ⅱ、Ⅲ组90%的成员含有4个内含子，第Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和ⅩⅢ组的大部分成员含有5个内含子，第Ⅸ组成员均具有6个内含子，第Ⅵ组的4个基因中2个含有5个内含子，2个含有6个内含子，而分别含有7~16个和0~5个内含子。内含子的变异可能在MsGLK基因功能多样性的进化过程中起着关键作用^［40］。

2.4 紫花苜蓿GLK基因家族成员的启动子顺式作用元件分析

利用PlantCare在线工具分析了起始密码子上游2000 bp区域的顺式作用元件，预测了与植物生长发育、激素响应和胁迫反应相关的13类作用元件（图4）。在所有作用元件中，与光响应相关的作用元件数量最多，种类最丰富，在所有基因中均有分布，表明光可能是调节MsGLK基因表达的重要因素。激素响应类元件数量仅次于光响应作用元件，包括生长素响应元件（TGA-element、AuxRE、AuxRR-core）、赤霉素响应元件（TATC-box、GARE-motif、P-box）、脱落酸响应元件（abscisic acid responsive element，ABRE）、茉莉酸响应元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）和水杨酸响应元件（TCA-element），每个基因至少含有一个激素响应元件。胁迫响应元件有4类，分别为干旱响应元件（MBS）、低温响应元件（low temperature responsive element，LTR）、厌氧诱导调控元件（anaerobic induction responsive element，ARE）和应激防御反应调控元件（TC-rich repeats），其中LTR元件被认为同时参与盐胁迫反应的调控^［41］。69个MsGLK基因中至少含有3个胁迫响应元件，推测MsGLKs能够在胁迫的响应中起到积极作用。此外，本研究还鉴定到参与细胞周期调节（MSA-like）、昼夜节律（circadian）和类黄酮生物合成基因调控（MBSI）的顺式作用元件。

2.5 紫花苜蓿GLK基因家族成员的共线性分析

为了解MsGLKs基因的复制事件，利用MCScanX工具进行了共线性分析。在紫花苜蓿基因组中共发现193个MsGLK基因家族的片段重复事件，涉及88个MsGLK基因，有2个MsGLK基因（MsGLK94和MsGLK95）同时涉及片段重复事件和串联重复事件（图5）。这些结果表明，片段重复事件在MsGLK基因中广泛发生，可能在紫花苜蓿GLK基因家族的扩增中起着重要作用。此外，为研究MsGLK基因在进化中受到的选择压力，计算了涉及重复事件基因的Ka（每个非同义位点的碱基替换数）和Ks（每个同义位点的碱基替换数）值。共线性基因对中2对基因（MsGLK45和MsGLK48；MsGLK66和MsGLK72）的Ka/Ks大于1，表明其在进化过程中经历了正向选择，其余基因对的Ka/Ks均小于1，在进化过程中经历了纯化选择。

2.6 紫花苜蓿GLK基因家族成员的组织表达模式分析

为了解MsGLKs基因在不同组织中的表达模式，通过公共数据库的转录组数据分析，获得了紫花苜蓿6个不同器官，包括：花、叶、根、根瘤、短茎、伸长茎的表达量数据。100个MsGLKs基因中，有12个未在上述6种组织中表达，推测这些基因可能在其他组织中表达，或在某些胁迫条件下特异性表达（图6）。其余88个基因在不同的组织中具有不同的表达丰度，部分基因的表达呈组织特异性。12个MsGLKs基因仅在1个组织中表达，其中8个基因（如MsGLK15和MsGLK21）仅在根中表达。5个基因在2种组织中表达，如MsGLK51只在根和短茎中表达；18个基因在3种组织中表达，如MsGLK31在叶、短茎和伸长茎中表达；14个基因在4种组织中表达，如MsGLK7在根、伸长茎、花和根瘤中表达；8个基因在5种组织中表达，如MsGLK13、MsGLK19和MsGLK25均在除根以外的组织中表达，且在叶中的表达量明显高于其他组织。在6种组织中均有表达的基因数量最多，为25个；其中部分基因的组织表达差异明显，如MsGLK74在叶中的表达量显著高于其他组织。这些结果显示，不同MsGLKs基因在不同部位和不同时期参与紫花苜蓿生长发育的调控，并发挥着不同的功能。

通过分析紫花苜蓿RNA-Seq数据，得到MsGLKs在外源ABA、甘露醇、盐胁迫处理下的表达模式（图7）。在100个基因中，ABA处理下表达水平发生显著变化的有31个，响应甘露醇和盐胁迫的分别有16和14个。MsGLK2、MsGLK5、MsGLK7、MsGLK29、MsGLK36、MsGLK62、MsGLK65、MsGLK68、MsGLK75和MsGLK77在3种处理下表达丰度均有变化。外源ABA处理下，观察到MsGLKs的表达水平形成两个不同的簇：一组中6个基因表达量先下调后上调，8个基因表达量先上调后下调；另一组10个基因表达量先上调后下调，6个基因的表达水平在3~12 h急剧升高。甘露醇处理下，7个基因表达量波动后持续降低；4个基因表达量持续升高，12 h达到最高；5个基因在1~12 h表达量剧增。在盐胁迫下，MsGLK基因的表达水平也聚为2类，一个聚类的8个基因中3个于3 h表达量达到峰值，其余在24 h达到峰值；另一聚类6个基因在不同时间点表达量降低。

2.7 紫花苜蓿部分GLK基因在渗透胁迫和外源ABA处理下的表达模式分析

为探究MsGLK基因对干旱、盐胁迫和外源ABA的响应情况，根据组织表达量、启动子顺式元件分布和非生物胁迫下的转录组学分析结果，选取9个MsGLK基因进行了RT-qPCR表达分析（图8）。结果表明，外源ABA处理下，MsGLK10、MsGLK17、MsGLK29、MsGLK33、MsGLK62和MsGLK75表达水平随处理时间增加呈先增高后降低的趋势，MsGLK62和MsGLK75在12 h达到峰值；与CK相比，其余基因均在3 h表达显著上调，其中MsGLK17上调最明显，表达量是CK的6.5倍（P<0.05）。MsGLK36从0~24 h下调表达，在48 h显著升高，表达量是CK的6.8倍（P<0.05）；MsGLK83在1 h上调，3~48 h下调表达。MsGLK65在1 h上调，随后表达水平降低，仅在12 h呈上调表达。

在干旱胁迫下，与CK相比，MsGLK10、MsGLK33、MsGLK65和MsGLK83在处理1 h时相对CK表达量显著上调且达到峰值，随后降低。MsGLK36在处理1 h后表达量持续下调，在24 h开始升高，直至48 h时表达量达到最高。该变化趋势与图7中结果存在一定差异，推测与试验样本来源和处理方式不同有关。MsGLK62和MsGLK75在处理1 h后表达量逐渐上升，并在24 h时达到最高水平。

与CK相比，在盐胁迫下，MsGLK10、MsGLK33、MsGLK65和MsGLK83的表达水平在1 h显著上调（P<0.05），除MsGLK33外随时间延长呈下降-升高，随后下降再升高趋势，且达到峰值的时间各不相同。其中MsGLK33对于盐胁迫的响应更为强烈，在所有时期均显著上调（P<0.05）。MsGLK29和MsGLK36在处理1 h后表达量下调，而后随时间增加逐渐升高，在48 h达到最高水平，呈显著上调表达趋势（P<0.05）。MsGLK62和MsGLK75随处理时间增长表达水平先升高再降低，在24 h时达到峰值，与转录组数据分析结果相似。

3 讨论

GLK是一类植物特异性转录因子，主要参与植物叶绿体形成发育、叶绿素生物合成的正向调控，同时也被证实能够提高作物产量和果实品质，提高植物对于生物和非生物胁迫的抗性^［15］。已有研究表明，不同植物的GLK基因家族成员数量存在较大差异，例如，在甜橙（Citrus sinensis）中鉴定到27个GLK成员^［40］，玉米中鉴定到59个成员^［22］，小麦中鉴定到87个^［27］，烟草中89个^［31］，大豆130个^［30］，陆地棉146个^［32］。本研究在同源四倍体“新疆大叶”紫花苜蓿基因组中鉴定到100个MsGLK基因，少于同源四倍体大豆的130个和异源四倍体陆地棉的146个，但多于异源四倍体烟草的89个。据观察，本研究使用的紫花苜蓿参考基因组大小为3.15 Gb，大于陆地棉（2.3 Gb）和大豆（978.4 Mb），小于烟草基因组（4.5 Gb）。据此可以认为GLK家族成员的数量与基因组大小基本没有相关性。不同物种中GLK数量的多样性可能与基因在进化过程中特异性的重复与丢失有关。有研究指出，谱系特异性扩展（lineage-specific expansion， LSE）是导致物种间基因家族数量差异较大的因素之一^［42］。

多基因家族通常由基因复制产生^［43］。早期研究指出，祖先陆地植物很可能只具有单个GLK基因，大多数含有多个GLK基因的物种基因组经历了全基因组复制^［9］。基因复制对于新功能的出现和分化至关重要，GLK基因的复制扩增能够引起其亚功能化和在C₄植物二态叶绿体中功能特异性的出现^［9，44］。片段复制和串联复制则是基因家族的进化扩增中的重要动力^［43］。既往大多数物种的GLK基因家族鉴定表明，片段复制在该家族的扩增中起到了重要作用。小麦87个GLK基因中74个基因涉及片段复制事件，6个基因涉及串联复制事件^［27］。关于大豆的研究中，73.07%的GmGLK基因参与片段复制事件，仅有一对参与串联复制事件^［30］。而烟草中观察到12对NtGLK片段重复基因对，未观察到串联重复基因对^［31］。本研究中，在紫花苜蓿基因组中共发现88个MsGLK基因参与的192个片段复制事件，仅有2个MsGLK基因参与一个串联复制事件，与前人研究结果一致。有研究认为，片段复制事件经常发生在进化缓慢的基因组中，推测MsGLK基因在进化过程中保守性较强^［22］。绝大多数MsGLK重复基因对的Ka/Ks小于1，证明这些基因拷贝经历了纯化选择后，维持其基本功能的结构进一步保留并稳定下来。染色体定位结果显示，MsGLK基因在紫花苜蓿基因组中分布广泛且不均匀，或与进化过程中染色体的缺失、插入、重复、倒置有关^［28］。

系统发育树根据拟南芥和紫花苜蓿GLK蛋白序列构建，进一步分为13个组（Ⅰ~ⅩⅢ），多于陆地棉和大豆的分组^{［30，32］}，较多的分组意味着更多的功能分化和更精确的分类。一般而言，同一亚组的蛋白承担着更相似的功能。在Ⅴ组中发现4个拟南芥KANADI样（KAN）基因（AtGLK4、AtGLK30、AtGLK35、AtGLK38），该类基因被发现在拟南芥芽顶端分生组织（shoot apical meristem， SAM）表达，能够抑制生长素的生物合成、转运和信号传导，从而抑制器官形态发生^［45］。属于NIGT1/HRS1/HHO家族的NIGT1.1、NIGT1.2、NIGT1.3和NIGT1.4被观察到聚集在第Ⅲ组中，这些基因被认为是能够整合根尖氮、磷缺乏信号，并抑制初级根的生长以做出响应；部分研究表明，NIGT1/HRS1/HHO转录因子可能通过响应光、温度和激素信号调控植物生长发育，并与植物耐盐性和低温胁迫抗性相关^［46-47］。第Ⅳ组则包括AtLUX（AtGLK27）、AtBOA（AtGLK17）、AtMYBC1（AtGLK41），这些基因被认为参与了昼夜节律振荡^［48］。

保守基序和基因结构的差异在一定程度上体现了蛋白质功能的差异性和基因家族的进化趋势。分析MsGLKs的保守基序发现，基序1和基序2在除MsGLK67和MsGLK84（仅含基序1）的基因中共享，表明两个基序在维持GLK基因的基本功能中至关重要。二者对应的GLK保守基序Myb-SHLQKYF能够与位于C末端的I-box结合，作为转录激活因子发挥作用^［49］。此外，对应Myb-CC-LHEQLE基序的基序3在大多数亚组中被观察到，该结构可能参与多种胁迫信号的传导^［39］。除此以外，不同亚组具有不同的基序，或许意味着其在非生物胁迫中能起到更多样的作用。真核生物基因结构的进化过程涉及许多内含子的增加和缺失，其中缺失发生的频率更高。许多证据表明，内含子的变异是基因进化的主要因素^［50］。在本研究中，MsGLK基因的内含子数量变化大，在第Ⅰ和Ⅳ组中表现尤为明显，推测GLK基因的演化与内含子分布的改变密切相关。此外，研究表明，真核生物基因组中广泛存在的移动遗传元件—长末端重复逆转录转座子（LTR逆转录转座子）能够插入内含子、启动子、下游等基因组区域，进而影响豆科植物基因的结构与功能，或许也对紫花苜蓿GLK基因的结构有一定影响^［51］。

通过分析紫花苜蓿GLK基因家族的启动子顺式作用元件，共发现13类顺式作用元件。先前的研究指出，光能够诱导拟南芥、玉米、谷子中的GLK基因的表达^{［29，52］}。在MsGLKs中，光反应元件分布最为广泛，数量也最多，其中G-box是最重要的光响应元件之一。研究发现，GLK转录因子能够与G-box结合因子（G-box binding factor，GBF）相互作用，协同发挥作用^［53］。MsGLK基因的启动子还预测到大量生长素（auxin， IAA）、脱落酸、赤霉素（gibberellin， GA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）、水杨酸（salicylic acid， SA）等激素响应元件和干旱、低温、厌氧等胁迫响应元件。其中，ABA响应元件（ABRE）同时也受到干旱胁迫的诱导，而低温响应元件（LTR）也与盐胁迫响应相关^{［41，54］}。此外，还存在少部分与细胞周期 、昼夜节律以及类黄酮合成相关的调控元件。基因启动子区域中顺式作用元件的类型、数量和分布的多样性反映了MsGLK基因反应调控机制具有复杂性。GLK基因对叶绿素的合成和叶绿体发育具有正调控作用。组织表达量分析结果显示，大部分MsGLK基因在叶片中表现出较高的表达水平。根据GLK基因控制叶绿素生物合成的功能推测，在叶片中较高的表达水平能够满足GLK对于相关基因活性及代谢功能的调控作用。此外，观察到8个MsGLK基因（MsGLK15、MsGLK21、MsGLK33、MsGLK64、MsGLK66、MsGLK72、MsGLK78、MsGLK83）在紫花苜蓿根组织中特异性表达，可能与根系的生长发育相关，可以作为相应功能研究的优秀靶基因。

许多研究表明，GLK家族在非生物胁迫和植物激素处理反应中发挥了重要作用^{［15， 20-21］}。本研究分析了两种渗透胁迫（干旱、盐）和一种外源激素（ABA）处理下的9个MsGLK基因的表达情况。其中，5个MsGLK基因（MsGLK10、MsGLK17、MsGLK33、MsGLK65、MsGLK83）在干旱和盐胁迫的1~3 h内显著上调，表明这些基因能够在短时间的渗透胁迫中起到正向调控作用；4个基因（MsGLK29、MsGLK36、MsGLK62、MsGLK75）在胁迫处理24~48 h显著上调，推测它们能够响应更长时间的胁迫。MsGLK基因在胁迫的不同阶段响应情况不尽相同，可能更有利于植物适应长期逆境环境。脱落酸（ABA）在植物针对不利环境因子的适应性反应中起着重要作用，被认为是介导植物生长和逆境反应的重要调节剂^［55］。研究发现，ABA信号通路在渗透胁迫引起的植物生理反应和应激基因的诱导中十分关键^［56］。已有研究显示，GLK1/2-WRKY40转录模块能够在ABA反应中起负调控作用，影响拟南芥幼苗的渗透胁迫敏感性^［24］。被检测的基因中，大多数在外源ABA诱导下，呈现出与两种渗透胁迫相似的变化趋势，表明这些MsGLK基因在调控植株渗透胁迫抗性过程中可能依赖ABA的信号传导途径，该观点可以进一步通过试验进行验证。所分析的9个基因中，MsGLK33和MsGLK75分别在盐和干旱处理下变化幅度最高，响应最强烈，可能在紫花苜蓿耐旱抗盐方面具有较好潜力。上述结果表明，MsGLK基因在紫花苜蓿应对渗透胁迫方面起着重要作用，具体的生物学功能及调控机制有待进一步研究和验证。

4 结论

本研究从四倍体“新疆大叶”紫花苜蓿参考基因组中鉴定到100条MsGLKs基因，97个不均匀分布在32条染色体上，其余3个未定位在染色体上。MsGLKs蛋白相对较小，序列长度为201~860个氨基酸，蛋白质分子量为23.51~94.37 kDa。根据系统发育关系、保守基序及基因结构，可将MsGLKs蛋白分为13组，所有成员均含有GLK特异性基序Myb-SHLQKYF。MsGLKs成员含有参与植物生长发育、激素响应和胁迫反应相关的顺式作用元件。共线性分析表明，片段重复在该家族的扩增中起到了重要作用。转录组数据揭示了不同MsGLKs基因可能在紫花苜蓿生长发育的过程中发挥着不同的功能。RT-qPCR结果表明9个基因均能参与响应干旱和盐胁迫，并且该响应过程可能与ABA信号传导相关。本研究结果可为进一步探究MsGLKs基因功能提供理论依据，以期为紫花苜蓿抗旱耐盐种质的改良和创新提供新的候选基因。

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基金资助

国家自然科学基金(32372227)

河南省高等学校青年骨干教师培养计划(2021GGJS050)

河南省自然科学基金(242300421319)

河南省科技研发计划联合基金项目(232103810021)