氮添加对黄土丘陵区草地土壤微生物养分限制特征的影响

Effects of nitrogen addition on soil microbial nutrient limitation characteristics in grassland in the Loess Hilly Region

摘要

不断加剧的大气氮沉降会改变土壤养分平衡，进而引起土壤微生物养分限制，但目前关于氮沉降对黄土丘陵区草地土壤微生物养分限制特征的影响还不清楚。研究基于野外模拟氮沉降控制试验，通过测定土壤微生物生物量和养分转化酶活性，结合土壤理化性质分析，揭示了不同氮添加水平下草地土壤微生物养分限制特征及其影响因素。结果表明：氮添加导致土壤pH下降，并引起土壤养分平衡特征变化，具体表现为土壤有机碳、全氮含量的增加，而全磷无显著变化；氮添加导致了土壤速效养分含量增加，且速效磷含量增加速率大于可溶性碳和矿质氮，引起速效养分碳氮的相对不足。草地土壤微生物生物量和胞外酶活性在低浓度氮添加下降低，在高浓度氮添加下升高。随着氮添加浓度的增加，草地土壤微生物氮限制加剧而碳限制缓解；微生物碳限制同时还影响着微生物碳利用效率特征；氮添加引起的土壤全量和速效养分不平衡变化通过调控微生物生物量和酶活性共同决定着土壤微生物的养分限制特征。研究为理解氮沉降背景下草地土壤养分循环特征提供了进一步的认识。

Abstract

Increasing atmospheric nitrogen deposition is affecting the soil nutrient balance. This may result in decreased nutrient availability to soil microbes. However， the effect of nitrogen deposition on the characteristics of nutrient limitation for soil microbes in grassland in the Loess Hilly Region is still unclear. The objective of this study was to investigate the effects of nitrogen deposition on soil microbial nutrient limitation in this region. A field-based controlled experiment simulating nitrogen deposition was conducted， and the soil microbial biomass， nutrient-transforming enzyme activities， and soil physicochemical properties were determined. This allowed us to elucidate the characteristics of nutrient limitation for grassland soil microorganisms， and its influencing factors， under different nitrogen addition levels. The results showed that nitrogen addition led to a decrease in soil pH， and altered the soil nutrient balance. More specifically， nitrogen addition increased the soil organic carbon and total nitrogen contents， but did not significantly affect the total phosphorus content. In addition， nitrogen addition enhanced the contents of soil available nutrients， with a greater increase in the available phosphorus content than in the soluble carbon and mineral nitrogen contents. This resulted in a relative shortage of carbon and nitrogen as available nutrients. Notably， the soil microbial biomass and extracellular enzyme activities decreased under low nitrogen addition but increased under high nitrogen addition. Further analyses using an enzyme stoichiometric model indicated that with increasing amounts of nitrogen addition， nitrogen limitation for soil microorganisms was intensified， while carbon limitation was alleviated. Microbial carbon limitation also affected the microbial carbon utilization efficiency. The imbalance of soil total and available nutrients caused by nitrogen addition jointly affected the characteristics of nutrient limitation for soil microorganisms by regulating microbial biomass and enzyme activity. In conclusion， these findings provide new information about the characteristics of soil nutrient cycling in grassland as affected by increasing nitrogen deposition.

Graphical abstract

关键词

氮沉降 / 草地 / 养分限制 / 胞外酶活性 / 养分利用效率

Key words

nitrogen deposition / grassland / nutrient limitation / extracellular enzyme activity / nutrient use efficiency

氮（nitrogen，N）、磷（phosphorus，P）是植物生长最主要的营养元素，同时也是陆地生态系统初级生产力的主要限制元素^［1］。因此N、P平衡对生态系统稳定和功能维持具有重要作用。近年来由于人类活动导致大气氮沉降的不断增加，改变了陆地生态系统N、P输入比例，打破了养分平衡特征进而对生态系统过程产生强烈干扰^［2-3］。尤其是长期受到水分和养分限制的半干旱区草地生态系统，其对氮沉降的响应更为敏感^［4］。适量的氮沉降能为草地提供额外的有效N并促进草地植物生长和增加微生物多样性^［5］。然而，持续增加的氮沉降会向土壤输入过多的外源N，不仅显著改变土壤理化性质和植被群落生长，并可能引起或加剧草地土壤微生物活动的碳（carbon， C）或P限制，进而影响草地生态功能甚至加剧草地退化风险^［4，6］。尽管目前围绕氮沉降调控的草地植被群落、土壤微生物多样性和土壤理化性质改变等问题已经开展了广泛研究，但对于半干旱草地土壤微生物养分限制特征对氮沉降的响应还缺乏深刻认识，这限制了全球变化背景下草地养分的可持续管理。

氮沉降向草地输入外源氮素，会直接进入土壤并调控土壤养分循环过程^［7］。微生物作为土壤有机质分解和养分循环的主要参与者，其生长代谢特征受到土壤养分限制的强烈影响^［8］。微生物主要通过分泌胞外酶参与土壤C、N、P等养分循环，在面对氮沉降引起的土壤养分失衡或限制时，会通过调节不同胞外酶的活性而改变养分吸收比例和策略^［9］。因而土壤胞外酶活性及其计量比被作为表征土壤养分限制特征的良好指标^［10］。Moorhead等^［11］和Cui等^［12］提出基于土壤胞外酶矢量角度（vector angles， VA）和矢量长度（vector length， VL）预测微生物受到养分限制的情况，认为VA大于45°时，微生物受到P限制，当VA小于45°时，微生物受到N限制，为评估微生物养分限制状态提供了新的视角。大量研究者基于该方法揭示了氮沉降对不同类型生态系统养分限制的影响^［2，10］。为了更准确地评估土壤微生物代谢受到养分限制的状态，Cui等^［13］基于生态化学计量学和微生物代谢理论，开发了新的微生物养分代谢限制阈值元素矢量（vector-threshold element ratio， V-T）模型，该模型不仅考虑了不同区域尺度或特定生态系统下土壤C、N和P胞外酶活性比值的差异，并将微生物养分代谢纳入模型，从而提高了微生物养分限制评估的准确性。Wang等^［8］通过该方法揭示了氮沉降引起的西天山-帕米尔高原荒漠区生态系统的C、P养分共同限制；Xu等^［14］利用该模型表明了黄土高原植被恢复过程中的土壤P限制加剧和C限制缓解规律。因此，通过酶计量学和矢量关系分析，结合微生物资源利用特征能够更准确揭示氮沉降对草地土壤养分限制的影响。

黄土高原属于典型的干旱半干旱气候区，也是我国重要的生态屏障区和生态脆弱区^［15］。近年来生态修复工程的实施形成了大规模的草地，尤其是在黄土丘陵区草地占到区域植被面积的40%以上，其草地生态系统在保障维护区域生态平衡和生物多样性方面发挥着重要作用^［16］。但该地区草地长期以来面临土壤养分、水分限制等问题^［17］，此前研究证实了氮沉降对黄土高原草地植物群落、土壤养分特征、微生物群落和土壤胞外酶活性均有显著影响，然而对氮沉降导致的该地区草地土壤微生物养分限制特征还不清楚^［18］。此外，氮沉降可能会通过改变土壤养分含量、调控养分有效性和改变微生物吸收及胞外酶活性等不同路径影响微生物养分限制情况，但对关键调控因子及其作用过程的认识还不足^［19-21］。本研究拟依托黄土高原草地野外模拟氮沉降控制试验，测定不同水平模拟氮沉降处理下草地土壤养分特征、微生物生物量和关键胞外酶活性，基于酶计量学和V-T矢量模型评估不同氮沉降水平下的土壤微生物养分限制特征，并分析其关键影响因素。研究能加深对全球变化背景下半干旱草地养分循环规律的理解，也可为黄土高原草地可持续管理提供科技支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于陕西省延安市安塞区五里湾流域（36°52′ N，109°21′ E，海拔1061~1371 m），属于典型的黄土丘陵沟壑区，暖温带半干旱气候。年平均气温8.8 °C，多年平均降水量505 mm，降水主要在6-9月。区域土壤类型为黄绵土，pH约为8.4。区域氮沉降以夏季无机氮湿沉降为主，自然氮沉降水平为10~30 kg N·hm^-2·a^{-1［18， 20］}。该区域此前由于开垦导致植被严重破坏，经封育后形成的自然恢复草地是主要植被类型，试验开始时草地恢复年限约为30年。

1.2 试验设计和样品采集

研究基于2017年3月开始的野外氮添加模拟氮沉降控制试验进行，该试验为单因素随机区组设计，根据当地氮沉降量，设置5个氮添加水平（0、10、20、40、80 kg N·hm^-2·a^-1，用N₀、N₁、N₂、N₃、N₄表示），每个处理水平设置3个重复样方，每个样方面积9 m²（3 m×3 m），每年分4次进行氮添加处理，详细的试验处理描述参见邓健等^［18］的研究。土壤样品采集于2020年8月，每个样方沿对角线采集3个0~10 cm的土壤样品并混合作为1份土样。随后将土样转至实验室，迅速过2 mm筛后，一份阴凉风干用于土壤理化性质测定；另一份在4 ℃保存用于土壤酶活性和微生物生物量分析。

1.3 土壤理化性质和微生物生物量分析

采用鲍士旦^［22］的土壤养分分析方法，土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）用重铬酸钾-浓硫酸外加热法测定； 土壤全磷（total phosphorus，TP）和全氮（total nitrogen，TN）经浓硫酸-高氯酸消煮后分别采用钼锑抗比色法和全自动凯氏定氮法测定；土壤速效磷（available phosphorus，AP）经碳酸氢钠浸提后用钼锑抗比色法测定； 硝态氮（nitrate nitrogen，NO₃^--N）和铵态氮（ammonium nitrogen，NH₄⁺-N）经KCl浸提后分别采用紫外分光光度法和靛酚蓝比色法测定。土壤可溶性有机碳（soluble organic carbon， DOC）采用超纯水0.45 μm滤膜过滤后用总有机碳分析仪（TOC，日本岛津）测定。土壤pH采用pH计（PHS-25，中国上海）测定（水土比5∶1）^［22］。土壤微生物生物量碳（microbial biomass carbon， MBC）、微生物生物量氮（microbial biomass nitrogen， MBN）和微生物生物量磷（microbial biomass phosphorus， MBP）采用氯仿熏蒸提取法测定。土壤养分和速效养分计量比采用摩尔比计算。

1.4 酶活性测定和计算

土壤酶活性采用96微孔板荧光光度法测定^［18］，主要测定土壤碳、氮、磷转化相关的 β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase， BG）、β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-1，4-acetyl-glucosaminidase， NAG）、亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase， LAP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP），其测定底物分别使用4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside）、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖酸苷 （4-methylumbelliferyl-nacetyl-β-D-glucosaminide）、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐（L-leucine-7-amino-4-methylcoumarin）和4-甲基伞形酮酰-磷酸酯（4-methylumbelliferyl-phosphate）^［23］。

1.5 数据计算

土壤酶计量学、微生物养分限制指标和碳利用效率计算公式如下。

土壤酶化学计量比：

EEA_C∶N=\mathrm{l}\mathrm{n}\mathrm{B}\mathrm{G}/\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{G}+\mathrm{L}\mathrm{A}\mathrm{P})

EEA_C∶P=\mathrm{l}\mathrm{n}\mathrm{B}\mathrm{G}/\mathrm{l}\mathrm{n}\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{P}

EEA_N∶P=\mathrm{l}\mathrm{n}\left(\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{G}+\mathrm{L}\mathrm{A}\mathrm{P}\right)/\mathrm{l}\mathrm{n}\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{P}

式中：EEA_C∶N、EEA_C∶P、EEA_N∶P分别表示土壤胞外酶活性C∶N、C∶P和N∶P。

通过生态学矢量分析模型及阈值元素比率模型，计算土壤微生物生物量氮/磷限制指标VT_{N/P limitation}和碳限制指标VT_{C limitation}，计算公式如下^［13］：

TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}=(EE{A}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}\timesB_{\mathrm{C}:\mathrm{X}})/Z_{\mathrm{0}}

TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}^{\mathrm{0}}=(A_{\mathrm{X}}^{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}/CU{E}^{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}})\times B_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}

∆TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}=TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}^{\mathrm{0}}-TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{X}}

x_{\mathrm{0}}=\mathrm{I}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{e}\mathrm{r}\mathrm{c}\mathrm{e}\mathrm{p}\mathrm{t}(EE{A}_{\mathrm{C}}/EE{A}_{\mathrm{C}+\mathrm{P}}\mathrm{v}\mathrm{s}.∆TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{P}})

y_{\mathrm{0}}=\mathrm{I}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{e}\mathrm{r}\mathrm{c}\mathrm{e}\mathrm{p}\mathrm{t}(EE{A}_{\mathrm{C}}/EE{A}_{\mathrm{C}+\mathrm{N}}\mathrm{v}\mathrm{s}.∆TE{R}_{\mathrm{C}:\mathrm{N}})

V{T}_{\mathrm{N}/\mathrm{P}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}}=\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{G}\mathrm{R}\mathrm{E}\mathrm{E}\mathrm{S}\left[\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{N}\mathrm{2}\left(x,y\right)\right]-\mathrm{D}\mathrm{E}\mathrm{G}\mathrm{R}\mathrm{E}\mathrm{E}\mathrm{S}\left[\mathrm{A}\mathrm{N}\mathrm{T}\mathrm{A}\mathrm{N}\mathrm{2}\left(x_{\mathrm{0}},y_{\mathrm{0}}\right)\right]

V{T}_{\mathrm{C}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{t}\mathrm{i}\mathrm{o}\mathrm{n}}=\sqrt[]{(x^{\mathrm{2}}+y^{\mathrm{2}})}-\sqrt[]{\left(x_{\mathrm{0}}^{\mathrm{2}}+y_{\mathrm{0}}^{\mathrm{2}}\right)}

式中：X表示N或P；TER_C∶X表示阈值比率；A_X是同化效率；CUE^max是微生物C利用效率的上限。Z₀是lnBG和ln（NAG+LAP）之间的截距；B_C：X是土壤微生物生物量C∶X比率；DEGREES表示弧度转化为角度的函数；ATAN2表示以坐标原点为起点，指向点（x，y）的射线在坐标平面上与x轴正方向之间夹角的角度，X是BG/ALP，Y是BG/（NAG+LAP）；A^max和CUE^max分别为0.9和0.6。VT_{N/P limitation}>0和VT_{N/P limitation}<0分别指示土壤微生物受到磷限制和氮限制，绝对值越大表明限制越严重；VT_{C limitation}指示土壤微生物受到碳限制程度，VT_{C limitation}越大表明碳限制越严重^［13］。

微生物碳利用效率（carbon use efficiency， CUE）表征土壤微生物对碳吸收和转化的程度，计算公式如下^［13］：

\mathrm{C}\mathrm{U}\mathrm{E}=CU{E}^{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}\times \left\{\left(S_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}\times S_{\mathrm{C}:\mathrm{P}}\right)÷\left[\left(K_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}+S_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}\right)\times \left(K_{\mathrm{C}:\mathrm{P}}+S_{\mathrm{C}:\mathrm{p}}\right)\right]\right\}^0.5

S_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}=B_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}/L_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}\times \mathrm{1}/EE{A}_{\mathrm{C}:\mathrm{N}}

S_{\mathrm{C}:\mathrm{P}}=B_{\mathrm{C}:\mathrm{p}}/L_{\mathrm{C}:\mathrm{P}}\times \mathrm{1}/EE{A}_{\mathrm{C}:\mathrm{P}}

式中：K_C∶N和K_C∶P是基于C、N和P可用性的CUE的半饱和常数，假设所有模型的K_C∶N和K_C∶P为0.5；L_C∶N是土壤有效养分C∶N；L_C∶P是土壤有效养分C∶P；S_C∶X表示生态酶活性的分配在多大程度上抵消了可用资源的元素组成和微生物生物量组成之间的差异。

1.6 数据处理和分析

数据经过正态性检验和方差同质性检验后，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）研究氮添加对不同指标影响的显著性，采用DUNCAN法进行多重比较。采用Pearson相关分析研究不同团聚体水平土壤酶活性与土壤养分及化学计量比间的相关关系；采用偏最小二乘回归（partial least squares regression， PLS）模型分析了氮添加通过改变土壤养分指标，调控微生物生物量和酶活性，进而影响微生物养分限制特征的关键路径。数据和柱状图采用平均值±标准误表示，土壤养分计量比均采用摩尔比。所有数据分析均使用R软件（V 4.3.3）完成。

2 结果与分析

2.1 氮添加对土壤理化性质和养分计量比的影响

氮添加对土壤养分含量及其计量比、微生物生物量、酶活性等均有显著影响（P<0.05，表1）。随着氮添加浓度的增加，土壤pH显著降低，而土壤AP、NH₄⁺-N显著增加（P<0.05），土壤C∶P、N∶P先降低后增加（P<0.05）。土壤SOC、TN和NO₃^--N含量随氮添加浓度的增加先降低后增加（P<0.05），而TP含量无显著变化。氮添加后土壤速效养分C∶P和N∶P有所下降，但是变化趋势不显著。土壤MBC、MBN、MBP和养分转化酶活性随着氮添加浓度的增加均先降低后增加，尤其是在高浓度氮添加处理下增加较多（P<0.05，表1）。

2.2 氮添加对土壤微生物生物量和酶活性及其计量比的影响

土壤胞外酶活性计量比和微生物生物量计量比均受到氮添加处理的显著影响（P<0.05，图1）。随着氮添加浓度的增加，土壤微生物生物量C∶N、C∶P和N∶P均显示出先减小后增加的趋势，在中等水平氮添加处理（N₂）下最低（图1a~c，P<0.05）。

随氮添加浓度的增加，土壤EEA_C∶N呈显著减小的趋势，从N₀到N₄下降了4.02%（P<0.05，图1d）；EEA_C∶P随氮添加浓度的增加先减小后增大（P<0.05，图1e）；EEA_N∶P在低浓度氮添加处理下无显著变化，而在高浓度氮添加处理（N₃和N₄）下显著增加（P<0.05，图1f） 。

2.3 氮添加对土壤微生物养分限制特征和养分利用效率的影响

氮添加对土壤微生物养分限制特征和养分利用效率均有显著影响（P<0.05，图2）。VT_{N/Plimitation}在所有氮添加浓度处理下均<0，表明土壤微生物受到氮限制；且随着氮添加浓度的增大VT_{N/Plimitation}逐渐减小，指示着氮限制的加剧（P<0.05，图2a）。VT_{C limitation}在所有氮添加浓度处理下均>0，且随着氮添加浓度的增加呈先减小后增大的趋势，表明土壤微生物碳限制有所缓解（P<0.05，图2b）。CUE随着氮添加浓度的增加先增大后减小；在氮添加水平为20 kg N·hm^-2 ·a^-1时，CUE最高（P<0.05，图2d）。土壤VT_{C limitation}与VT_{N/P limitation}之间没有显著的相关关系（图2c），但微生物碳利用效率与VT_{C limitation}之间显著负相关（P<0.05，图2e）。

2.4 土壤理化性质与微生物养分限制特征和碳利用效率的关系

Pearson相关性分析的结果表明，土壤胞外酶活性计量比与土壤SOC、TN、N∶P和AP等指标显著相关（P<0.05，图3）。VT_{N/P limitation}与土壤TN、N∶P、DOC和 AP显著相关（P<0.05）。而CUE、VT_{C limitation}与土壤理化指标均无显著的相关性（图3）。

偏最小二乘回归分析结果表明，氮添加显著影响了土壤全量和速效养分含量，并调控了土壤微生物生物量和酶活性特征（P<0.05，图4）。VT_{C limitation}受到土壤微生物生物量（路径系数0.523，P<0.05）和胞外酶活性（路径系数0.766，P<0.05）的共同影响，但土壤VT_{N/P limitation}仅受到胞外酶活性的调控（路径系数0.773，P<0.05）。VT_{C limitation}对土壤碳利用效率有显著的调控作用（路径系数-0.589，P<0.05，图4）。

3 讨论

3.1 模拟氮沉降对草地土壤养分及其平衡特征的影响

氮沉降会通过增加土壤外源氮的输入而改变土壤氮素含量及其有效性^［3］。此前研究表明氮添加会增加土壤SOC^［24］、TN和有效氮含量^［25］。本研究中高浓度氮添加下土壤TN、SOC和NH₄⁺-N含量有所增加证实了上述结论，这主要来自于外源氮素的积累^［25］和氮添加促进植物生长带来的有机残体输入增加^［26］。然而，值得注意的是，本研究中土壤SOC和TN对氮添加浓度的响应并不是呈线性增长的关系，从N₁到N₂，低浓度氮添加反而使得土壤SOC和TN含量下降，这很可能是由激发效应引起^［27］。土壤C、N库取决于外部有机质输入和输出的平衡，由于研究区土壤N含量相对较低，外部输入的少量N素即可引起土壤微生物的强烈反应，刺激微生物活性，激发微生物对土壤原有有机质中有机碳、有机氮的分解释放，并由此加剧土壤C、N输出损失^［28］。同时，此前对本平台植被群落的研究发现低浓度氮添加对植被生物量的增加十分有限，因而其输入的有机残体增加量可能被激发效应带来的分解增加抵消掉^［29］。此外，氮添加还引起了土壤pH显著下降和土壤AP含量等的显著变化，这都可能通过改变参与有机质分解的微生物群落而影响土壤C、N的分解或积累^［30］。本研究中氮添加对土壤全P的影响不显著，这与此前大多数研究一样^［31-32］，其主要原因是土壤中的P主要来自于岩石风化，对植物群落变化和外部氮输入不敏感^［33］。由于土壤C、N、P对氮添加的差异化响应，导致了土壤养分平衡特征的变化。随着氮添加浓度的增加，土壤C∶N逐渐降低，而C∶P和N∶P先降低后增加，这表明氮添加导致土壤总体养分中C、N的积累，而P可能相对不足^［24］。然而，土壤速效养分C∶P和N∶P均随着氮添加浓度的增加而降低，说明高浓度氮添加导致微生物可利用C、N相对不足，这与上述全量养分所反映土壤P不足的趋势有差异。造成这种差异的原因，一方面是微生物通过胞外酶对土壤可利用养分的调控，即微生物能通过改变对应的胞外酶活性调控土壤有机质分解和释放速效磷等可溶性养分，因而速效养分对氮添加的反应比全量养分更快^［22］；另一方面是来自于氮添加引起的pH下降，增强了土壤P的溶解性和有效性，进而导致了土壤速效磷的显著增加，而pH对土壤可溶性C和N的调控作用则相对较小^［34］。

3.2 氮添加对微生物养分限制特征的影响及其调控因素

土壤微生物分泌的胞外酶是其获取可用养分的主要途径，对土壤中代谢底物养分平衡比较敏感，因而胞外酶化学计量比是表征微生物养分需求和受养分限制特征的重要指标^［35］。理论上，氮添加会直接增加土壤中微生物可利用氮含量（如NH₄⁺-N和NO₃^--N），从而导致微生物氮代谢相关酶（NAG和LAP等）活性的下降，引起EEA_C∶N的增加和EEA_N∶P的降低^［10］。然而，本研究发现，土壤NAG和LAP活性在低浓度氮添加处理下不变或略微降低，而在高浓度氮添加处理下显著增加（表1）；由此引起EEA_C∶N随着氮添加浓度增加反而降低，而EEA_N∶P在高浓度氮添加下有所增加（图1）。基于酶矢量模型的结果也发现VT_{N/P limitation}<0（图2），指征土壤微生物代谢受到氮限制，且随着氮添加浓度的增加，氮限制程度反而越发加剧。这与此前的多项研究结果均不一致^{［24， 36］}，且与土壤全量养分计量比所反映的磷限制结果也不同。其原因可能有两个方面：其一，虽然本研究中土壤TN含量在高氮添加下有所增加，但是微生物可利用的矿质氮（NH₄⁺-N和NO₃^--N）含量变化较小；而土壤AP和DOC含量随着氮添加浓度增加却显著增加，由此导致土壤速效养分N∶P的下降和C∶N的上升，即速效N的相对不足。由于土壤速效养分是微生物能直接吸收利用的部分，因而土壤中生物有效N的相对不足会诱导其分泌更多的氮转化酶^［10］，进而导致EEA_C∶N的降低和EEA_N∶P的增加。从这个角度来看，微生物是受到土壤速效氮限制的，土壤AP含量与VT_{N/P limitation}的负相关关系能证实这一推测。其二，本研究氮添加剂为尿素，而尿素无法被微生物直接吸收利用，需要通过分泌氮转化胞外酶来进行分解^［37］。此前多项研究均证实了尿素添加引起的土壤脲酶和硝酸还原酶等氮转化酶活性的增加^［38-39］。本研究中土壤氮转化酶活性（NAG和LAP）也随着氮添加浓度增加而增加，这是因为速效养分中N的相对不足刺激氮转化酶活性的增加共同调控了土壤、微生物酶计量比，最终导致VT_{N/P limitation}<0且随着氮添加浓度的增加而降低，表现出氮限制特征。这说明氮添加引起的微生物养分限制特征可能更多取决于可利用养分的相对比例，且与氮添加剂的类型有关。

尽管自然生态系统植物残体的输入为微生物代谢提供了丰富的碳源，但是氮沉降等引起的土壤养分不平衡变化仍然可能会诱发微生物代谢的碳限制，这主要来自于外部N输入使得微生物代谢底物中C∶N的降低^［40］。而本研究中，随着氮添加浓度增加，EEA_C∶N呈逐渐下降趋势，且VT_{C limitation}也随着氮添加浓度的增加而降低，说明土壤微生物对碳的相对获取需求降低和受到的碳限制有所缓解（图2）。Liu等^［41］的研究也得到了类似的结论，其主要原因是氮添加导致植物性有机物输入增加和微生物残体碳在土壤中积累^{［26，41］}。本研究中随着氮添加浓度增加土壤SOC先降低后增加而DOC含量有所增加，尤其是在高浓度氮添加处理下更加显著（表1），说明土壤微生物代谢底物中总碳源和可利用碳源都更加丰富，进而缓解了微生物碳限制^［30］。此外，本研究表明微生物VT_{C limitation}和VT_{N/P limitation}之间不存在显著的相关性，表明氮添加导致的微生物氮磷限制和碳限制之间是解耦的，这可能主要来自于氮添加对土壤氮磷养分及其有效性的影响和对有机碳含量及其有效性的影响。

3.3 氮添加对微生物碳利用效率的影响及其与养分限制的关系

土壤微生物CUE是其在特定资源状态下表现出来的C分配特征，CUE越高意味着微生物将更多的C转化为微生物生物量而非呼吸或者其他代谢^［42］。本研究中微生物CUE在低浓度氮添加下增加，而在高浓度氮添加下显著降低，说明少量氮添加会导致微生物将更多能量分配到自身生长，而高浓度氮添加时微生物会将更多C分配用于呼吸和代谢过程。由于研究区土壤N含量较低限制了微生物的生长，少量的外源N输入能刺激微生物群落充分利用资源快速生长，因而会将更多的C分配到自身生长，并由此导致CUE的降低^［24］。而微生物CUE与其受碳限制的状态密切相关，理论上微生物受到碳限制越严重，会将更多的能量分配给自身生长，并由此导致CUE增加^［43］。然而本研究中不同氮添加浓度下CUE却随着微生物碳限制的缓解而增加（图2）。原因可能是微生物碳限制缓解的同时氮限制却在不断加剧，因而其在供给自身增长的同时，需要分配更多的C和能量用于胞外酶和代谢来获取营养元素^［44-45］。本研究与Li等^［46］的研究中CUE随氮添加的变化趋势相同，同时该研究还表明高浓度氮添加导致CUE下降是土壤微生物群落向CUE较低的微生物转变的结果，这也可能是造成CUE与VT_{C limitation}负相关的原因。孙雪琦等^［47］的研究也证明氮添加导致的土壤微生物CUE改变是由于群落中富营养类群的变化导致，但该研究结果却表明高氮添加增加了土壤CUE，本研究结果与其相反，可能是该研究氮添加处理对象是亚热带森林，其土壤C、N供应能力、气候特征和微生物群落均与本研究的半干旱草地有较大差别。因此，不同氮添加水平对土壤CUE的调控与土壤本身养分含量特征和环境条件有关，且受到微生物群落演变特征的强烈影响，未来研究中有必要继续深入分析氮添加驱动的微生物群落结构变化与微生物养分限制特征和养分利用效率的关系。

4 结论

黄土丘陵区草地土壤养分的平衡特征受到氮添加的显著影响，但全量养分和速效养分的变化趋势不同。氮添加促进了土壤SOC、TN的积累，引起TP的相对不足；而土壤速效养分表现出C、N的相对不足。草地土壤微生物生物量和酶活性在低浓度氮添加下降低而在高浓度氮添加下增加。

氮添加加剧了黄土丘陵区草地土壤微生物N限制而缓解了C限制；微生物CUE随着氮添加浓度的增加先增加后降低，且与微生物碳限制特征负相关；土壤微生物养分限制特征受到来自氮添加引起的土壤全量和速效养分含量不平衡变化的综合影响。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2024JC-YBMS-224)

延安市科技计划项目(2023-CYL-120)

榆林市科技计划项目(2023-CXY-212)

国家级大学生创新创业训练计划项目(202310719001)