豌豆蚜组织蛋白酶K基因（ApCtsk1）的鉴定及功能研究

Identification and functional analysis of ApCtsk1 encoding cathepsin K in Acyrthosiphon pisum

摘要

为探究豌豆蚜ApCtsk1基因的生理功能，评估其作为豌豆蚜防治靶标的潜力，从而为防控策略的制定提供理论依据。本研究以豌豆蚜为对象，利用NCBI、ExPASy Proteomics Server、MEGA 11等在线网站和软件分析ApCtsk1的氨基酸序列特征并构建系统发育树；采用RT-qPCR技术解析其在不同发育阶段、不同组织的表达模式；通过RNAi研究ApCtsk1在豌豆蚜个体发育和繁殖中的生物学功能。结果表明：豌豆蚜ApCtsk1与半翅目蚜科昆虫的半胱氨酸蛋白酶聚为一支，其在4龄若蚜期显著高表达，并在成虫腹部、卵巢、表皮表达量较高。RNAi干扰3龄若蚜的ApCtsk1后，与对照组相比，豌豆蚜死亡率升高至22.22%，体长体宽分别减小12.56%、13.22%，体色异常，行动缓慢。此外，经dsApCtsk1处理的蚜虫出现蜕皮失败的致死现象，且干扰后豌豆蚜繁殖力也受到影响，表现为产蚜时间的推迟和一段时间产蚜量的降低。由此可见，ApCtsk1在豌豆蚜个体发育、存活和繁殖过程中具有重要的作用。

Abstract

The aim of this research was to explore the function of ApCtsk1 in pea aphid （Acyrthosiphon pisum） and evaluate its potential as a target for the prevention and control of this pest. The amino acid sequence characteristics of the putative ApCtsk1 protein were analyzed using tools at various websites （NCBI， ExPASy Proteomics Server） and a phylogenetic tree was constructed using MEGA 11. The transcript levels of its encoding gene were determined in aphids at different stages of development and in different tissues by RT-qPCR analysis. The biological function of ApCtsk1 in the development and reproduction of A. pisum was investigated using an RNA interference gene knock-down strategy. In the phylogenetic analysis， ApCtsk1 was clustered with cysteine proteases from other members of the Aphididae in the Hemiptera. High transcript levels of ApCtsk1 were detected in fourth instar nymphs， and in the abdomen， ovary， and cuticle of adult aphids. Compared with A. pisum in the control group， those in the ApCtsk1-knockdown group showed an increased mortality rate （22.22% higher）， decreased body length and body width （decreased by 12.56% and 13.22%， respectively）， abnormal body color， and slower movement. In addition， the aphids with knocked-down ApCtsk1 showed the lethal phenomenon of molting failure， which affected their fecundity. These changes resulted in delayed reproduction and decreased reproduction over time. Our findings show that ApCtsk1 plays an important role in the development， survival， and reproduction of A. pisum.

Graphical abstract

关键词

豌豆蚜 / 组织蛋白酶K / 繁殖 / RNAi

Key words

Acyrthosiphon pisum / cathepsin K / fecundity / RNAi

组织蛋白酶（cathepsin）是一类存在于弱酸环境（如溶酶体）中的胞内蛋白酶，因此广泛分布于细菌、病毒、植物、昆虫、哺乳动物等生物体中^［1］。它的一个重要功能是参与溶酶体中蛋白质的水解，从而参与有机体的各种生理活动^［2-3］。按照组织蛋白酶水解活性的分类标准，多数组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶，包括cathepsin B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W，它们的共同特点是都具有一个半胱氨酸残基活性位点；少数组织蛋白酶为天冬氨酸蛋白酶（cathepsin D、E）和丝氨酸蛋白酶（cathepsin A、G）^［4-6］。值得注意的是，研究最多的组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，尤其是在哺乳动物中。半胱氨酸蛋白酶在细胞内发挥着极为重要的作用，也是在生命周期所有阶段表达的必需酶^［7］。这种蛋白水解酶的活性中心由半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺残基组成，具有独特的闭环形状，在生物进化过程中表现出极大的保守性。在研究昆虫的半胱氨酸蛋白酶时，主要关注的是昆虫卵发育阶段以及蜕皮、化蛹和羽化等其他发育阶段的组织重建和破坏^［8-9］。目前关于半胱氨酸蛋白酶的研究主要集中在组织蛋白酶B和L^［10］，而组织蛋白酶K在昆虫中的研究鲜有报道。

组织蛋白酶K（cathepsin K）具有木瓜蛋白酶家族的典型结构，是木瓜蛋白酶家族重要的半胱氨酸蛋白酶，以酶原形式在核糖体中合成，通过高尔基体糖基化和磷酸化后转运至溶酶体内，进行一系列反应，形成成熟的组织蛋白酶K，进而发挥相对应的生物学功能^［11］。组织蛋白酶K与组织蛋白酶B、L具有高度同源性，在酸性环境中具有很强的胶原酶活性，具有降解胶原的能力^［12］，也是目前已知的体内蛋白水解作用最强的弹性蛋白酶。在医学方面有研究显示，CTSK基因会在破骨细胞的边缘褶皱处特异性表达，其主要作用底物是构成骨基质90%以上的Ⅰ型胶原。此外，它具有很强的胶原溶解作用，还能够降解骨基质中的Ⅱ型胶原、骨桥接素以及骨连接素等蛋白。因此，CTSK是破骨细胞中溶骨活性最强的关键酶^［13］。CTSK基因的突变或缺失可能导致患者发生致密性骨质不全症、骨质疏松症和骨脆性骨折等疾病^［14］，同时与骨关节炎、风湿性关节炎以及其他关节炎症也密切相关^［15］。除了骨组织外，在机体的不同细胞中均有表达，这决定着其参与机体多种生物功能。

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）属半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），危害包括蚕豆（Vicia faba）、白羽扇豆（Lupinus albus）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、扁豆（Lens culinaris）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）和山黧豆（Lathyrus sativus）等在内的多种豆科植物^［16-18］，是全球范围内重要的农业害虫。由于其寄主范围广，生命周期复杂，对不同环境条件具有适应性和灵活性^［19］，使得对这种害虫的防治变得困难。豌豆蚜可直接从叶片、茎和荚果中吸取汁液来损害作物，也可以作为媒介间接传播超过30种植物病毒，包括黄瓜（Cucumis sativus）花叶病毒、甜菜（Beta vulgaris）黄化病毒、豌豆（Pisum sativum）花叶病毒和菜豆（Phaseolus vulgaris）卷叶病毒^［20-21］。豌豆蚜主要取食幼苗的茎、顶端嫩枝和叶柄，随着植株成熟，也会危害花和荚果，造成叶片卷曲、枯萎、营养不良等。此外，豌豆蚜在取食的同时通过刺吸式口器刺破细胞并注入对植物有毒性的唾液，导致植物受损严重^［22］。不仅如此，豌豆蚜分泌的蜜露会诱发霉菌的产生，从而影响寄主植物的光合作用^［23］。据报道，豌豆蚜的为害曾使得印度豌豆产量损失高达35.7%^［24］。因此，豌豆蚜的防治对农业生产至关重要。为了减轻豌豆蚜对作物的危害，保障农业生产的稳定和可持续发展，研究人员需要开发有效的防治措施，例如采用生物治理、化学防治和培育抗性品种等方法。

众多研究已经证实，组织蛋白酶在昆虫的消化过程^［25］、生长发育^［26］、组织分化^［27］以及变态过程^［28］中扮演着关键角色，因此它们被认为是控制害虫的潜在靶标。在蚜虫中的半胱氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶L和组织蛋白酶B，在肠道中的表达量较高^［29-32］，这表明它们可能在植物韧皮部蛋白质的降解和吸收过程中发挥作用。在人工饲料中添加特定的组织蛋白酶L dsRNA来饲喂豌豆蚜，可以实现对该基因在肠道中的特异性沉默，从而验证了RNAi技术在昆虫基因调控中的有效性^［33］。此外，RNAi介导的组织蛋白酶B基因沉默，可以通过寄主植物特异性的方式抑制桃蚜的生长^［34］。本研究从豌豆蚜基因组中筛选出一个组织蛋白酶K基因（ApCtsk1），分析ApCtsk1的氨基酸序列结构域特征并构建系统发育树；其次，解析ApCtsk1在不同组织和发育阶段的表达模式；最后，基于RNAi技术，利用膜取食系统将dsRNA递送至豌豆蚜体内，研究ApCtsk1在豌豆蚜个体发育和繁殖中的生物学功能。研究结果为RNA干扰技术筛选防治害虫新的靶标基因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究中的参试豌豆蚜由甘肃农业大学植物保护学院害虫综合防治实验室提供；挑取单头豌豆蚜置于蚕豆幼苗上饲养并建立种群，豌豆蚜与蚕豆植株置于人工气候箱［温度：（20±1） °C，相对湿度：70%±5%，光周期：16 h光照/8 h黑暗］饲养。

1.2 研究方法

1.2.1 组织蛋白酶K基因的鉴定与分析

从豌豆蚜基因组中筛选出组织蛋白酶K（ApCtsk1）基因，NCBI下载ApCtsk1基因的碱基序列和氨基酸序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。利用ExPASy Proteomics Server （https：//web.expasy.org/protparam/）计算ApCtsk1基因的多个物理和化学参数（氨基酸数量、分子量及理论等电点）；应用在线网站SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）对蛋白质的二级结构进行预测；在NCBI中使用Domain & Structures的CDD工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测蛋白质的保守结构域；通过SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/expasy.org）的同源建模法^［35］对组织蛋白酶B蛋白三维结构进行预测；从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载麦无网长管蚜（Metopolophium dirhodumus）、马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）、桃蚜（Myzus persicae）等11种昆虫的组织蛋白酶基因的蛋白序列，利用MEGA 11软件中的邻接法^［36］构建系统进化树，各分支的置信度经bootstrap法^［36］进行1000次循环检验。

1.2.2 豌豆蚜不同组织、不同龄期ApCtsk1基因的表达模式分析

试验于2022年7月-2023年3月在甘肃农业大学植物保护学院的害虫综合防治实验室进行。

不同发育阶段的样品收集：分别收集在蚕豆叶片上饲养的不同龄期（1~4龄，成虫）的豌豆蚜各20、15、10、5头。样品经液氮冷冻后置于-80 °C冰箱供试，每组处理设置4次重复。

不同组织的样品收集：将豌豆蚜饲养至成虫后，置于冰上解剖。分别收集50头豌豆蚜的头、胸、腹、中肠、卵巢、表皮组织，经液氮冷冻后保存至-80 ℃冰箱供试。每组处理设置4次重复。

利用Trizol试剂法^［37］提取豌豆蚜不同龄期、不同组织的RNA。使用NanoPhotometer NP80 Touch（IMPLEN GMBH，德国）对RNA的完整性、纯度和浓度进行了评估。采用TaKaRa反转录试剂盒（PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser）去除gDNA并合成cDNA第一条链。

以上述合成的cDNA为模板，根据豌豆蚜ApCtsk1（登录号：NM_001135939.1）的CDS序列，利用Primer Premier 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）设计RT-qPCR引物（表1）。豌豆蚜的EF1α（GenBank登录号：AY219737.1）和RPL7（GenBank登录号：NM_001135898.1）为内参基因。使用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒（Novoprotein，中国）进行RT-qPCR检测。PCR反应体系（10 μL）：2×NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus 5.0 μL，正反向引物（10 µmol·L^-1）各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，RNase-Free water 3.3 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。溶解曲线温度为65~95 ℃。每个处理进行4次生物学重复，采用相对定量2^-ΔΔCt法^［38］计算目标基因的相对表达量。

1.2.3 豌豆蚜ApCtsk1的RNAi

以cDNA为模板，基于豌豆蚜ApCtsk1的序列，利用在线工具Primer Premier 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）设计合成dsRNA的引物（表2），通过PCR扩增目的干扰片段，利用天根DP219-02琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对所得PCR产物回收，并连接转化，验证菌液PCR，验证无误后利用天根公司质粒抽提试剂盒回收质粒，以获得的高浓度DNA为模板，利用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit试剂盒进行dsRNA合成，将所得的dsRNA置于-80 ℃保存。

采用双层泊拉膜固定蔗糖溶液（20%~35%）+dsRNA（500 ng·μL^-1）的方法递送。膜取食系统所需要的实验材料均提前在紫外灯（HCB-900V，中国）下灭菌处理，制作过程在超净工作台中进行。首先将饥饿处理12 h的3龄豌豆蚜若虫转移至一端由Parafilm膜封口的短玻管（直径：2.5 cm，高度：3 cm）中，另一端封口后取100 μL饲料点在一端的Parafilm膜中央，另取一层Parafilm膜固定，使人工饲料均匀平铺在两膜之间（24 h后更换饲料）。倒置30 s，待蚜虫固定取食后正置在短玻管架上，盖上黄纸片，置于培养箱中培养。以dsGFP为对照，共设2组处理，每组处理进行4次生物学重复，每次重复30头蚜虫。

在干扰过程中，每12 h统计豌豆蚜的死亡数量。待蚜虫取食dsRNA 48 h后，分别收集每组处理中每次重复的10头若蚜作为样本，经液氮冷冻后保存至-80 ℃冰箱供试。提取样本总RNA，RT-qPCR检测靶标基因的表达量，并计算沉默效率，公式为：沉默效率（%）=（1-dsApCtsk1处理的ApCtsk1相对表达量）×100，基因的沉默效率与基因的相对表达量直接相关。当基因的沉默效率高时，意味着目标基因的表达量被显著抑制，因此其相对表达量会降低。反之，当基因的沉默效率低时，目标基因的表达量抑制不明显，其相对表达量则相对较高。为观察取食dsRNA对蚜虫生长表型的影响，随机挑选每组处理中每次重复的不同样本置于体视显微镜（SZX2-ILLTQ，中国）下观察拍照记录表型，并测量体长体宽等参数指标。经dsRNA处理后的若蚜置于培养皿中单头饲养，同样设2组处理，每组处理重复8次。每隔12 h观察一次，连续观察7 d，记录成蚜平均产蚜数。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel 2019、SPSS 23.0软件进行数据整理和统计分析，显著性检验采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性标准；使用Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 豌豆蚜ApCtsk1基因的鉴定及生物信息学分析

基于豌豆蚜的基因组数据库，本研究筛选出豌豆蚜组织蛋白酶K基因ApCtsk1（登录号：NM_001135939.1），利用ExPASy Proteomics Server分析发现ApCtsk1编码的氨基酸长度为558 aa，蛋白质分子量为63.5 kDa，理论等电点为5.51，属于酸性蛋白质。随后，对ApCtsk1编码的蛋白二级结构预测发现其主要由α螺旋、β折叠、无规则卷曲以及延伸链组成。其中无规则卷曲在二级结构中含量占比最高，β折叠在二级结构中的含量占比最低（图1a）。利用SWISS-MODEL在线网站对组织蛋白酶B蛋白的三级结构进行预测发现，ApCtsk1编码的氨基酸与模型数据库中高粱蚜cfaD_1编码的序列同源性为91.04%（图1b）。采用SMART软件对豌豆蚜ApCtsk1蛋白结构域进行分析，结果如图所示（图1c），其蛋白结构不具有跨膜结构域，但含有木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1保守结构域（339~557 aa），这表明筛选得到的目的蛋白序列为豌豆蚜半胱氨酸蛋白酶序列，有着较高的保守性。值得注意的是，ApCtsk1还具有一个组织蛋白酶前体抑制结构域I29（252~309 aa），此结构域位于一些C1肽酶的N-末端，如Cathepsin L，起着前体肽的作用。系统进化树分析发现，麦无网长管蚜消化型半胱氨酸蛋白酶3-like、马铃薯长管蚜未命名蛋白产物和豌豆蚜组织蛋白酶K聚为一个分支，说明豌豆蚜ApCtsk1与同属的麦无网长管蚜和马铃薯长管蚜亲缘关系较近（图2）。

2.2 豌豆蚜ApCtsk1基因的时空表达分析

豌豆蚜ApCtsk1基因在不同发育阶段的表达模式如图3A所示，其在各个发育时期均检测到表达量，且在4龄若蚜期显著高表达；豌豆蚜ApCtsk1基因在不同组织中的表达模式如图3B所示，其在不同组织中均检测到表达量，值得注意的是其在腹部、卵巢、表皮显著高表达（P<0.05）。

2.3 豌豆蚜ApCtsk1基因的功能验证

对豌豆蚜3龄若蚜ApCtsk1基因进行干扰。结果如图4A所示，在干扰48 h后，ApCtsk1的表达量与dsGFP对照组相比显著降低。沉默效率达82.5%，（1-0.175）×100%=82.5%，0.175即图4A RNAi后ApCtsk1的相对表达量。结果证明对此基因的干扰可以有效地抑制其在豌豆蚜体内的表达。

如图4B所示，与对照组相比，dsApCtsk1处理过的豌豆蚜累计死亡数逐渐升高且最终显著高于对照组。经dsApCtsk1处理的3龄若蚜在各时间点的死亡率分别是3.33%（12 h）、7.78%（24 h）、10.00%（36 h）、22.22%（48 h）。这些结果表明，注射dsApCtsk1的豌豆蚜若虫体内基因的表达被抑制，并且导致死亡率显著增加。

如图4C所示，3龄若蚜经过dsApCtsk1处理48 h后的体长、体宽均显著小于dsGFP对照组。具体来说，经过dsGFP处理的豌豆蚜体长平均值为（1.479±0.038） mm，与之相比，经dsApCtsk1处理的豌豆蚜体长缩短12.56%；而经过dsGFP处理的豌豆蚜体宽平均值为（0.435±0.004） mm，对应的体宽缩短13.22%。这些结果表明，dsApCtsk1处理对豌豆蚜的形态大小产生了显著的抑制效果。

如图4D所示，干扰3龄若蚜ApCtsk1基因24 h时均未观察到蜕皮异常现象。dsRNA处理48 h后，蚜虫出现体型变小、体色异常、行动迟缓的共同现象，这与对照组明显不同。干扰后，对照组dsGFP处理的豌豆蚜能顺利地蜕去躯干表皮，头、胸及腹部均可蜕皮而出，且体色正常，腹部圆润饱满。然而，dsApCtsk1处理的蚜虫从后足表现出蜕皮困难，旧表皮缠绕在后足上，使其行走不便，最终导致死亡。

豌豆蚜取食了dsApCtsk1后，将其转移至蚕豆叶片单头饲养，每天统计产蚜数。统计发现，经处理的豌豆蚜繁殖力受到一定的影响，它们的产蚜时间延迟，产蚜量减少（图4E）。从开始产蚜起，在1~7 d之间，对照组和处理组的雌蚜单日平均产蚜数大致呈先上升后下降的趋势。在1~4 d之间，dsGFP组成蚜的单日平均产蚜量显著高于dsApCtsk1组的成蚜，而在5~7 d期间，dsApCtsk1处理的豌豆蚜产蚜量有所回升与对照组趋于一致。结果表明，dsApCtsk1影响了豌豆蚜的繁殖过程。

3 讨论

作为世界范围内重要的农业害虫，豌豆蚜对农作物的质量和产量构成了严重威胁，因此开发新的策略防治豌豆蚜以减少杀虫剂的使用将是未来农业发展的重要选择之一。研究表明，组织蛋白酶在昆虫的生长发育、消化生长和繁殖等生命过程中发挥着不可或缺的作用^{［30，39-42］}。本研究以豌豆蚜为对象，探究ApCtsk1在豌豆蚜体内的功能，系统发育树分析发现，豌豆蚜ApCtsk1与半翅目蚜科昆虫的半胱氨酸蛋白酶聚为一支，说明它们在进化关系上同源关系更近。作为蚜虫体内一类重要的水解酶，研究该基因的功能，既可以了解其在豌豆蚜体内的功能，又可以为RNA干扰技术筛选防治害虫新的靶标基因提供理论依据。本研究对ApCtsk1在豌豆蚜不同龄期的转录水平分析发现，其表达大致为先上升后下降的趋势。棉蚜组织蛋白酶基因AgCb-2、AgCb-4在不同发育阶段的表达量也呈现先升高再下降的趋势^［43］。研究发现，组织蛋白酶K在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的肠道中并不表达，而在胚胎中高表达^［44］。柞蚕（Antheraea pernyi）蛹期的卵巢中组织蛋白酶B的活性在卵巢整个发育过程中呈递增趋势，在化蛹第10天达到峰值，并在卵中也检测到组织蛋白酶B的存在，推测组织蛋白酶B可能在柞蚕卵巢发育过程中起到分解卵黄蛋白的作用^［45］。而本研究ApCtsk1在豌豆蚜腹部、卵巢、表皮的显著高表达，暗示其极有可能参与豌豆蚜的个体发育和繁殖过程。通过对经dsApCtsk1处理3龄若蚜的表达水平进行定量检测发现，若蚜体内ApCtsk1的表达水平受到明显抑制，表明RNA干扰技术对昆虫靶标基因的特异性干扰效果明显。dsApCtsk1处理后，豌豆蚜的累计死亡率逐渐升高并最终显著高于对照组。在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的研究中，5龄幼虫经dsRNA-SeCath-D处理后化蛹出现异常且死亡率达25%^［46］。刘金萍^［47］在对棉蚜的ApCathB01基因干扰后发现，蚜虫在29 ℃条件下的存活率显著下降。dsApCtsk1处理后，豌豆蚜的体长和体宽明显受到抑制，不仅如此，豌豆蚜还出现了蜕皮异常和致死现象。在对赤拟谷盗的TccatL13进行干扰后也发现成熟的子一代幼虫表现出体长和体宽急剧下降的表型，随后将产卵量统计试验与后代生长发育数据相结合发现TccatL13可促进肠道食物营养的水解从而影响幼虫的生长发育^［48］。Rauf等^［49］通过植物介导的RNA干扰沉默MpCath-L基因时，桃蚜成虫的死亡率显著上升到80%。与此同时，其繁殖力也出现了明显的下降，若虫发育出现延迟。经dsApCtsk1处理后的豌豆蚜繁殖能力也受到一定影响，表现为产蚜时间推迟和一段时间内产蚜量的减少。组织蛋白酶影响着生物体的潜在繁殖力，这些酶在卵巢中的激活过程看起来非常复杂，它们会受到包括性激素在内的多种不同因素的调节，但任何组织蛋白酶活性水平的改变都可能导致对生殖的不利^［50］。综上所述，豌豆蚜ApCtsk1基因在其发育、存活与繁殖过程中发挥重要的作用。

4 结论

本研究筛选得到豌豆蚜组织蛋白酶K基因（ApCtsk1），并对其进行生物信息学分析。同时解析了ApCtsk1在豌豆蚜不同发育阶段以及不同组织的特异性表达，功能验证揭示了ApCtsk1在豌豆蚜个体发育、存活和繁殖过程中存在重要的作用。研究结果为深入理解昆虫组织蛋白酶K基因功能、聚焦害虫防控靶标研发提供了重要参考和理论基础。

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基金资助

甘肃省种业攻关计划项目(GYGG-2024-7)

甘肃省自然科学基金项目(20JR5RA028)

甘肃省高等学校创新基金项目(2022A-060)

甘肃农业大学公招博士科研启动项目(GAN-KYQD-2019-28)