基于Meta评估生防菌剂对饲草作物真菌病害防效及其影响因素

Effect of biocontrol agents to control forage crop fungal diseases and factors influencing their effectiveness： A Meta-analysis

摘要

真菌病害是制约饲草作物优质高产的主要因素，生防菌剂因其环保、无害的特点成为病害绿色防控的首选，其对饲草作物真菌病害的总体防效及其影响因素亟待明确。本研究搜集截至2024年3月已发表的文献共24篇（79组病害防控数据），采用Meta分析方法系统评估了芽孢杆菌、木霉、丛枝菌根真菌等常见生防菌剂对苜蓿、燕麦、青贮玉米、黑麦草、三叶草、箭筈豌豆和鸭茅等主栽饲草广泛发生的根腐病、锈病、白粉病、叶斑病和炭疽病的防控效果，同时探讨了影响其防效的多种因素并量化了其防效。结果表明，生防菌剂对饲草作物真菌病害具有显著防控效果，其总体平均防效达49.85%。异质性检验表明病原种类、菌剂浓度、施用次数、作物种类、病害类型和菌剂类型6种因素显著影响防效，而试验类型、施用模式和生防菌种的影响不显著。综合而言，1） 生防菌剂对主要饲草作物苜蓿和燕麦的根腐病、白粉病的防效均高于总体平均防效；2） 生防菌应针对病原菌筛选特异高效的菌种；3） 兼顾经济和防效时生防菌剂浓度宜采用10⁸ CFU·mL ^-1，施用次数为2次。本研究结果为后续研究以及实际生产中应用生防菌剂防控饲草作物真菌病害提供了切实的依据。

Abstract

Fungal diseases significantly constrain the productivity and quality of forage crops. Biocontrol agents， recognized for their ecological compatibility and safety， have emerged as the favored method for plant disease management. Further research is needed to elucidate the overall efficacy of these agents in controlling fungal diseases in forage crops， as well as the factors influencing their effectiveness. Based on 24 papers published by March 2024 on the use of biocontrol agents （Bacillus， Trichoderma， and arbuscular mycorrhizal fungi. etc） to control root rot， rust， powdery mildew， leaf spot， and anthracnose disease of major forage crops such as alfalfa （Medicago sativa）， oat （Avena sativa）， silage maize （Zea mays）， ryegrass （Lolium perenne）， alsike clover （Trifolium hybridum）， common vetch（Vicia sativa）， and orchardgrass（Dactylis glomerata）， we conducted a Meta-analysis to evaluate the effect of biocontrol agents to control diseases of forage crops， and to analyze the impacts of a variety of factors on the effectiveness of control. The results show that biocontrol agents are remarkably effective in controlling fungal diseases of forage crops， with a total biological control effect of 49.85%. Heterogeneity testing revealed that the pathogen species， the type， concentration， and application frequency of the biocontrol agent， the forage crop species， and the disease type were the factors significantly impacting the effectiveness of control. However， the type of experiment， application mode， and biocontrol species had no significant impact on the effectiveness of control. Overall， the analysis showed that： 1） Compared with the overall average control effect， the biocontrol agents had stronger control effects on root rot and powdery mildew in major forage crops such as alfalfa and oat. 2） Biocontrol species should be screened to identify specific and highly effective strains targeting pathogens. 3） Considering both the economic cost and control effect， the concentration of biocontrol agents should be 10⁸ CFU·mL ^-1 and the number of applications should be two. The findings of this study provide practical guidelines for the use of biocontrol agents in actual production to control fungal diseases of forage crops， and pointers for future research.

Graphical abstract

关键词

生防菌剂 / 饲草作物 / 病害 / 防效 / Meta分析

Key words

biocontrol agent / forage crop / disease / control effect / Meta-analysis

饲草作物（forage crops）指用于放牧或生产干草和青贮饲料的多年生牧草、一年生饲草及不以收籽实为目的的粮食作物等，其地位与粮食、油料、棉花（Gossypium spp.）、蔬菜和糖料等一致^［1］。近年来，我国草牧业发展迅速，苜蓿（Medicago sativa）、燕麦（Avena sativa）、青贮玉米（Zea mays）、黑麦草（Lolium perenne）、三叶草（Trifolium hybridum）、箭筈豌豆（Vicia sativa）和鸭茅（Dactylis glomerata）等饲草作物种植区域和面积逐年增加。以传统粮食作物种植为主的重庆市为例，至2025年域内饲草作物种植面积将由3万hm²增加至4万hm²，增幅达25.00%。然而，普遍发生的真菌病害严重制约着饲草作物的健康稳定生产^［2-3］。使用化学农药是常用的病害防控手段，但其在以收获营养体为目标的全株饲草上的残留对家畜以及人类的危害巨大^［4］。对病原真菌具有拮抗作用的微生物可利用重寄生、抗生作用、竞争作用或诱导寄主抗性等机制达到防控病害的目的^［5］，所开发的生防菌剂具有环境友好、安全无害、防效持久等优点^［6］，是饲草作物病害绿色防控的理想途径。

生防菌剂在粮食作物病害防控中应用广泛，年均防病面积超1100万hm^2［7］。与之相比，尽管饲草作物病害生防研究起步较晚且基础薄弱，但其未来可应用推广的前景巨大，大力开展相关研究对推动饲草产业健康可持续发展具有重要意义。然而，以往研究表明，生防菌剂的防控效果易受各种因素的影响，如使用的菌种、剂型、浓度以及环境因素等是导致病害生防效果不稳定的可能因素^［8-9］。张睿芳等^［10］采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）防控燕麦叶斑病时发现其防效有明显差异，其中枯草芽孢杆菌防效高达80.34%，而冶福春等^［11］使用枯草芽孢杆菌防控该病时防效仅为38.80%。因此，亟须系统分析并明确影响饲草作物真菌病害生防效果的关键因素，为科学指导其理论研究以及推动相关产品在饲草产业实际生产中发挥稳定、高效的防控效率奠定基础。

Meta分析（Meta-analysis）可将诸多相同主题的研究及其结果汇总整合，系统地进行定量化统计分析，得出影响某个处理措施效果的主要因素^［12］。本研究汇总了以往公开发表的关于生防菌剂防控饲草作物病害的中文研究文献，采用Meta分析系统研究全国区域内施用生防菌剂对饲草作物真菌病害的综合防效，进一步评估菌剂本身因素及环境因素对防效的影响程度，所得结果为饲草作物生防菌剂开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 文献收集

本研究文献数据来源于中国知网（China national knowledge infrastructure， CNKI）、万方数据库和维普数据库。为了全面筛选生防菌剂防控饲草作物真菌性病害的相关文献，分别以我国主要饲草作物苜蓿、燕麦、青贮玉米、黑麦草、三叶草、箭筈豌豆和鸭茅搭配根腐病、锈病、霜霉病、黑穗病、白粉病、叶斑病和炭疽病作为检索词进行搜索，截止时间为2024年3月1日。生防菌种与菌剂类型以检索到的文献中所提供的信息为准，主要包括隶属于芽孢杆菌属（Bacillus）、木霉属（Trichoderma）、丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi， AMF）等的物种。

1.2 文献筛选

文献筛选标准为：1） 包括一个不施用生防菌剂的对照组；2） 具有病情指数指标的均值、重复数（至少3个重复）；3） 数据重复的文献仅选其中之一；4） 如果一篇文献中包括多个地点的数据，将其视为独立数据。根据以上标准，研读文献并去除不符合的文献。

本研究将符合的24篇文献^{［10-11，13-34］}中的79组数据纳入Meta分析，并汇总以下数据信息：施用生防菌剂的处理组（t）和未施用生防菌剂对照组（c）病情指数的均值（X）、重复数（N）和标准差（standard deviation， SD）。若文献中给出的是标准误（standard error， SE），则采用如下换算公式获得SD：

SD=SE\sqrt[]{N}（1）

若文献没有包括SD或SE值时，SD被指定为平均值的1/10^［35］。此外，提取汇总作物种类、生防菌种、试验类型、菌剂类型、施用模式、病害类型、病原种类、施用次数以及菌剂浓度（CFU·mL ^-1）等数据。数据收集过程中，文献中表格和正文中的数据直接提取，图片数据采用GetData Graph Digitizer（V.2.26.0.20）软件提取。

1.3 数据分析

本研究采用Meta分析评估生防菌剂对饲草作物真菌性病害的防效及其影响因素。Meta分析采用R软件的Metafor包，根据病情指数指标计算效应值（effect size， E）及其95%置信区间，E值大小表征影响因素对生防菌剂防效的影响强弱。采用自然对数转换的响应比（response ratio， RR）量化效应值，计算公式为：

E=RR=\mathrm{l}\mathrm{n}\left(\frac{X_t}{X_c}\right)（2）

式中：X_t 和X_c 分别为处理组和对照组病情指数平均值。与效应值相对应的研究内方差（v）的计算公式为：

v=\frac{S{D}_t^{\mathrm{2}}}{N_t\times X_t^{\mathrm{2}}}+\frac{S{D}_c^{\mathrm{2}}}{N_c\times X_c^{\mathrm{2}}}（3）

式中：SD_t 和SD_c 分别为处理组和对照组的标准差，N_t和N_c分别为处理组和对照组的重复数。

在使用Metafor软件包进行合并分析之前，要对效应值进行异质性检验和发表偏倚检验。异质性检验标准是如果其Q值显著性检验值P<0.05，表示异质性强，需采用随机效应模型并引入解释变量（本研究为影响因素）进一步深入分析，反之则表示异质性弱并采用固定效应模型。发表偏倚检验采用失安全系数法（fail safe number），所得N值大于5k+10（k为研究的个数）则说明无发表偏倚，Meta分析结论科学可靠。

采用随机效应模型评估解释变量的加权平均效应值（E₊ ）和95%置信区间，如果E₊ 的95%置信区间不与零重叠，则表示该因素对防效的影响具有显著性。研究中方差（τ）的估计使用限制性最大似然法（restricted maximum likelihood， REML），计算公式为：

E_{+}=R{R}_{+}=\frac{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^k{w}_{i}R{R}_i}{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^k{w}_i}（4）

w_i=\frac{\mathrm{1}}{v_i+{\tau }_i}（5）

\mathrm{95}\mathrm{\%}\mathrm{置信}\mathrm{区间}=E_{+}\pm \mathrm{1.96}\times \sqrt[]{\frac{\mathrm{1}}{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^k{w}_i}}（6）

式中：w_i 为单个研究权重；k为研究个数；v_i 为研究内方差。

1.4 数据处理

利用Excel 2021软件进行文献数据汇总，利用R语言中的“ggplot 2”包和Adobe Illustrator 2022软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 生防菌剂对饲草作物真菌性病害的总体防效

基于病情指数进行Meta分析得出的总体平均效应值E为-0.6905，根据自然对数响应比公式换算得出，施用生防菌剂可显著降低饲草作物真菌性病害的病情指数，总体防效为49.85%（表1）。异质性Q值检验得出其显著性P<0.0001，表明异质性极强，需进一步引入解释变量进行分析。此外，失安全系数法检验发表偏倚结果显示N值为3343，而5k+10=405，表明本研究中Meta分析结果受发表偏倚的影响不大，结论可靠。

2.2 影响生防菌剂对饲草作物真菌性病害防效的主要因素

对9个解释变量引起的异质性Q值及其显著性检验值进行分析（表2），得出作物种类、菌剂类型、病害类型、病原种类、施用次数和菌剂浓度6个影响因素QM显著性检验值P_QM<0.05，表明其对生防菌剂防控饲草作物真菌性病害有显著影响；而生防菌种、试验类型和施用模式P_QM>0.05，说明其影响较小。

2.3 作物种类对生防菌剂防效的影响

饲草作物种类对生防菌剂防效的影响显著不同（图1a）。具体而言，生防菌剂对三叶草和青贮玉米真菌性病害的防控效果不显著，对苜蓿（防效为63.65%）、燕麦（50.14%）、鸭茅（51.86%）、黑麦草（65.18%）和箭筈豌豆（37.69%）等5种饲草作物病害具有显著的防控作用（图1b）。

2.4 菌剂类型对生防菌剂防效的影响

3种菌剂类型的平均效应值相差较大且置信区间均小于0，表明单独施用液体菌剂、固体菌剂或复合施用固体和液体菌剂均对饲草作物病害的生防效果具有显著影响（图2a）。3种菌剂类型对饲草作物病害的防效为40.37%~69.88%（图2b），其中复合施用固体和液体菌剂的防效最高，而单独施用固体菌剂的防效最低。

2.5 病害类型对生防菌剂防效的影响

施用生防菌剂对饲草作物的炭疽病、叶斑病、白粉病、根腐病和锈病等真菌性病害均有显著的防效，其效应值置信区间均小于0（图3a）。在根腐病的防控中，生防菌剂的防效最高，达到了64.87%；白粉病（59.75%）、叶斑病（46.63%）、炭疽病（45.17%）依次降低，锈病防效最低，为43.22%（图3b）。

2.6 病原种类对生防菌剂防效的影响

病原种类对生防菌剂防效的影响显著不同（图4），18种病原中互隔链格孢（Alternaria alternata）、玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）、大斑凸脐蠕孢（Exserohilum turcicum）、菠菜炭疽菌（Colletotrichum spinaciae）、白粉菌（Erysiphe sp.）、半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）和条形柄锈菌（Puccinia sorghi）置信区间与0重叠，表明生防菌剂对这7种饲草作物常见病原的防效不显著，对其余11种病原具有显著防效（44.23%~82.59%）。

2.7 施用次数对病害生防效果的影响

不同施用次数的效应值置信区间均小于0，表明其对生防菌剂的防效均具有显著影响（图5）。具体而言，施用生防菌剂2次的防效最高，达到77.58%；施用1和4次的防效接近，分别为48.68%和45.23%。

2.8 菌剂浓度对病害生防效果的影响

不同菌剂浓度的效应值置信区间均未与0重叠，说明其对生防菌剂的防效具有显著影响（图6）。其中，当生防菌剂浓度≥10⁹ CFU·mL ^-1时，其防效可达80%以上；当浓度在10⁷ CFU·mL ^-1时，其防效最差，仅为44.68%。

3 讨论

本研究汇总提取了79组生防菌剂防控饲草作物病害的现有文献数据，采用Meta分析得出以有益细菌或真菌为主的微生物菌剂对苜蓿、燕麦、青贮玉米等主要饲草作物常见真菌病害具有显著的防控效果，其总体平均防效达到49.85%。对各影响因素引起的异质性Q值及其P值进行排序得出，病原种类、菌剂浓度、施用次数、作物种类、病害类型和菌剂类型6种因素对生防菌剂防效影响显著且其影响程度依次降低，而试验类型、施用模式和生防菌种的影响不显著。

3.1 病原种类影响生防菌剂的防效

生防菌剂防控饲草作物病害的防效会因病原菌的不同而变化。首先，本研究发现生防菌剂对同属不同种的病原防效具有显著差异，分别防控4种炭疽菌属（Colletotrichum）和镰刀菌属（Fusarium）病原时，对其中的菠菜炭疽菌和半裸镰刀菌的防效不显著。徐伟芳等^［36］使用生防细菌抑制4种炭疽病菌时也发现其抑菌率差异很大，说明不同菌种与生防菌之间的互作具有特异性。究其原因，一方面可能与病原真菌孢子的传播和生存能力有关。菠菜炭疽菌依靠镰形的分生孢子传播和侵染植物寄主，可传播至菠菜（Spinacia oleracea）、箭筈豌豆、黄芪（Astragalus membranaceus）、紫云英（Astragalus sinicus）以及藜麦（Chenopodium quinoa）等不同科属植物叶片上生存并引致病害^［37-41］，且在15~33 ℃的温度下该菌分生孢子生长良好且均可导致病害^［37］。Oliveira等^［42］以不同接种浓度测定半裸镰刀菌对甜瓜（Cucumis melo）寄主的致病性时得出，最小的接种浓度（10孢子·mL ^-1）依然可以导致病害，说明其孢子具有强大的生存能力。另一方面可能与病原真菌产生的次生代谢产物有关。有研究表明，菠菜炭疽菌产生的20-羟基蜕皮素、2，3，10，11-tetrahydropyrenophorol、β-谷甾醇等次生代谢产物是首次从炭疽菌属物种中分离得到的特有次生代谢物^［43］，其中β-谷甾醇具有广泛的抗菌活性^［44-45］。本研究中其他镰刀菌属物种与半裸镰刀菌不同的是其可产生Fusapyrone和Deoxyfusapyrone两种抗菌次生代谢产物^［46］。其次，生防菌剂虽然对内脐蠕孢菌属（Drechslera）的Drechslera avenae以及炭疽菌属的C. lentis和C. graminicola的拮抗有显著性，但其防效均低于总体平均防效，今后应重点开展针对这3种主要病原真菌的生防菌剂研究。病原真菌是引起饲草作物病害的核心角色，本研究认为针对其生防菌剂筛选的策略应以特异性为首要，广谱性为次要，着重研究生防菌种与病原真菌之间的作用靶点以及互作机制，为高效防控奠定基础。

3.2 菌剂浓度和施用次数影响生防菌剂的防效

本研究得出菌剂浓度和施用次数均对生防菌剂的防效具有显著影响，结果符合预期。本研究中10⁶、10⁹、10¹¹ CFU·mL ^-1菌剂浓度所纳入的研究文献数据较少，其结果不具有代表性，此处不予讨论。研究中常用的菌剂浓度是10⁷和10⁸ CFU·mL ^-1，其中10⁸ CFU·mL ^-1的生防菌剂防效更优。菌剂浓度决定了施用后参与拮抗病原真菌的生防菌细胞数量，其拮抗策略主要包括营养竞争、产生抑菌物质或诱导寄主抗性等^［47］，更大的菌剂浓度有助于生防菌建立更大的优势，以提升防控效果。施用次数也与生防菌的细胞数量有关，但并非次数越多就防效越好。本研究得出生防菌剂施用2次时防效最好，而施用1或4次的防效均低于总体平均防效。唐清等^［48］采用不同杀菌剂并设置1至4次施用次数防控小麦（Triticum aestivum）赤霉病时也发现大多数杀菌剂施用2或3次时防效较好。在实际生产中，要想采用生防菌剂替代化学农药进行病害防控，除了生防菌本身的抑菌能力之外，还需要考虑菌剂生产和施用的成本。综合成本和防效因素，本研究建议菌剂浓度为10⁸ CFU·mL ^-1，施用次数2次。

3.3 作物种类影响生防菌剂的防效

本研究得出，生防菌剂对豆科饲草三叶草、箭筈豌豆和禾本科青贮玉米的真菌病害防效不佳。其中，三叶草病害生防效果不佳可能是由于纳入研究的样本量太小导致的。近年来，红三叶、白三叶因其抗逆性强、营养价值高而被广泛应用于天然草地改良、人工草地建植以及林下种草等草牧业生产中^［49-50］，但其病害研究长期被忽视，采用生防措施防控更是欠缺，今后应加大此方面的研究。箭筈豌豆和青贮玉米对其真菌病害生防效果的影响可能与其自身抗性对生防菌的响应有关。研究表明，生防菌诱导寄主植物产生系统抗性（induced systemic resistance， ISR）是其防治病害的策略之一，如诱导植物产生病程相关蛋白（plant pathogenesis-related protein， PR蛋白）、细胞壁木质素以及抗氧化酶等物质参与抗病^［51］。因此，本研究推测相较于苜蓿等饲草作物，可能生防菌诱导箭筈豌豆和青贮玉米产生的系统抗性较小，导致防效较差。此外，生防菌在植物寄主上的定殖量与生防效果息息相关^［52］，箭筈豌豆和青贮玉米根际或叶际等部位分泌的物质可能是影响生防菌防效的重要因素。因此，研究并阐明生防菌剂与饲草作物互作方面的机理或许是提高生防效果的有效途径。

3.4 病害类型和菌剂类型影响生防菌剂的防效

病害类型显著影响生防菌剂的防效，结果显示生防菌剂对饲草作物根腐病的防效（64.87%）最好，对白粉病（59.75%）次之，而对叶斑病（46.63%）、炭疽病（45.17%）和锈病（43.22%）的防效均低于总体平均防效。扈进冬等^［53］探究影响生防木霉菌剂防效因素时发现病害类型也显著影响生防效果，但对根腐病和白粉病的防效较低，本研究结果与其相反。根腐病和白粉病是苜蓿、燕麦等主栽饲草作物的主要病害，其生防菌包含细菌和真菌^［13-14］，多样的生防菌种可能提升了该病害的防效。值得注意的是，南方地区青贮玉米等饲草种植面积逐年增大^［15］，其适宜的温湿条件使得锈病的发生日益严重，但生防研究还很薄弱，未来应加大此方面研究。此外，菌剂类型也显著影响生防菌防效。固体加液体菌剂的样本量小，不予讨论。单独施用时液体菌剂防效优于固体菌剂，操一凡等^［8］评估木霉菌防效时发现固体菌剂优于液体菌剂，本研究结果与其相反。与该研究不同的是，本研究中固体菌剂菌种以生防真菌为主，而液体菌剂菌种以生防细菌为主。因此，菌剂制备时建议生防真菌以固体菌剂为主，而生防细菌以液体菌剂为主。

3.5 对生防菌剂防效影响不显著的因素

本研究发现生防菌种对饲草作物真菌病害防治效果无显著影响，这是分析79组数据得出的总体结果（P_QM=0.08）。也就是说，本研究中纳入的生防菌种总体上对饲草作物真菌病害的生防效果影响不显著。究其原因，虽然生防菌种是多样的，但其在病害防控中采取的防控策略是类似的，如芽孢杆菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）的生防细菌以及木霉属的生防真菌均可合成次级代谢产物发挥抑菌作用^［54］。此外，试验类型和施用模式对生防效果影响不显著，这与扈进冬等^［53］的结果一致。这可能是由于盆栽和大田等试验类型以及喷施、灌根、层铺等施用模式并不会影响生防菌剂活性物质的释放。

3.6 对饲草作物真菌病害生防研究的启发

Meta整体分析表明生防菌剂对主要饲草作物真菌病害具有显著防效，但总体平均防效尚低于50%，未来可提升的空间很大。结合本研究对影响因素的评估结果，提出以下问题：1） 现有研究主要关注生防菌通过抑菌物质或营养竞争等方式拮抗病原菌，而关于病原菌对生防菌是否有抑制作用研究太少，尤其是在大田环境下；2） 生防菌对饲草作物抗性的诱导以及促生等方面已有研究，而饲草作物对生防菌的影响几乎空白，如作物的代谢产物、内生微生物等是否影响生防菌的定殖和生存；3） 诸多研究表明生防菌在实验室条件下防效很好，但田间应用时防效不佳，田间环境因素对生防菌的影响知之甚少；4） 长期施用生防菌对环境（如草地生态系统）的影响有待研究，如对根际、叶际或土壤微生物以及土壤状况等影响。综上，采用生防菌剂防控饲草作物真菌病害是重要的绿色防控手段，未来应围绕生防菌剂与病原菌、饲草作物、环境之间的相互影响开展全面、系统的研究（图7），为防控饲草作物主要真菌病害的优质菌剂开发提供技术保障。

4 结论

施用生防菌剂对饲草作物真菌病害具有显著的防控效果，但是当病原种类、菌剂浓度、施用次数、作物种类、病害类型和菌剂类型等因素不同时防效会有所差别。总体而言，生防菌种筛选应遵循特异高效的原则，生防菌剂制备时浓度可采用10⁸ CFU·mL ^-1，生防菌剂施用可分2次进行，现阶段生防菌剂对苜蓿和燕麦的根腐病、白粉病的防效较好。本研究基于现有文献数据评估了影响饲草作物真菌病害生防效果的因素，结果为实际生产中应用生防菌剂防控饲草病害提供了参考。同时要注意的是，由于文献数据缺乏，还有其他影响因素未纳入本研究进行整合分析，未来开展生防菌与病原菌、饲草作物以及环境之间的互作研究是必要的，可为充分挖掘生防菌剂对饲草作物病害的防控潜力奠定基础。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2022YFD1300805)

重庆市现代农业产业体系（草食牲畜：CQMAITS202313），重庆市畜牧科学院畜牧科技创新团队培育项目(2452624)

重庆市畜牧科学院市级财政资金项目(24503C)