三江源不同草地类型植被及土壤微生物多样性与土壤因子特征的研究

Vegetation and soil microbial diversity and their relationships with soil factors in different grassland types of the three river headwaters region

摘要

草地生物多样性是保持草地生态系统功能和稳定性的基础，了解不同草地类型植被和土壤微生物多样性及其影响因素，有助于制定科学的保护和修复策略。以三江源不同草地类型为研究对象，通过野外植被群落调查和扩增子测序相结合，探讨了不同草地类型的植被和土壤微生物多样性特征，并分析了其与土壤环境因子的关系。结果表明，三江源地区的高寒草甸、高寒草原和温性草原在植被群落特征、土壤微生物多样性特征以及土壤理化性质方面存在显著差异。高寒草甸具有较高的植被覆盖度和生物量（P<0.05），而温性草原则具有最大的植被高度（P<0.05）。在土壤真菌方面，高寒草甸Faith’s-pd指数显著大于温性草原和高寒草原（P<0.05），而Simpson和Shannon-Wiener指数显著小于温性草原和高寒草原（P<0.05）；在土壤细菌方面，高寒草原的Chao1指数和Faith’s-pd指数显著小于温性草原和高寒草甸（P<0.05），而Simpson和Shannon-Wiener指数差异不显著（P>0.05）。土壤环境因子对不同草地类型的植被和土壤微生物群落具有显著影响，其中土壤pH、有机碳（SOC）含量和全氮（N）含量是主要影响因子。研究结果为三江源地区不同草地类型的生物多样性保护和生态修复提供了理论依据。

Abstract

Grassland biodiversity is the basis for maintaining the function and stability of grassland ecosystems. Understanding the diversity of vegetation and soil microorganisms in different grassland types and their influencing factors can help to formulate scientific conservation and restoration strategies. In this study， we investigated the characteristics of vegetation and soil microbial diversity of different grassland types and analyzed their relationships with soil environmental factors by combining field vegetation community surveys and amplicon sequencing， for different grassland types in the Three-River Headwaters Region. It was found that alpine meadows， alpine steppe and temperate steppe in the Three-River Headwaters Region had significant differences in vegetation community characteristics， soil microbial diversity characteristics and soil physicochemical properties. Alpine meadows had higher vegetation cover and biomass （P<0.05）， while temperate steppe had the greatest vegetation height （P<0.05）. For soil fungi， the Faith’s-pd index was significantly greater in alpine meadows than in temperate steppe and alpine steppe （P<0.05）， whereas the Simpson and Shannon-Wiener indices were significantly lower than in temperate steppe and alpine steppe （P<0.05）； and for soil bacteria， the Chao1 and Faith’s-pd indices were significantly lower in alpine steppe than in temperate steppe and alpine meadows （P<0.05）， while the differences between Simpson and Shannon-Wiener indices were not significant （P>0.05）. Soil environmental factors had significant effects on vegetation and soil microbial communities in the different grassland types， among which pH， soil organic carbon content and soil total nitrogen content were one of the main factors of influence. The results of this study provide a theoretical basis for biodiversity conservation and ecological restoration of different types of grasslands in the Three-River Headwaters Region.

Graphical abstract

关键词

三江源 / 植被特征 / 土壤微生物 / 物种多样性 / 高通量测序

Key words

the three river headwaters region / vegetation characteristics / soil microorganism / species diversity / high-throughput sequencing

草地生物多样性是保持草地生态系统功能和稳定性的基础，对牧草生产、维持生态平衡、提供生态系统服务等方面有着至关重要的作用^［1-2］，植被多样性和土壤微生物多样性作为生物多样性的重要组成部分，二者相互影响着草地生态系统的结构和功能^［3-4］。了解不同类型草地植被和土壤微生物多样性及其影响因素，有助于制定科学的保护和管理策略以及维护草地生态系统的健康和功能^［5］。三江源作为全球研究生物多样性重要的地区之一^［6］，生物多样性研究对保护三江源区生态系统的原真性和完整性，维护生态安全和可持续发展等方面具有重要意义^［7］。

三江源地处青藏高原腹地，因其复杂的地形地貌和独特的水热条件，造就了具有特色的草地生态系统，因而植被群落多样性一直备受关注^［8-9］。对三江源不同类型草地研究发现，三江源高寒草地植被种类简单，植被群落多样性指数较低，且植被群落结构与土壤环境存在显著差异，植被多样性与土壤因子耦合协调度整体较低^［10-11］。植被多样性研究过程中发现，湿度对植被多样性影响最大，大气压力和氧气分压对物种多样性也有显著影响^［12］。也有研究表明，过度放牧是造成草地物种多样性降低的主要原因^［13-15］，适当的禁牧能有效增加草地植被的高度、盖度、生物量和物种多样性^［16-17］。然而，以往对不同类型草地研究中，多以高寒草甸和高寒草原为研究对象，作为三江源地区重要草地类型之一的温性草原关注不高。

在生物多样性研究中，土壤微生物多样性的研究也是一个备受关注的焦点。目前，土壤微生物多样性在草地退化、栽培草地及与土壤、气候、人工干预之间关系的研究较多^［18-20］。对青藏高原高寒草地的研究显示，土壤微生物多样性主要受土壤性质控制，且pH对多样性变化的贡献最大，其次是海拔和年均温^［21-23］。同时草地土壤温度升高和水分减少对微生物多样性起主导作用，且微生物多样性与生态系统功能过程之间存在正相关^［19］。但对于三江源区不同草地类型土壤微生物多样性差异研究的偏少，尤其是对占比最大的高寒草甸、高寒草原和温性草原土壤微生物多样性差异不明晰。

基于以上研究基础，本研究以三江源不同草地类型为对象，通过野外植被群落调查和扩增子测序相结合，探讨不同草地类型植被多样性和微生物多样性特征，分析不同草地类型植被和土壤微生物与土壤环境之间的关系，为三江源地区不同类型草地的生物多样性保护和生态修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

三江源是黄河、长江和澜沧江的发源地，被誉为“中华水塔”，是高寒地区生物多样性分布最集中的地区之一，素有“高寒生物种质资源库”之称，也是生态脆弱和气候变化敏感区。三江源位于青藏高原腹地，以山地地貌为主，平均海拔4400 m，年均气温为-5.6~3.8 ℃，年降水量为262.2~772.8 mm，主要集中在6-9月，年蒸发量为730~1700 mm，陆地蒸发量约为360 mm，具有温度低、降水少、蒸发量大等特点，属于青藏高原气候系统^［24］。

三江源区主要草地类型有高寒草甸、高寒草原和温性草原，分别占三江源区总面积的68.14%、24.58%和4.42%^［25-26］。其中高寒草甸原生植被以莎草科高山嵩草（Carex parvula）、矮生嵩草（Carex alatauensis）和冷地早熟禾（Poa araratica）等^［27］为优势种；高寒草原原生植被以禾本科紫花针茅（Stipa purpurea）为建群种，常伴生有草地早熟禾（Poa pratensis）、鹅绒委陵菜（Argentina anserina）、黑褐薹草（Carex atrofusca）等^［28］；温性草原主要分布在三江源东部地区，以西北针茅（Stipa sareptana）、芨芨草（Neotrinia splendens）、青海固沙草（Orinus kokonorica）为原生植被优势种^［29］。

1.2 数据采集方法

本研究于2023年8月植物生长盛期开展了野外调查，调查期间将高寒草甸、高寒草原、温性草原的建群种作为3种原生草地类型的判断依据进行样地布设，样地尽量设在建群种比较明显、植被长势均匀且具有代表性的地段，每个草地类型均设置了6个样地（图1），每个样地随机布设3个1 m×1 m的标准样方，对样方内植被进行分种调查，详细记录每个物种的覆盖度、高度、多度、频度等基础信息，用刈割法采集地上生物量待烘干24 h后称取其干重^［30-31］。土壤理化性质样品采集选用直径7 cm土钻，在每个样方内随机钻取3钻0~20 cm深度土壤并混合，过2 mm筛后的土壤样品用密封袋保存并进行编号，用于土壤pH、全氮（total nitrogen）、全磷（total phosphorus）、全钾（total potassium）、有机碳（soil organic carbon， SOC）含量测定。土壤微生物取样用直径3 cm的土钻钻取0~20 cm土层样品，每个样方取3个重复，混合后取适量的土壤装入无菌管，在冰箱中低温冷冻保存。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化性质测试分析

采用玻璃电极法测定土壤pH值；采用重铬酸钾氧化-外加热法测定SOC含量，每批次样品分析时做空白试验3个；采用硫酸-加速剂消解，凯氏法测定土壤N含量；采用NaOH碱熔，钼锑抗分光光度法测定土壤P含量；采用NaOH碱熔，火焰光度计法测定土壤K含量^［32］。

1.3.2 土壤微生物测序

采集的样品过筛后，根据CTAB试验操作说明，在2 mL离心管中加入样本0.25 g，从土壤样品中提取总DNA。采用通用引物515F和806R扩增土壤中的16S rRNA基因V4区^［33］，采用通用引物ITS5-1737F和ITS2-2043R扩增土壤ITS基因1-5F区^［34］，扩增子测序基于Illumina Miseq测序平台进行。

1.4 多样性计算方法

参照方精云等^［35］的方法，选用Shannon-Wiener指数（Shannon-Wiener index， H）、Simpson指数（Simpson index， D）、Pielou指数（Pielou index， E）、Chao1指数（Chao1 index， C）^［36］、Faith’s-pd指数（Faith’s-pd index， PD_Faith）^［37］进行多样性分析，计算公式如下：

\mathrm{重要}\mathrm{值}(\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{p}\mathrm{o}\mathrm{r}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{n}\mathrm{t}\mathrm{v}\mathrm{a}\mathrm{l}\mathrm{u}\mathrm{e},\mathrm{I}\mathrm{V})=(\mathrm{相对}\mathrm{盖度}+\mathrm{相对}\mathrm{高度}+\mathrm{相对}\mathrm{频度})/\mathrm{3}

H=-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^{\mathrm{S}}}{P}_i\mathrm{l}\mathrm{n}{P}_i

D=\mathrm{1}-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^{\mathrm{S}}}{P}_i^{\mathrm{2}}

E=\frac{H}{\mathrm{l}\mathrm{n}S}

C=S_{\mathrm{o}\mathrm{b}\mathrm{s}}+N_{\mathrm{1}}(N_{\mathrm{1}}-\mathrm{1})/\mathrm{2}(N_{\mathrm{2}}+\mathrm{1})

P{D}_{\mathrm{F}\mathrm{a}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{h}}={\sum }_{i=\mathrm{1}}^n{B}_i

式中：P_i 为样方中第i种植被在群落中所占的重要值；S为种i所在样方的物种总数；S_obs为观测到的代表序列 （operational taxonomic units， OTU）数；N₁为只有1条序的OTU数；N₂为只有2条序的OTU数；n为系统发育树中分支的数量；B_i 为第i个分支的长度。

1.5 数据处理

所有原始数据统计在Excel 2010完成，使用 SPSS 22.0进行单因素方差分析（one-way analysis of variance）和Duncan多重比较检验，在P<0.05差异水平上检测差异显著性；利用Origin 2021和Canoco 5进行制图。

2 结果与分析

2.1 不同草地类型植被群落多样性特征

不同草地类型植被群落特征存在显著差异（P<0.05），高寒草甸覆盖度和生物量最高，温性草原植被高度最大（表 1）。对比物种多样性指数发现，Simpson 和Shannon-Wiener 指数在3种草地类型中均为高寒草甸>高寒草原>温性草原（P<0.05），Pielou指数在高寒草甸和高寒草原间差异不显著（P>0.05），而与温性草原之间差异显著（P<0.05）。高寒草甸拥有最高水平的物种多样性和相对均衡的物种分布，高寒草原次之，而温性草原的物种多样性水平最低。

2.2 不同草地类型土壤微生物特征

2.2.1 土壤微生物多样性特征

土壤微生物的测序深度指数（Good’s coverage）均在0.99以上，说明样本中的土壤细菌基本上能够反映土壤中的真实情况。结果显示，土壤真菌Chao1指数在不同草地类型中差异不显著（P>0.05）；Faith’s-pd指数为高寒草甸>高寒草原>温性草原，高寒草甸与温性草原之间差异显著（P<0.05），而高寒草原与温性草原、高寒草甸之间差异不显著（P>0.05）；Simpson指数为高寒草原>温性草原>高寒草甸（P<0.05）；Shannon-Wiener指数为高寒草甸<高寒草原、温性草原 （P<0.05，图2A）。土壤细菌Chao1指数为高寒草原<高寒草甸、温性草原（P<0.05，图2B）；Faith’s-pd指数为高寒草原<温性草原、高寒草甸（P<0.05）；Simpson指数和Shannon-Wiener指数在3种草地类型之间差异不显著（P>0.05，图2B）。

2.2.2 土壤微生物群落特征

本研究的3种草地类型土壤样本累计读取出真菌分属40门，其中温性草原共有26个门，高寒草甸36个门，高寒草原28个门。所有土壤真菌群落中，除去相对丰度<1%的真菌群落，共统计到5个真菌群落（图3A）。主要优势群落为子囊菌门、担子菌门、灰孢菌门、球囊菌门、壶菌门。对比优势群落在不同草地类型中的丰度差异发现，子囊菌门、灰孢菌门、壶菌门在3种类型草地中差异不显著（P>0.05），而担子菌门在高寒草甸中丰度最高，高寒草原中最低（P<0.05），球囊菌门在温性草原中丰度最高，高寒草原中最低（P<0.05）。累计读取出细菌51门，其中温性草原共有47个门，高寒草甸49个门，高寒草原40个门。所有土壤细菌群落中，除去相对丰度<1%的细菌群落，共统计到10个细菌群落（图3B）。对比3种草地类型发现，高寒草甸土壤中变形菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门丰度较高；高寒草原土壤中放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、浮霉菌门丰度较高；温性草原土壤中酸杆菌门、古菌门丰度较高。同时除了变形菌门、拟杆菌门在不同草地类型中差异不显著（P>0.05），其余优势细菌群落表现出显著差异（P<0.05）。

2.3 不同草地类型土壤理化性质特征

对不同草地类型土壤pH、SOC、N、P、K含量分析对比发现（表2），高寒草甸pH最低，土壤偏酸性，高寒草原和温性草原土壤偏碱性，高寒草甸与高寒草原和温性草原之间差异显著（P<0.05）；土壤SOC和N含量在高寒草甸中最高，在温性草原中含量最低（P<0.05）；P含量在高寒草原中最高，高寒草甸中最低，但无显著差异（P>0.05）；K含量为高寒草甸>温性草原>高寒草原（P<0.05）。

2.4 不同草地类型土壤微生物群落与土壤环境因子的相关分析

土壤理化特征作为植被群落生长及土壤微生物群落丰度的重要影响因素，通过冗余分析（redundancy analysis， RDA）（图4），探讨了不同草地类型植被多样性及微生物多样性与土壤理化特征之间的关系。RDA分析表明：第一、二轴的解释率分别为85.82%，13.97%，累计解释率达99.79%。排序结果可信，能够较好地解释细菌群落与土壤理化因子的关系。分析结果显示：土壤细菌多样性指数与土壤K、N和SOC含量呈正相关，其中K含量的影响最大（P<0.05）；土壤真菌多样性指数与土壤N、pH和SOC含量呈正相关，土壤N含量影响最大（P<0.05）；土壤K、N和SOC含量显著影响植被群落多样性（P<0.05）。土壤理化特征中土壤K含量对植被多样性和土壤微生物多样性影响最大，其贡献率达32.7%（P<0.05），其次是pH和N，贡献率分别为30.6%和24.8%（P<0.05）。

3 讨论

3.1 不同草地类型植被及土壤微生物多样性特征

三江源地区不同类型草地植被及微生物群落组成和结构不同，植被高度、覆盖度、地上生物量、多样性指数等指标特征具有显著差异。本研究结果显示，3种不同类型草地中高寒草甸生物量、盖度、多样性指数及Pielou均匀度指数最高，高寒草原次之，温性草原最低。Tang等^［38］研究显示，高寒草甸植被多样性最高，杨学亭等^［39］对祁连山不同草地类型的土壤理化性质和植被特征研究发现高寒草甸植被多样性最高，其次为高寒草原，本研究结果与之一致。三江源区高寒草甸的水分条件比高寒草原和温性草原相对稍好、物种组成也较丰度、群落结构相对稳定、生物量较高^［40］，高寒草原和温性草原由于土壤水分下降会引起植被群落生产力降低，造成物种多样性降低^{［27，41］}，说明环境因子（水热条件）对植被及微生物多样性和结构分布特征有着一定的调控作用。

进一步分析不同类型草地土壤细菌和真菌群落组成，发现本研究的3种草地类型中变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门为优势细菌群，子囊菌门、担子菌门和灰孢菌门为真菌优势菌群，与该区域前人研究结果基本相同。Fu等^［42］对藏北高原高寒草地的研究显示，变形菌门和放线菌门为优势细菌；赵文等^［43］对三江源地区退化高寒草甸土壤研究发现，高寒草甸土壤优势真菌为子囊菌门、担子菌门和被孢霉菌门；赵兴鸽等^［44］研究表明青藏高原高寒草地土壤真菌优势菌为子囊菌门、担子菌门等；李海云等^［45］以祁连山中段高寒草甸为研究对象，发现厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和酸杆菌门为细菌优势菌，真菌结果显示优势菌为放线菌门、变形菌门和酸杆菌门，本研究结果与其基本相同。根据前人研究结合本次结果说明土壤微生物群落分布和组成在大尺度上有差异，但是优势群落没有显著的差异。本研究中发现变形菌门和子囊菌门是各草地类型中丰度最大的类群，通过进一步的分析显示，SOC和N含量与变形菌门丰度呈显著正相关；pH与子囊菌门丰度呈显著正相关。

3.2 土壤环境因子对不同类型草地土壤微生物多样性的影响

草地生态系统的重要纽带就是植被-土壤-微生物的相互作用和反馈，植被凋零分解和根系分泌作用促进植被与微生物之间营养传输和协同生长，植被与微生物之间的相互选择在生态系统中反映出了植被群落与土壤的演替方向^［42］。研究表明草地植被多样性不仅受土壤特征影响，还与地形地貌、海拔、坡度、温度等因子有关^［46］。Ahmad等^［47］对喜马拉雅地区草地研究表明，植被多样性与温度、降水、太阳辐射等温度变量呈正相关，但海拔是对物种丰富度和多样性格局最主要的影响因素。周华坤等^［27］在三江源的研究也证实这一结论。此外，本研究还发现，高寒草甸的生物量最高，这是因为本研究的高寒草甸所在区域，年降水量相对最高，土壤含水量较高，植被生长环境较好，地上生物量中可食牧草的占比较高。这一点在张小燕等^［48］和Zuo等^［49］的研究中得到了证实。

土壤理化性质的变化会对微生物群落特征产生影响^［50］，有研究表明^{［22，51］}pH与微生物多样性具有显著的相关性，土壤pH、SOC等土壤性质是微生物结构和活性的关键驱动因素，土壤pH在解释土壤细菌群落多样性和组成方面具有关键作用^［52］。本研究通过测定三江源3种不同类型草地土壤理化性质和利用高通量测序技术对土壤微生物群落变化进行探究，结果显示不同类型草地土壤理化性质差异显著，除了pH和P含量在高寒草甸中最低之外，其余各指标的含量在高寒草甸中均为最高，对植被群落多样性和土壤微生物多样性影响较大的土壤理化因子为pH、P、N、K，这一结果与前人结果基本一致。pH被广泛认为是影响生物多样性和丰富性最主要的因子^{［22，53］}，且有研究表明植被群落多样性和pH呈负相关^［27］，高寒草甸具有相对较高的物种丰富度，而植被多样性的增加同时也会促进土壤微生物多样性的提高^［54］。限制植被生长发育的土壤因子为P和K^［55］，植被的生长发育程度与土壤微生物含量之间有直接或间接的反馈效应，微生物群落多样性和丰度受土壤P的影响比较大^［23］，本研究中高寒草甸土壤P含量在3种草地类型中的含量较少，可能是造成高寒草甸植被和微生物群落组成结构及多样性与另外两种类型草地差异的原因之一。

4 结论

三江源地区高寒草甸、温性草原和高寒草原3种不同类型原生草地土壤理化性质与植被及土壤微生物群落特征差异显著，高寒草甸植被和土壤微生物多样性最高，同时具有较好的土壤养分。土壤pH、N和SOC与植被和土壤微生物群落多样性有显著相关关系，因此，在该区域的草地保护和生态修复中，通过改善土壤营养性状，能够实现土壤微生物和植被多样性的双重提升，能更好地保证草地管理效率。

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基金资助

中国地质调查局项目(DD20220959)

中国地质调查局项目(DD20230094)

中国地质调查局自然资源综合调查指挥中心科技创新基金(KC20220018)