玉米器官组织内生细菌和真菌群落多样性

Diversity of endophytic bacterial and fungal communities in different maize organs

摘要

探究玉米不同组织微环境与内生菌多样性的关系，对筛选玉米相合性促生菌或生防菌等功能微生物具有重要意义。采用高通量测序技术研究玉米不同器官组织内生细菌和真菌群落多样性，结果表明，玉米内生细菌群落由31个门，93个纲，192个目，340个科，404个属组成。变形菌门和厚壁菌门为优势细菌门，毛螺菌属、根瘤菌属、肠杆菌属及鞘氨醇单胞菌属为优势细菌属，且部分内生细菌表现出不同程度的器官偏好性，表明部分细菌种群存在组织微环境内生专一性。对比各器官组织优势细菌属，根部独有的细菌属是细球菌属和绒毛杆菌属；籽粒中独有的细菌属是葡萄球菌属、绒毛杆菌属、代尔夫特菌属、短波单胞菌属、链球菌属和狭窄梭菌属；叶中独有的细菌群主要是假单胞菌属。玉米根、茎、叶微生物群落组成具有相似性，但与籽粒差异较大。玉米内生真菌群落由12个门，37个纲，84个目，187个科，404个属组成。子囊菌门、担子菌门和壶菌门为优势真菌门，被孢霉属和镰刀菌属为优势真菌属，罗兹菌门是根部独有的优势真菌群。玉米茎、叶和籽粒器官组织间真菌群落组成差异较小，但与根部差异较大。综上，玉米器官组织对内生菌的分布具有较大的影响，不同器官组织内生细菌群落组成差异显著，内生真菌群落组成差异不明显。

Abstract

The relationship between the microenvironment of different tissues of maize and the diversity of endophytic bacteria is of great significance for screening functional microorganisms， such as compatible growth-promoting bacteria or biocontrol bacteria. In this study， high-throughput sequencing technology was used to investigate the diversity of endophytic bacterial and fungal communities in various maize organs and tissues. The results showed that the maize endophytic bacterial community comprised 31 phyla， 93 classes， 192 orders， 340 families， and 404 genera. Proteobacteria and Firmicutes were the dominant bacterial phyla， and Lachnospira， Rhizobium， Enterobacter， and Sphingomonas were the dominant bacterial genera. Some endophytic bacteria were more abundant in some organs than in others， indicating that some bacterial populations had endogenous specificity for particular tissue microenvironments. Comparing the dominant bacterial genera among various organs and tissues， the unique bacterial taxa in the roots were Micrococcus and uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae. The unique bacterial taxa in the kernels were Staphylococcus， uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae， Delftia， Brevundimonas， Streptococcus， and Clostridium_sensu_stricto_1. The unique bacterial group in the leaves was mainly Pseudomonas， and no unique bacterial genus was detected in the stems. Beta diversity analyses showed that the microbial community composition was similar in the roots， stems， and leaves of maize， but different in the grain. The endophytic fungal community of maize was composed of 12 phyla， 37 classes， 84 orders， 187 families， and 404 genera. Ascomycota， Basidiomycota and Chytridiomycota were the dominant fungal phyla， Mortierella and Fusarium were the dominant fungal genera， and Rozellomycota was the unique dominant fungal group in the roots. Beta diversity analyses showed that there was little difference in fungal community composition among stems， leaves， and grain of maize， but it was significantly different in the root. In summary， the distribution of endophytic bacteria differs among maize organs and tissues. Compared with the endophytic fungal community， the endophytic bacterial community showed wider variations among the different organs and tissues.

Graphical abstract

关键词

玉米 / 组织器官 / 内生细菌 / 内生真菌 / 多样性

Key words

maize / tissue and organs / endophytic bacteria / endophytic fungi / diversity

植物内生菌指在生活史的部分阶段或全部阶段生活在植物根、茎或者叶片等组织内但不引起侵染症状的一类新的微生物资源^［1］，植物内生菌不仅能产生固氮、溶磷作用，促进植物萌发生长^［2］，提高植物光合作用^［3］，降解重金属污染^［4］，抑制病原菌^［5］，诱导系统抗性^［6］，提高产量等，还能产生各种具有生物活性的次级代谢产物^［7］，在病虫害防治及医药工业等领域都具有潜在的应用价值。内生菌的最大优势是这类微生物能够在适当的细胞或组织上定殖，能够免受环境压力的影响，直接调节植物的生长^［8］，因此，植物内生菌成为近年来生防菌研究的热点，常见的植物内生菌包括细菌、真菌、放线菌等，在正常情况下均不引起寄主植物出现病害。

玉米（Zea mays）又称玉蜀黍、苞米、苞谷，是全世界范围内种植最广泛的农作物之一，具有营养丰富，适应性强等特点，市场需求量大，在我国粮食、畜牧业、医药、工业等领域具有重要的价值^［9］。玉米是多种植物病原体的宿主，受病害影响，玉米产量和质量大幅度下降，从而造成了巨大的经济损失^［10］。应用微生物菌剂能够减少化学农药等造成的污染，是实现玉米产业可持续发展的有效方法之一。目前市面上已经有从促生、生防、抗非生物胁迫等角度开发的多种微生物菌剂应用于玉米生产，但这些微生物菌剂的菌株与玉米的相合性共生能力弱，促生和生防效果差。

玉米内生菌是玉米相合性共生微生物的主要来源，因其天然的定殖优势能够免受环境的压力直接作用于植物或者控制病虫害，也可以通过改善内生菌群的组成和丰度达到促生长的目的，因此在控制病害方面，可能比传统的生防菌剂具有一定的优势。孙艺昕等^［11］从玉米植株上分离获得61株内生菌菌株，从中筛选出2株抗玉米蚜的优良植物内生菌菌株，并测定其对玉米生长的影响，结果发现2株玉米内生菌菌液浸种促进了玉米植株生长以及干物质的积累。目前已经报道的玉米真菌病害生物防治方面的内生菌多为芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas） 2 个常规拮抗菌属，可见在玉米病害防治方面的内生菌资源还需要进一步挖掘^［8］。植物各器官组织化学组成的差异造成内环境的不同，进而影响不同器官组织中的内生微生物组成^［12-13］。现阶段对玉米不同器官组织（根、茎、叶、籽粒）内生菌的差异相关的研究还十分薄弱，限制了玉米内生菌资源的开发和利用，且对玉米内生菌多样性的研究方式主要采用传统的培养分离鉴定模式，应用免培养技术的研究报道较少，尤其是内生真菌，玉米中大部分内生菌还未被检测到。因此，本试验以兰州西固地区玉米根、茎、籽粒、叶器官组织作为材料，采用高通量测序技术研究不同器官组织内生细菌和真菌群落多样性，旨在全面揭示玉米不同器官组织内生细菌和真菌的分布情况，深入了解不同组织微环境与内生菌多样性的关系，丰富玉米内生菌库资源，为筛选促进玉米生长以及增强其抗病性的相合性共生菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于甘肃省兰州市西固区达家台（39°96′ N，116°40′ E），属温带半干旱气候，干燥少雨，日照充足，蒸发量大，年平均气温8.5 ℃，年平均日照达2780 h，平均降水量327.70 mm，无霜期169 d，土壤性质是泥沙，以灰钙土、黄绵土为主，质地为中、轻壤质，土层厚度大于2 m，土壤含盐量0.06%左右，有机质含量0.7%左右^［14］。

1.2 样本采集

供试玉米品种：粮饲兼用型，‘和盛5288’ 玉米。该品种玉米幼苗叶鞘紫色，叶片绿色，叶缘绿色；株型紧凑，株高约3 m，穗长22 cm，穗行数16~18行，行粒数39粒，籽粒黄色，粒长，马齿型，适宜在甘肃省中晚熟玉米类型区种植。

试验设置3个重复小区，每个小区面积30 m²（3 m×10 m），且所有小区的水肥管理条件相同。于2022年4月13日播种，播种时采用精量机播，行距65 cm，种植密度600000株·hm^-2。

样本处理：2022年9月21日，玉米进入蜡熟期，采用“S”型取样法，每个小区随机取生长健康，长势良好的玉米6株，每株分离成根、茎、叶和籽粒部分。根部样本采集完整根系，茎部样本采集茎基部3 cm的茎段，叶部样本随机采集茎中部条形叶片中段10 cm叶片，籽粒样本随机采取无病虫害的玉米籽粒。将采集好的样本置于冰盒中运送到实验室，以根、茎、叶、籽粒为4个器官组织处理，分别记为GN、JN、YN、LN，测定其内生微生物群落多样性。

预先对使用的器皿和工具进行消毒处理，然后在超净工作台中用无菌水冲洗根、茎、叶、籽粒表面30 s，然后用75%酒精浸泡1 min，3%次氯酸钠溶液浸泡3 min，75%酒精再浸泡0.5 min，之后用无菌水冲洗5遍进行表面消毒，将已消毒的玉米材料，用组织印迹法^［15］做对照处理，检验消毒效果。然后将冲洗液经150~200 r·min^-1振荡30 min，再将洗涤液10000 r·min^-1离心10 min 以上，上清液过0.22 μm 滤膜，最后将滤膜标记好样本信息后液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存^［16］。

1.3 总DNA提取、PCR扩增与测序

使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国北京）完成核酸的提取。使用酶标仪（synergy HTX，Gene Company Limited）检测提取核酸的浓度，以该检测浓度下DNA浓度为模板，用细菌16S rDNA V4区引物对338F和806R进行PCR扩增，用真菌ITS rDNA ITS1区引物对ITS1F和ITS2进行PCR扩增，使用浓度1.80%的琼脂糖对PCR产物进行电泳检测后建立检测文库。通过Qsep-400方法进行文库质检，质检合格的文库委托北京百迈克生物科技有限公司使用Illumina Novaseq6000进行上机测序。

1.4 高通量测序及数据分析

测序后的数据使用Usearch v 10软件，通过overlap对每个样品的Clean Reads 进行拼接，过滤后使用UCHIME v 4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效序列（effective reads）。使用Usearch软件对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得分类操作单元（operational taxonomic units， OTU）。以UNITE为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释。用Excel 2016进行数据整理，用百迈客云平台进行数据分析，用SPSS 20.00软件对数据进行差异性分析，用R软件（2.15.3）绘制稀释曲线，Mothur（version v.1.30） 软件对Alpha 多样性指数进行评估，QIIME 2软件对Beta 多样性进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同器官组织内生菌序列统计与Alpha多样性分析

2.1.1 不同器官组织内生细菌序列统计与Alpha多样性分析

经16S rDNA测序，共获得834525对有效序列，聚类后得到2824个OTUs，新鲜玉米GN、JN、LN和YN中细菌序列为53129~73944，OTUs数目分别是1049、913、658和865个（表1）。随着测序深度的增加，各组曲线逐渐趋向于平缓，总体来看，物种数量呈“GN>YN>JN>LN”的趋势，说明GN中细菌物种最为丰富，其中，有一组GN的样本曲线高于其他两个重复，可能是试验误差导致的样品数据不稳定等造成的（图1）。各样品间 Simpson 指数和Shannon-Wiener指数无显著差异。Chao1指数在GN中显著高于其他处理，ACE指数在JN中显著高于其他处理（P<0.05），覆盖度均在99%及以上（表1）。

Venn图体现了不同样品之间微生物群落的相似性和差异性（图2），玉米不同器官组织共有OTUs数目为683个，其中GN、JN、LN、YN中特有的OTUs数目分别是120、100、215、200个，因此，可以看出各样品之间细菌群落差异性显著（P<0.05）。

2.1.2 不同器官组织内生真菌序列统计与Alpha多样性分析

经ITS测序，共获得 5741273 对有效序列，聚类后得到1705个OTUs，新鲜玉米GN、JN、LN和YN中真菌序列为467631~474209，OTUs的数目分别是1686、1691、1681和1689个（表2）。样品稀释曲线都趋于平缓（图3），结合覆盖度均为100%，表明本试验测序数据的合理性与真实性，测序深度足够覆盖到大多数真菌类群，足以反映样品中的物种多样性，同时可以看出，GN、JN、LN和YN中的OTUs数目相差不大，表明玉米不同器官组织中内生真菌多样性差异不显著。各样品间 Simpson和Shannon-Wiener指数无显著差异。Chao 1和 ACE指数代表物种丰富度，各样品间无显著差异（P>0.05）。

由Venn图（图4）可知，玉米不同器官组织共有OTUs数目为1704个，JN、LN、YN中共有的OTUs有1个，各器官组织均没有独有的OTUs，因此，可以看出各样品之间真菌群落组成差异不显著（P>0.05）。

2.2 不同器官组织内生菌群落组成及多样性

2.2.1 不同器官组织内生细菌群落组成及多样性

基于OTU的丰度及注释信息，对玉米不同器官组织在门、目和属分类水平上相对丰度前10的细菌序列数目进行统计，并将相对丰度>1%的细菌定义为优势细菌群。结果发现，玉米不同器官组织优势细菌群落在门、目和属水平上均有差异，且相对丰度差异较大。

在门分类水平上，GN、JN、LN、YN中共有的优势细菌群主要是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria），平均分别占总门类的31.09%、22.68%、4.16%和1.12%，其中变形菌门和厚壁菌门在JN中的相对丰度最低，与GN、LN、YN相比，变形菌门分别降低了97.19%、96.78%和97.20%，厚壁菌门分别降低了71.84%、80.69%和75.68%。而绿弯菌门在JN中的相对丰度最高，GN、LN和YN分别较JN降低了84.22%、87.22%和88.16%。JN中没有而GN、LN、YN中有的优势细菌群是拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和梭杆菌门（Fusobacteria），平均分别占总门类的11.78%、8.43%、1.83%和1.45%。其中，放线菌门在GN中的相对丰度高于LN和YN，分别增加了58.93%和64.56%。GN中独有的细菌群主要是髌骨细菌门（Patescibacteria）和软壁菌门（Tenericutes），平均分别占总门类的0.60%和0.55%，但并不是优势菌群；JN中独有的优势细菌群是装甲菌门（Armatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、圣诞岛盐菌门（Kiritimatiellaeota）和GAL15门，平均分别占总门类的2.06%、23.74%、1.00%和47.34%；LN中独有的细菌群主要是螺旋体门（Spirochaetes），占LN中总门类的0.74%（图5）。

在目分类水平上，JN、LN、YN中的优势菌群主要是未培养变形菌目（uncultured_bacterium_k_Bacteria）、梭杆菌目（Fusobacteriales）、Subgroup_7目、弗兰克氏目（Frankiales）、uncultured_bacterium_c_Gitt-GS-136目、KI89A_clade目和红细菌目（Rhodobacterales），平均分别占总目类的14.25%、7.95%、6.33%、7.51%、7.46%、5.20%和7.10%。其中，红细菌目在LN中的相对丰度占比最高， JN和YN较LN分别降低了73.45%和63.04%；甲基球菌目（Methylococcales）是JN和LN中独有的优势菌，且JN中相对丰度占比较LN增加了60.01%；而GN中相对丰度前10的细菌群均是GN独有的，包括梭菌目（Clostridiales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、β-变形菌目（Betaproteobacteriales）、拟杆菌目（Bacteroidales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）和乳杆菌目（Lactobacillales），分别占GN目类的12.45%、8.76%、8.41%、7.23%、6.46%、5.73%（图6）。

在属分类水平上，相对丰度前10且GN、JN、LN、YN中共有的细菌群是毛螺菌属（Lachnospira）、根瘤菌属（Rhizobium）、肠杆菌属（Enterobacter）及鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），平均分别占总属类的2.91%、3.28%、2.12%和1.46%，其中，毛螺菌属在JN中的相对丰度高于GN、LN和YN，分别增加了28.07%、12.51%和18.35%，根瘤菌属和肠杆菌属在YN中的相对丰度均高于GN、JN和LN，根瘤菌属分别增加了98.03%、38.76%和37.75%，肠杆菌属分别增加了59.60%、26.95%和20.96%；乳杆菌属（Lactobacillus）是在GN中没有，但JN、LN和YN中均有的优势细菌属，且YN中的相对丰度较JN和LN增加了17.73%和18.95；变形杆菌属（Proteus）和埃希氏菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）在GN和JN中为独有的优势细菌属，且在JN中的相对丰度均高于GN，分别增加了14.14%和50.17%；芽孢杆菌属是GN和YN中独有的优势细菌属，且YN中相对丰度较GN增加了26.76%；拟杆菌属（Bacteroides）是LN和YN中独有的优势菌属，且LN中的相对丰度较YN增加了10.33%。GN中独有的优势细菌群是细球菌属（Micrococcus）、绒毛杆菌属（Muribaculaceae）及毛螺旋菌属NK4A136家族（Lachnospiraceae_NK4A136_group），分别占GN属的2.47%、2.24%和1.65%；JN中相对丰度前10的细菌群落中没有独有的细菌属；LN中独有的优势细菌群是葡萄球菌属（Staphylococcus）、狭窄梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）、链球菌属（Streptococcus）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、代尔夫特菌属（Delftia）和绒毛杆菌属，分别占LN属分类水平的10.81%、1.31%、1.38%、1.62%、1.90%和2.01%；YN中独有的优势细菌群是假单胞菌属，占YN属分类水平的1.40%（图7）。

2.2.2 不同器官组织内生真菌群落组成及多样性

基于 OTU 的丰度及注释信息，对玉米不同器官组织在门、目和属分类水平上相对丰度前10的真菌序列数目的相对丰度进行统计，并将相对丰度>1%的真菌定义为优势真菌群。结果发现，玉米不同器官组织优势真菌群落组成和相对丰度在门水平上有差异，但在目和属水平上无明显差异。

在门分类水平上，GN、JN、LN、YN的优势真菌群主要是子囊菌门、担子菌门和壶菌门，平均分别占总门类的61.00 %、13.40%和10.01%。鞭毛菌门（Mortierellomycota）和未分类菌门在GN中的相对丰度均高于JN、LN和YN，分别占GN中总门类的12.29%和6.47%，而壶菌门和毛霉菌门（Mucoromycota）在GN中的相对丰度均低于JN、LN和YN，壶菌门分别降低了82.94%、83.29%和83.06%，毛霉菌门分别降低了99.41%、99.36%和99.43%。罗兹菌门和捕虫霉门（Zoopagomycota）是在GN中独有的真菌群，分别占GN中总门类的4.09%和0.04%。新丽鞭毛菌门（Neocallimastigomycota）和梳霉门（Kickxellomycota）是在JN、LN和YN有，但GN中没有的优势真菌群，在JN、LN和YN中的相对丰度无明显差异（图8）。

在目分类水平上，玉米不同器官组织真菌群落相对丰度差异不明显。GN、JN、LN、YN中的优势真菌群主要是肉座菌目（Hypocreales）和被孢霉目（Mortierellales），平均分别占总目类的18.24%和12.48%；枝孢目（Cladosporiales）是GN和LN中独有的优势真菌目，平均占总目类的2.43%；JN和LN中独有的优势真菌目主要是GS11目，分别占总目类的2.48%和2.58%（图9）。

在属分类水平上，GN、JN、LN、YN中Unclassified属分别占总属类的29.47%、29.45%、29.32%和29.61%。优势真菌属主要是被孢霉属（Mortierella）和镰刀菌属（Fusarium），平均占总属类的12.39%和5.82%，其余优势属包括曲霉属（Aspergillus）、蒜孢属（Rachicladosporium）、葡萄穗霉属（Stachybotrys）、枝孢属（Cladosporium）、珊瑚菌属（Clavaria）、四枝孢属（Tetracladium）和维希尼克氏酵母属（Vishniacozyma），且各菌群的相对丰度在不同器官组织中差异不明显（图10）。

2.3 不同器官组织内生菌Beta多样性分析

2.3.1 不同器官组织内生细菌Beta多样性分析

通过Beta多样性分析来比较玉米不同器官组织细菌群落组成存在的差异大小，基于Binary-jaccard 距离算法对所有样品进行非量度多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling， NMDS），其 Stress值为0.0664，小于0.1，表明NMDS分析排序良好。其中，GN、JN和YN在第3象限均有部分重叠，且都分布在Y轴附近，表明玉米细菌群落结构组成在GN、JN和YN器官组织间差异较小；LN分布在第1、4象限，GN、JN和YN 绝大部分分布在第2、3象限，表明LN与GN、JN、YN的细菌菌群组成具有较大差异；JN和YN部分分布在第2象限，表明JN和YN中的细菌群落具有一定相似性，LN和YN部分分布在第4象限，表明LN和YN中的细菌群落具有一定的相似性（图11）。

2.3.2 不同器官组织内生真菌Beta多样性分析

通过Beta多样性分析玉米不同器官组织真菌的差异性，基于Binary-jaccard 距离算法对所有样品进行NMDS 分析，其Stress值为0.1735，表明NMDS分析具有一定的可靠性。其中，LN、JN和YN部分均分布在原点附近，且JN和YN占大部分，表明玉米真菌群落结构组成在LN、JN和YN器官组织内具有一定相似性，且JN和YN之间差异最小；LN分布在第2、4象限，YN大部分分布在第1象限，两者之间距离较远，表明LN和YN之间真菌群落结构组成差异较大；GN分布在第2、3、4象限，与其他器官组织之间具有一定的差异性（图12）。

2.4 不同器官组织内生菌物种相关性分析

2.4.1 不同器官组织内生细菌物种相关性分析

物种相关性网络可以表达物种之间是否具有相关性，如果物种与物种之间具有相关性，它们之间就有连线，圆圈越大表示物种的丰度越高。根据物种丰度比例高于1%对玉米不同器官组织细菌的物种丰富度相关性进行网络图分析（图13），结果表明：相对丰度较高的属分别是根瘤菌属、葡萄球菌属、毛螺菌属和肠杆菌属，其中根瘤菌属与拟杆菌属、肠杆菌属、盐单胞菌属（Halomonas）和柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）均呈正相关；埃希氏菌-志贺氏菌与短波单胞菌属呈正相关；葡萄球菌属与芽单胞菌属呈负相关；乳杆菌属和变形杆菌属呈负相关；其他物种基本均呈正相关。

2.4.2 不同器官组织内生真菌物种相关性分析

玉米不同器官组织内生真菌的物种相关性分析表明，被孢霉门的丰度最高，与其他物种均有相关性，其中与镰刀菌属、青霉属（Penicillium）和轮枝菌属（Verticillium）呈负相关，与蒜孢属和珊瑚菌属呈正相关；镰刀菌属的相对丰度次之，与珊瑚菌属和被孢霉属呈负相关；维希尼克氏酵母属只与蒜孢属呈正相关，与其他物种没有相关性（图14）。

3 讨论

植物内生菌存在于植物的各个器官组织，种类繁多，是影响植物生长发育的重要组成部分，微生物群落多样性是否稳定会直接影响微生物的生态功能和整个生态系统。内生菌与植物在长期协同进化过程中形成了复杂的生态关系，主要包括互利共生、无害或微害寄生等3种。微生物之间的拮抗、共生及竞争等关系一旦发生变化，则会使部分不利于植物生长的菌群发展成为优势种，导致植物病害的发生^［17］。本试验以新鲜玉米根、茎、籽粒、叶等不同器官组织作为材料，采用高通量测序技术，分析其内生细菌和真菌多样性和群落结构组成，整理出了玉米根、茎、籽粒、叶4个器官组织中内生细菌和真菌群落所属的门、目、属不同分类水平上相对丰度前10的优势类群，研究过程中发现玉米内生细菌群落组成差异显著，但内生真菌群落较为稳定。这可能是由于各器官组织的化学组成不同而造成内环境的差异，在长期协同进化过程中形成了较为稳定的内环境，进而影响内生菌群组成，还可能与各器官的形态特征有关。玉米不同器官组织中的优势内生菌群落组成及丰度有较大差异，这与其他学者的研究结果有偏差，可能与玉米品种、生长环境、生长阶段以及玉米不同部位的养分水平等因素有关。

3.1 玉米内生细菌优势群落分析

本研究发现，玉米内生细菌的多样性丰富，且玉米部分内生细菌表现出不同程度的器官组织偏好性，这可能与不同器官的组织结构、形态特征及其含有的化学成分有关。稀释性曲线可以反映测序深度以及物种丰富度，本研究中，随着测序深度的增加，各组曲线逐渐趋向于平缓，这表明测序深度足够反映样品中细菌的物种量信息，但仍有少量物种待发掘^［18］，结合覆盖度均在99%以上，表明本试验测序数据的合理性与真实性，基本可以反映出每组样品中的菌群结构。Simpson 指数和Shannon-Wiener指数能同时反映物种丰富度和均匀度^［19］，但不能单独说明某个群落生物多样性的高低。指数数值越大，表示多样性越高，群落的复杂程度越高^［20］。Chao1和ACE指数均代表物种丰富度，但它们的计算方法和意义略有不同。Chao1指数的计算是基于样本中单个物种的出现频率和丰度，而ACE指数的计算是基于样本中所有物种的出现频率和丰度。在本研究中，各样品间 Simpson 指数和Shannon-Wiener指数无显著差异。GN的Chao1指数显著高于其他处理，JN的ACE指数显著高于其他处理（P<0.05）。Alpha多样性分析显示，玉米不同器官组织细菌物种丰度从高到低依次是根>叶>茎>籽粒，可能与植物内生菌的来源息息相关，植物内生菌大部分来源于根际土壤微生物，后经根系运输到植株其他部位。这与吕佩等^［21］研究的刺山柑（Capparisspinosa）和黎起秦等^［22］研究的番茄（Solanum lycopersicum）内生菌分布特性的结果一致，黎起秦等^［22］认为番茄根系是内生细菌进入植物的入口，此处有较多植物次生根，机械损伤及病虫危害会造成伤口，促进了细菌群落在根部的聚集和定殖，部分内生菌会逐渐向茎和叶等组织移动^［23］，本研究玉米根系细菌群落丰富的结果与之具有相同之处，其主要原因是与植物的根沉积和根分泌有关，且已有研究发现在大豆（Glycine max）和水稻（Oryza sativa）中，根部细菌群落多样性由根际向根面和根内递减^［24-25］。

Beta多样性分析显示，玉米细菌群落组成在根、茎和叶器官组织间差异较小，与籽粒差异较大，其中茎和叶部的内生细菌群落组成相似，籽粒和叶部也具有一定的相似性，体现出一定的组织差异性和专一性。总体来看，玉米内生细菌群落的分布随器官组织的不同有较小的差异，且主要体现在玉米籽粒中。对物种丰度比例高于1%的细菌相关性进行网络图分析，结果发现葡萄球菌属与芽单胞菌属呈负相关，乳杆菌属与变形杆菌属呈负相关，说明葡萄球菌属与芽单胞菌属，乳杆菌属与变形杆菌属在玉米中以竞争、拮抗或抑制生长为主，其余的菌均呈正相关，说明玉米内生菌群落总体上以更强的合作共生关系为主。

在门分类水平上，玉米4个器官组织中相对丰度较高的优势类群是变形菌门和厚壁菌门，这与国内外大多数研究结果一致^［26-28］，说明玉米细菌群落与目前已测的大部分植物一样，门水平的细菌群落组成相对稳定。变形菌门下包含大量对植物生长有益的类群，能起到调节植物微生物群落的作用^［29］。厚壁菌门是第二优势类群，很多厚壁菌可以产生芽孢^［30］，可以抵抗脱水和极端环境^［31］。其次，玉米内生菌中相对丰度较高的优势类群是拟杆菌门，放线菌门和绿弯菌门，且绿弯菌门在玉米茎中的相对丰度明显高于其他器官组织。放线菌门不仅具有降解木质素和分解纤维素的能力^［32］，还可以产生农用抗生素、维生素、胞外酶等^［33-34］，在宿主的病原体防御和生长调节中发挥重要作用。绿弯菌门可以利用光能在高温下将有机物转化为能量^［35］，这可能表明，一些丰度较少的细菌门是由玉米对环境胁迫、不同养分条件和植物免疫的反应引起的。最后，酸杆菌门在玉米细菌群落中也属于优势菌群，酸杆菌门的相对丰度与土壤营养贫乏有关，变形菌门的相对丰度与土壤营养丰富有关，变形菌门和酸杆菌门的比例已被证明是土壤养分含量的指标^［36］。玉米根器官组织中独有的细菌群落是软壁菌门和髌骨细菌门，软壁菌门可以被认为是有益菌，主要是因为软壁菌门的大部分物种参与了土壤养分循环和有机物质降解等过程，还有一些物种也被用来生产食品（如面包、奶酪等）和药物（如抗生素）等^［37］。髌骨细菌门是目前已知地球上最小细菌家族的重要子集，在碳、氮、硫循环中发挥着重要作用，但自然环境中没有可培养髌骨细菌的报道^［38］。玉米茎器官组织中独有的优势细菌群是装甲菌门、奇古菌门、浮霉菌门、圣诞岛盐菌门和GAL15门。其中，奇古菌门在生理代谢，氨氧化和固碳等方面发挥着惊人的作用^［39］。浮霉菌门对全球氮循环具有重要意义，也是污水处理中重要的细菌^［40］。玉米籽粒中独有的优势细菌群是螺旋体门，多通过寄生方式引起人和动物疾病^［41］。这些试验结果证明细菌群落在玉米的生长发育和抗逆性方面起着至关重要的作用。

在属分类水平上，玉米4个器官组织主要的优势细菌属是毛螺菌属、根瘤菌属、肠杆菌属及鞘氨醇单胞菌属，因此推测这几个属细菌的侵入能力强，且在植株体内具有较强的竞争力。其中，毛螺菌属是一种潜在的有益菌，参与多种碳水化合物的代谢^［42］；根瘤菌属具有很强的固氮能力^［43］；肠杆菌属具有溶解磷酸盐、促生长的作用，且肠杆菌属含有多种产激素和抗菌物质的基因，在保护植物的同时对其他根内生细菌具有抑制作用^［44］。鞘氨醇单胞菌是一种降解芳香化合物的新型微生物资源^［45］，能降解多种有机污染物^［46］，也可以产生吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）促进植物的生长，还能通过产生一定的抗性物质提高植物的抗病性^［47］。除了关注玉米内生优势属外，玉米不同器官组织独有的相对丰度较低的属在玉米的生长发育中也扮演着重要角色。茎、籽粒和叶中独有的优势细菌属是乳杆菌属，且叶中的相对丰度占比高于茎和籽粒，乳杆菌属在青贮发酵过程中起决定性作用，乳杆菌能抑制有害微生物生长，从而使饲料得以长期保存，同时具有高效降血压、降胆固醇，促进细胞分裂，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能，还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用^［48-49］。根和叶中独有的优势细菌属是芽孢杆菌属，且叶中相对丰度占比高于根中，这与单凯等^［50］从玉米根部分离得到优势菌株为芽孢杆菌的结果相一致，芽孢杆菌是目前在农业、工业及医药卫生等领域应用最为广泛的有益菌，能够促进植物生长，诱导植物自身抗性，抑制不同病害，以及通过竞争空间和营养成分直接对微生物病原体造成拮抗作用，已广泛用于植保和动物饲料添加。叶中独有的优势细菌属是假单胞菌属，表现出部分细菌种群的组织专一性，这种专一性可能是内生菌与宿主在长期共同进化中形成的，产生这种专一性的可能原因是不同植物内生菌可利用不同的基质，对生活环境有不同的要求，因而内生菌具有不同的生活方式^［51］。这与李南南等^［52］的研究结果不一致，可能是受玉米品种及种植地区的影响，它不仅具有高效的固氮溶磷能力^［53］，还能够代谢尼古丁、处理污水、降解土壤中的有毒物质等，对植株促生及防病作用明显^［54］。植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）就是一类定殖于植物根系的有益微生物，利用其生物学功能制成的生物菌剂具有低成本、高效和环保等优点，这些结果都说明了玉米根部和叶部是开发玉米内生菌资源的主要潜在部位^［55］。

3.2 玉米内生真菌优势群落分析

本研究发现，玉米内生真菌群落较为稳定，表明在长期的协同进化过程中，玉米与其内生真菌形成了相对稳定的关系。Alpha多样性分析显示，玉米根、茎、叶和籽粒的内生优势真菌物种丰度差异不明显，在目和属水平上基本相同，可能是由于玉米真菌多样性与群落组成受植物各器官组织的影响较小，群落组成较稳定。Beta多样性分析显示，玉米内生真菌群落的分布随器官组织的不同有较小差异，主要体现在玉米根上。玉米籽粒、茎和叶部器官组织中内生真菌群落组成具有一定相似性，与根部差异较大。其中，茎部和叶部内生真菌群落组成相似，籽粒和叶部之间差异较大。对物种丰度比例高于1%的真菌相关性进行网络图分析，结果发现被孢霉属只与蒜孢属和珊瑚菌属呈正相关，与其他物种均呈负相关，说明在玉米体内被孢霉属与蒜孢属和珊瑚菌属合作生长，与其他物种以竞争或抑制生长为主。维希尼克氏酵母属只与蒜孢属呈正相关，说明玉米体内维希尼克氏酵母属与蒜孢属以合作关系为主，与其他物种没有相关性，但蒜孢属会浸染非洲猴面包树（Adansonia digitata），属于植物病原菌^［56］。总体说明玉米内生真菌群落以竞争关系为主。

在门分类水平上，子囊菌门和担子菌门为玉米优势真菌门，这可能是由于玉米器官组织中木质素含量较高，腐生的子囊菌可以引起木材、食品、布匹和皮革的腐烂以及动植物残体的分解，担子菌门包含真菌能促进木质素分解^［57］，玉米可以通过腐蚀的方式为自身提供有机物质。在目分类水平上，肉座菌目和被孢霉目是优势真菌群，已有研究表明肉座菌目也具有降解腐烂有机质，降解纤维素的作用^［58］。在属分类水平上，被孢霉属和镰刀菌属为优势真菌属，是防治较为困难的植物病原菌，可侵染人和动植物，造成严重的疾病，但也可作为被利用的真菌资源，具有杀虫、杀菌等作用，有利于动植物的生长发育^［59］。枝孢属也是玉米真菌优势属之一，是一种常见的植物病原菌，但也是一种具有重寄生作用和抗菌活性的潜在生防菌株^［60］。但在门水平上，玉米根部优势真菌群与其他器官组织有明显差异，根部与土壤环境密切接触，土壤中的大量微生物等可能会浸染根部，土壤与玉米内生真菌共生可以改变玉米根系分泌物和根际代谢物含量来影响玉米和土壤微生物群落，进而影响土壤养分循环^［61］。罗兹菌门和捕虫霉门是根部独有的优势真菌群，表现出部分真菌种群的组织专一性，这与Alpha多样性分析结果一致，其中捕虫霉门中多数为微型无脊椎动物（如线虫等）的寄生菌^［62］， 罗兹菌门在许多植物根部已有报道，例如苹果（Malu domestica）砧木^［63］。由于植物-内微生物-土壤微生物的相互作用，大多数内生菌来源于土壤微生物，这可能是导致根部特有门多于茎部、叶部的原因之一。本研究仅仅是对玉米不同器官组织的内生菌群落组成及分布进行分析，对其与宿主的作用和相关机制还不明确，且影响植物内生菌分布的因素和作用机制是多方面的，例如品种、生态环境、生长阶段等对玉米内生菌分布的影响，还需更进一步地研究。

4 结论

本试验对玉米不同器官组织的微生物群落进行分析，结果表明：

1）玉米器官组织对内生菌的分布具有较大的影响，不同器官组织内生细菌群落组成差异显著，内生真菌群落差异不显著。

2）玉米器官组织中还有丰富的未归类的内生菌资源，其中4个器官组织中未归类真菌种类和相对丰度基本相同，未归类细菌种类和相对丰度因器官组织而异，籽粒中细菌种类最多。

3）玉米器官组织中，内生细菌多样性高于内生真菌。可以从内生细菌中筛选有益细菌作为玉米生防菌或促生菌等功能微生物，为促进玉米生长发育和防治病虫害等提供丰富的微生物资源。

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基金资助

2024年度农业类省级技术创新引导计划-东西部科技协作专项全株青贮玉米“种+贮+喂”一体化技术集成及推广应用资助