结缕草DREB基因家族的鉴定及非生物胁迫下的表达模式分析

Identification of DREB genes from Zoysia japonica and their transcript profiles in response to abiotic stress

摘要

DREB转录因子属于AP2/ERF超家族的一个分支，在植物生长发育以及胁迫应答中发挥至关重要的调控作用。而在我国优良的暖季型草坪草结缕草中关于DREB家族基因的系统分析目前还未见报道。本研究从结缕草全基因组中共鉴定到64个ZjDREB基因，编码的氨基酸为105~984 aa，分子量为11.42~107.04 kDa，理论等电点为4.09~11.95。系统发育分析显示ZjDREB基因分为A₁~A₆共6组。蛋白序列的保守基序分析表明motif 1、motif 2和motif 3在所有ZjDREB蛋白序列中的分布相对保守，且其中的61个ZjDREB基因在结缕草14条染色体上呈不均匀分布。对ZjDREB基因的共线性分析中共鉴定到3个片段重复基因对，且基因对的非同义替代与同义替代的比值（Ka/Ks）均小于1，表明其在基因扩张中受纯化选择。顺式作用元件分析显示ZjDREB A₁和A₂组基因启动子区域含有多个与植物激素和非生物胁迫相关的作用元件。利用qRT-PCR对A₁和A₂组基因在低温、脱落酸、干旱和盐胁迫下的表达模式进行分析，结果显示A₁组基因在低温和脱落酸胁迫处理后上调表达，其中ZjDREB3上调幅度最大；A₂组基因在干旱和高盐胁迫后表现出不同的表达模式，其中ZjDREB4的上调幅度最大。本研究结果为进一步探究结缕草ZjDREB基因的功能奠定了基础，也为结缕草的遗传改良提供了新的线索。

Abstract

DREB transcription factors belong to the AP2/ERF superfamily， and play important roles in plant development and stress responses. However， a systematic analysis of DREB genes in Zoysia japonica， which is a warm-season turfgrass native to China has not been reported. In this study， we identified 64 ZjDREBs from Z. japonica， encoding polypeptides of 105 to 984 amino acids， with molecular weights ranging from 11.42 to 107.04 kDa and theoretical isoelectric points ranging from 4.09 to 11.95. The phylogenetic analysis of 64 ZjDREBs showed that they were divided into six groups from A₁ to A₆. A conserved motif analysis of ZjDREB protein sequences revealed that motif1， motif2， and motif3 were relatively highly conserved. Sixty-one ZjDREBs were unevenly distributed on 14 chromosomes of Z. japonica. By colinearity analysis， we identified three pairs of segmentally duplicated ZjDREB genes. The non-synonymous∶synonymous （Ka/Ks） was <1， indicating that this gene family might have been subject to purifying selection during its expansion. Analyses of the promoter regions of ZjDREBs in the A₁ and A₂ groups revealed multiple cis-acting elements related to plant hormones and abiotic stresses. The expression profiles of ZjDREB genes in the A₁ and A₂ groups under cold， abscisic acid （ABA）， drought， and salt stress were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The A₁ group genes were up-regulated by cold and ABA treatments， and ZjDREB3 was significantly up-regulated. The A₂ group genes showed different expression profiles under drought and salt stress， and ZjDREB4 was significantly up-regulated. Together， these results lay a foundation for further exploration of the functions of ZjDREB genes and provide avenues for the genetic improvement of Z. japonica.

Graphical abstract

关键词

结缕草 / DREB转录因子 / 系统进化 / 非生物胁迫 / 表达模式

Key words

Zoysia japonica / DREB transcription factor / phylogenetic evolution / abiotic stress / expression profiling

温度（低温、冻害和高温）、干旱和高盐胁迫是影响植物生长发育，降低产能的常见环境因素。近些年，随着全球气候的变化，极端低温冷害事件的出现也变得日趋频繁，使得低温胁迫（cold stress）成为世界上最为严重的灾害之一^［1］。低温不仅能造成植物生长缓慢，还能改变其地理分布。然而，植物通过长期的进化产生了复杂的响应机制来适应低温环境，如通过低温、光照、脱落酸（abscisic acid，ABA）等多种信号机制来协同调节细胞内的活动以维持体内稳态平衡^［2］。在这个过程中，大量低温响应基因被诱导表达，参与保护性物质合成，包括膜稳定性调节的酶类、转运蛋白、脂质和转录因子（transcription factor， TF）等^［3］。

植物转录因子由于位于信号通路的中游，在多种生物胁迫和非生物胁迫调控网络中扮演重要角色，常被作为突破口来深入研究其应答保护机制。脱水响应元件结合蛋白（dehydration responsive element-binding protein， DREB）是一类植物中特有的转录因子，能够特异性地结合下游基因启动子区域的DRE/CRT（dehydration response element/C-repeat）顺式作用元件的核心区域ACCGAC/GCCGAC，因此，DREB又被称作CBF（C repeat binding factor）转录因子^［4］。DREB是AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）超家族的一个分支，每个成员都含有一个约60个氨基酸组成的保守AP2结构域^［5］，而AP2/ERF超家族根据AP2结合域数目和保守域的特点可分为AP2、RAV、ERF、DREB和Soloist 5个家族^［6］。DREB和ERF家族均只含有1个AP2结构域，主要区别在于AP2结构域的第14和19位氨基酸不同，DREB家族为缬氨酸（valine， V）和谷氨酸（glutamic acid， E），而ERF家族为丙氨酸（alanine， A）和天冬氨酸（aspartic acid， D）^［7-8］。

DREB家族成员根据蛋白的结构特征分为A₁~A₆共6组，其中A₁和A₂组属于典型的DREB 蛋白^［9］。A₁组成员主要参与低温胁迫应答过程，AtCBF1基因是从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的第一个DREB成员，受低温诱导强烈表达，能够通过调控多个与冷害和脱水作用相关基因的表达来增强植物的耐寒性^［5］。拟南芥中首次报道的A₂组成员基因AtDREB2A和AtDREB2B在叶片和根中受干旱和高盐胁迫诱导表达，且在根中受盐胁迫诱导大量上调表达^［9］。近年来随着全基因组高通量测序技术的发展，多种植物物种的参考基因组序列被公开释放，DREB家族或AP2/ERF超家族成员也从多种物种中被鉴定出来，其中包括水稻（Oryza sativa）^［10］、玉米（Zea mays）^［11］、小麦（Triticum aestivum）^［12］、御谷（Pennisetum glaucum）^［13］、藜麦（Chenopodium quinoa）^［14］、大豆（Glycine max）^［15］、油菜（Brassica napus）^［16］、马铃薯（Solanum tuberosum）^［17］、棉花（Gossypium spp.）^［18］、甜菜（Beta vulgaris）^［19］、黑麦草（Lolium perenne）^［20］、杨梅（Myrica rubra）^［21］、火炬松（Pinus taeda）^［22］、马松（Pinus massoniana）^［23］等物种，但在结缕草（Zoysia japonica）中只有少数DREB基因的功能研究被报道，而关于DREB家族基因还未得到系统的分析。

结缕草是一种优良的暖季型草坪草，具有良好的抗旱、耐瘠薄和耐践踏等特性，是建植低养护和环境友好型草种，因此被广泛应用于观赏草坪、运动场草坪、高尔夫球场、水土保持等方面^［24］。由于结缕草喜光照温暖气候，低温等原因诱发的绿期短是影响结缕草观赏性和在北方地区推广应用的一个重要限制因素。近年来，植物基因工程和分子生物学技术发展迅速，能够快速有效地实现多种优良性状的整合，而在结缕草中对优质抗逆基因的挖掘以及抗逆分子机理的研究还较少。研究表明，多个DREB的A₁组基因参与植物低温胁迫响应过程^{［4，25-27］}，A₂组成员在植物的抗旱和耐盐性方面发挥重要作用^［4，28］，而结缕草中的A₁和A₂组基因与非生物胁迫的关系还未得到研究。因此，本研究借助生物信息学手段，在结缕草基因组中共筛选和鉴定到64个DREB家族成员，并对其系统发育关系和结构特征进行描述。另外，对典型的DREB家族基因A₁组和A₂组在低温、ABA、干旱和高盐胁迫下的表达模式进行了分析，为进一步深入探究ZjDREB转录因子的生物学功能以及创制结缕草抗逆新种质奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及培养条件

试验用植物材料为结缕草品种“Zenith”。种子于2023年12月萌发于MS固体培养基（phytotechnology，M519。成分如下：硝酸铵1650 g·L^-1；硼酸6.2 g·L^-1；无水氯化钙332.2 g·L^-1；六水氯化钴0.025 g·L^-1；五水硫酸铜0.025 g·L^-1；乙二胺四乙酸二钠二水合物37.26 g·L^-1；七水硫酸亚铁27.8 g·L^-1；硫酸镁180.7 g·L^-1；硫酸锰16.9 g·L^-1；钼酸钠二水合物0.25 g·L^-1；碘化钾0.83 g·L^-1；硝酸钾1900 g·L^-1；磷酸二氢钾170 g·L^-1；七水硫酸锌8.6 g·L^-1；甘氨酸2 g·L^-1；肌醇100 g·L^-1；烟酸0.5 g·L^-1；盐酸吡哆醇0.5 g·L^-1；盐酸硫胺素0.1 g·L^-1）。在16 h光照/8 h黑暗条件下的25 ℃恒温培养箱中培养2个月。低温胁迫处理时，取长势均一的5棵幼苗置于装有5 mL无菌水的15 mL塑料管中，在4 ℃低温培养箱中培养，每个处理时间点3个重复。ABA胁迫处理采用200 mg·L^-1的ABA，干旱胁迫处理采用20%聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG 6000），高盐胁迫处理采用200 mmol·L^-1 NaCl，置于上述15 mL塑料管中，于25 ℃恒温培养箱中培养。在0、1和24 h分别收集叶片组织，并立即在液氮中速冻，储存于-80 ℃实验室超低温冰箱以备后续提取RNA。

1.2 ZjDREB基因家族的鉴定

结缕草全基因组数据从结缕草数据库（Zoysia genome database：https：//zoysia.kazusa.or.jp/）下载。从Pfam（http：//pfam.xfam.org/）网站下载AP2保守结构域的隐马尔科夫模型（PF00847）， 以E<1e^-5为标准，使用HMM 3.0软件在结缕草蛋白质数据库中搜索能够匹配该模型的蛋白质序列。由于AP2转录因子超家族中ERF和DREB家族均只含一个AP2保守结构域，将HMM搜索后符合条件的蛋白序列在NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）中分析所含保守结构域并去除ERF和DREB家族以外的成员。通过DNAMAN（v 9.0）多序列比对，根据ERF和DREB家族AP2结构域中第14和19位保守氨基酸的不同，最终得到结缕草中的DREB家族成员。对筛选到的符合条件的DREB蛋白序列通过网站ExPASy-Compute pI/Mw（http：//web. expasy.org/compute_pi/）预测ZjDREB的蛋白质长度（protein length）、分子量（molecular weight， MW）和理论等电点（isoelectric point， pI）。

1.3 ZjDREB基因家族的多序列比对和系统发育分析

从TAIR数据库（https：//www.arabidopsis.org/）下载拟南芥AtDREB蛋白质序列。使用ClustalW软件以默认参数对结缕草和拟南芥DREB蛋白序列进行比对。比对之后，利用MEGA 7.0软件，采用邻接法（neighbor- joining）构建系统发育树，校验参数Bootstrap重复1000次。依据已知的拟南芥AtDREB的分类对结缕草ZjDREB进行分类。

1.4 ZjDREB基因结构和蛋白质保守基序分析

参考结缕草基因组注释信息获得ZjDREB的基因组序列和CDS序列，外显子-内含子结构模式图通过GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）进行可视化分析^［29］。利用在线分析网站MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）^［30］对ZjDREB蛋白质序列的保守基序进行分析，参数设置如下：1）最大基序数量为10；2）保守基序长度为2~600个氨基酸；3）其他参数为默认。最后使用TBTools软件对结缕草ZjDREB基因结构和保守基序结合进化树进行可视化^［31］。

1.5 ZjDREB基因的染色体定位和共线性分析

参考结缕草基因组注释信息获得ZjDREB基因在染色体上的起始位置，利用MapChart进行染色体定位^［32］。根据ZjDREB基因两两之间的BLASTN比对结果，使用MCScanX软件在默认参数下分析全基因组中的串联重复和片段重复特征^［33］。利用Circos 0.67软件可视化ZjDREB的片段重复基因对^［34］，并使用TBTools软件的“Simple Ka/Ks Calculator”计算重复基因对的非同义替代与同义替代的比值（non-synonymous to synonymous ratio，Ka/Ks）。

1.6 ZjDREB A₁和A₂组基因保守结构域序列及启动子顺式作用元件分析

将ZjDREB蛋白A₁和A₂组的AP2结构域序列导入DNAMAN（v 9.0）进行序列比对。同时，从结缕草基因组序列文件中提取ZjDREB A₁和A₂组基因3.0 kb上游区域序列，在Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站对启动子中的顺式作用元件进行预测。

1.7 ZjDREB A₁和A₂组基因表达模式分析

将胁迫处理后的结缕草叶片组织用液氮充分研磨，使用FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit（诺唯赞）提取植物总RNA，并用Nanodrop 2000（美国）测定总RNA浓度。分别取2 μg RNA用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）反转录合成cDNA。qRT-PCR反应程序参考ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（诺唯赞）荧光定量预混试剂说明书进行。反应总体系10 μL如下：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5 μL、正反向引物（10 μmol·L^-1）各0.5 μL（表1）、cDNA模板（50 ng·μL^-1）2 μL、RNase-free ddH₂O 2 μL。qRT-PCR仪型号为CFX96 real-time PCR system（Bio-Rad，美国），反应程序如下：95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）40个循环。基因的相对表达量使用2^-ΔΔCT公式计算^［35］，每个样品进行2~3次技术重复。

1.8 数据处理与统计分析

运用Excel 2016进行数据统计，并利用GraphPad Prism 9.0数据处理系统进行数据分析并制作图表。

2 结果与分析

2.1 结缕草ZjDREB基因家族的鉴定

通过HMM软件的初步搜索，从结缕草基因组蛋白序列文件中共搜索到222个匹配AP2结构域隐马尔科夫模型且E<1e^-5的蛋白质序列。根据蛋白质序列中AP2保守结构域的个数、保守区域第14和19位氨基酸以及与模式物种拟南芥AP2/ERF家族蛋白序列的系统发育分析，最终确定其中的64条序列属于DREB基因家族。根据鉴定所得的DREB基因期望值（expectation value，E-value），将其相应命名为ZjDREB1~ZjDREB64（表2）。对64个基因编码的蛋白质长度、分子量大小和等电点预测等信息进行分析，结果显示ZjDREB蛋白质序列长度为105~984个氨基酸，分子量（MW）为11.42~107.04 kDa，理论等电点（pI）为4.09~11.95（表2）。

2.2 结缕草ZjDREB基因家族的遗传进化分析

将从TAIR下载的56个拟南芥AtDREB基因和64个结缕草ZjDREB基因的蛋白序列一起进行多序列比对并构建进化树。根据聚类结果，将结缕草DREB家族成员分为A₁~A₆共6个组（图1），每个组的成员数分别为5、7、1、18、13和20个（表2）。其中，A₃组成员最少，仅有1个，A₆组成员最多，共有20个（图1）。

2.3 结缕草ZjDREB基因家族的基因结构及保守基序分析

进一步分析结缕草ZjDREB基因的结构，发现一些组的成员基因所含内含子较少，如A₅和A₆组无内含子基因占比分别为54%和50%。其中，A₆组的一个分支中（ZjDREB45、ZjDREB46、ZjDREB47、ZjDREB50和ZjDREB53）均含有内含子，另外一个分支中，除ZjDREB33、ZjDREB37、ZjDREB40、ZjDREB41和ZjDREB42外其余基因均不含内含子（图2A）。使用MEME网站对ZjDREB蛋白质保守基序进行分析，共鉴定到10个保守基序，分别命名为motif1~motif10（图2B）。其中，所有ZjDREB蛋白质中均含有motif1，而motif2和motif3也几乎分布在所有ZjDREB蛋白质中。motif2为除A₄组中的ZjDREB32、ZjDREB58、ZjDREB60和ZjDREB62外，剩余基因中均有分布，motif3为除A₄组中的ZjDREB18、ZjDREB36、ZjDREB58和ZjDREB60，A₅组中的ZjDREB52和ZjDREB64外，剩余基因中均有分布。另外，motif4和motif9只存在于A₆组中。

2.4 结缕草ZjDREB基因的染色体定位和共线性分析

在64个结缕草ZjDREB基因中，61个ZjDREB基因不均匀地分散在结缕草的14条染色体上，而ZjDREB3、ZjDREB13和ZjDREB27无法定位到任何一条染色体上（表2）。另外，ZjDREB基因在3、4、9、15、16和17号染色体上没有分布。8号染色体上的基因数量最多，为10个，而10号染色体上的基因数量最少，仅有1个（图3）。植物进化过程中的串联重复和片段重复对基因家族的扩张起到重要作用。通过MCScanX对结缕草基因组的共线性分析显示，结缕草基因组上存在大片段复制（图4），而对于ZjDREB基因来说，共鉴定到3个片段重复（segmental duplication， SD）基因对（图4），分别为位于7和8号染色体上的ZjDREB15/ZjDREB16，ZjDREB57/ZjDREB61，和位于19和20号染色体上的ZjDREB46/ZjDREB47（表3）。另外，还发现每对重复基因都聚集在同一个组中，比如ZjDREB15/ZjDREB16，ZjDREB46/ZjDREB47属于A₆组（图1），ZjDREB57/ZjDREB61属于A₅组（图1），产生这种现象的原因很可能是基因加倍。上述基因对的Ka/Ks均小于1，表明ZjDREB家族基因的3个片段重复基因对在基因扩张中受纯化选择（表3）。

2.5 结缕草ZjDREB A₁和A₂组基因AP2保守结构域及启动子区顺式作用元件分析

由于DREB A₁和A₂组属于典型的DREB蛋白质，且与植物的非生物胁迫密切相关。因此对A₁和A₂组蛋白质的AP2结构域进行了多重序列比对分析。本研究发现结缕草A₁和A₂组中的第14位氨基酸是绝对保守的缬氨酸（V），而第19位的氨基酸在各自组内相对保守，只有A₁组中的ZjDREB12为缬氨酸（V），其余均为谷氨酸（图5A）。另外，在A₁组中，有核定位信号（nuclear localization signal， NLS）序列“PKR/KP/RAGRTKFR/KETRHP”位于AP2结构域的上游，DSAW基序位于AP2结构域的下游。在A₂组中，所有结缕草ZjDREB蛋白的AP2结构域上游均含有序列为“K/RGKGGPxN”的CMIV-1结构域和PKK样的NLS序列（图5B）。

使用Plant CARE数据库对结缕草ZjDREB A₁和A₂组基因启动子区域的顺式作用元件进行分析，结果表明A₁和A₂组基因启动子区域均包含一个或多个与植物激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。在A₁组中包括与茉莉酸甲酯MeJA响应相关的作用元件（CGTCA-motif和TGACG-motif），与脱落酸（ABA）响应相关的作用元件ABRE，与赤霉素（gibberellin， GA）响应相关的作用元件GARE-motif，与光胁迫响应相关的作用元件（G-box和ATC-motif），与低温胁迫响应相关的作用元件LTR，与干旱胁迫响应相关的作用元件MBS，与逆境胁迫响应相关的作用元件TC-rich，以及能够被多种转录因子结合的MYB和MYC作用元件（图5A）。在A₂组中除TC-rich外，其他作用元件均含有，另外还有参与光胁迫响应相关的MYB作用元件（MRE）和黄酮类生物合成的MYB作用元件（MBSI）（图5B）。

2.6 低温和高盐胁迫处理下A₁和A₂组基因的表达模式分析

为分别研究ZjDREB A₁组基因在低温和ABA、A₂组基因在干旱和高盐胁迫下的响应，对2月龄结缕草幼苗分别进行低温（4 ℃）、ABA（200 mg·L^-1）、干旱（20% PEG-6000）和高盐（200 mmol·L^-1 NaCl）胁迫处理，并于处理之后的0、1和24 h用qRT-PCR的方法检测ZjDREB基因A₁和A₂组的表达情况。结果显示，A₁组基因在低温和ABA诱导后上调表达，其中ZjDREB3上调幅度最大，在低温下第1 h时平均上调12.7倍，ABA为65.2倍（图6A）。A₂组基因在干旱诱导后除ZjDREB9外，均上调表达，其中ZjDREB4上调幅度最大，第1 h时平均上调38.3倍，而ZjDREB9在第1 h时平均下调0.8倍（图6B）。盐胁迫处理下，只有ZjDREB11先经过轻微下调后上升，ZjDREB1、ZjDREB4、ZjDREB9、ZjDREB13、ZjDREB21和ZjDREB24均表现出上调趋势，其中ZjDREB4的上调幅度最大，第24 h时平均上调158.7倍（图6B）。以上分析结果表明了结缕草ZjDREB家族A₁和A₂组基因在响应非生物胁迫应答中的潜在作用。

3 讨论

大量研究表明，DREB家族是植物AP2/ERF转录因子超家族中的重要成员^［6，9］，通过直接或调节下游靶基因的表达来间接参与非生物胁迫应答，并在逆境条件下提高植物的耐受性。自Stockinger等^［5］首次从拟南芥中分离出AtCBF1基因以来，越来越多的DREB基因从不同物种中被鉴定出来并进行了功能研究^［36］。在结缕草中，仅有少数ZjDREB基因的功能被报道^［37-41］，而对ZjDREB家族基因的系统解析还未得到深入研究。本研究中，基于结缕草的全基因组序列，共鉴定出64个ZjDREB基因，与双子叶拟南芥（57个）^［9］、大豆（73个）^［15］和单子叶水稻（57个）^［42］等植物相近。并对其系统进化、结构特性、保守基序、染色体定位、共线性、典型ZjDREB基因A₁和A₂组启动子顺式元件和非生物胁迫下的表达模式进行了深入探讨。

依据拟南芥中DREB的分类方法对64个ZjDREB基因进行分类，共划分为6组（A₁=5，A₂=7，A₃=1，A₄=18，A₅=13，A₆=20），各组所包含的基因数量与拟南芥^［9］（A₁=6，A₂=8，A₃=1，A₄=16，A₅=16，A₆=10）、水稻^［42］（A₁=10，A₂=6，A₃=5，A₄=12，A₅=15，A₆=9）相当，成员数量最少的均为A₃组，说明结缕草ZjDREB家族基因在进化过程中没有发生大规模的基因丢失现象。有趣的是结缕草A₆组所包含的基因数量最多，与拟南芥和水稻的A₄组所包含基因数量最多的结果不同，说明结缕草A₆组在进化过程中发生了基因扩张现象，这可能是由于片段重复造成的。在对结缕草ZjDREB基因的共线性分析中，共鉴定到3对片段重复基因，其中ZjDREB15/ZjDREB16，ZjDREB46/ZjDREB47均属于A₆组，这也直接证明了片段重复在结缕草ZjDREB家族基因的扩张中发挥了主要作用。

基因结构分析显示ZjDREB家族基因中27个基因没有内含子，其中A₅组ZjDREB54包含的内含子数量最多，为8个。在A₁和A₂组中，ZjDREB1、ZjDREB9、ZjDREB12、ZjDREB13和ZjDREB24均只含有一个内含子，而ZjDREB11、ZjDREB19和ZjDREB21缺乏内含子。这与DREB家族基因在多个物种中少内含子的特征一致，如欧李（Cerasus humilis）^［43］，文冠果（Xanthoceras sorbifolium）^［44］，马铃薯^［17］和玉米^［11］等。有研究显示内含子数量与基因响应胁迫应答的速度有关，内含子的存在能够引起选择性剪切，增加了基因从转录到翻译所需要的时间，以至于延迟了调节反应^［45］。这也说明ZjDREB家族基因可能在结缕草胁迫应答的早期发挥重要作用。从ZjDREB家族基因蛋白序列鉴定到的10个保守基序中，motif1、motif2和motif3在所有蛋白序列中的分布相对保守，为AP2保守结构域的组成部分。另外，同一组内的成员往往具有相似的基序组成，例如motif4和motif9只分布在A₆组中，这也说明相同组内的ZjDREB基因在功能上相似，而在不同组之间具有功能特异性。

由于A₁和A₂组为典型的DREB蛋白，A₁组也被称为DREB1s，A₂组也被称为DREB2s^{［11，46］}。因此，对结缕草ZjDREB转录因子A₁和A₂组成员的AP2结构域、非生物胁迫下的表达模式以及启动子区域的顺式作用元件进行了进一步分析。对A₁和A₂组成员AP2结构域的序列分析中发现，第14位的缬氨酸（V）是保守的，而第19位的氨基酸在A₁组中的ZjDREB12为缬氨酸（V），而非谷氨酸（E），说明该位点氨基酸的保守性并不是绝对的，这与拟南芥和辣椒（Capsicum annuum）中关于DREB保守结构域中第14和19位氨基酸的保守性研究一致^［9，47］。研究表明，DREB转录因子A₁组成员参与低温胁迫应答，如拟南芥的AtCBF1，水稻DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1和DREB1C/CBF2等在低温胁迫下均能被快速诱导表达^{［26，48］}。A₂组成员主要与植物的抗旱和耐盐性有关，如拟南芥的AtDREB2A、AtDREB2B受脱水和高盐胁迫诱导表达^［9］。对结缕草ZjDREB A₁和A₂组基因的启动子分析显示，A₁和A₂组含有多个与植物激素、光、低温和干旱等逆境响应相关的作用元件，表明A₁和A₂组基因在结缕草胁迫信号传导和应答过程中发挥重要调控作用。

在低温、脱落酸、干旱和盐胁迫处理后，部分ZjDREB A₁和A₂基因明显被诱导表达，说明其在结缕草幼苗期的胁迫应答中发挥关键作用。其中，A₁组基因ZjDREB3受低温诱导上调幅度最大，且启动子区域未检测到低温胁迫的LTR元件，这一结果与文冠果中部分低温诱导表达基因的结果相同^［44］，这可能与ZjDREB3无内含子的基因结构以及胁迫处理的时间点有关。另外，A₁组基因受外源施加的ABA诱导表达，这与水稻^［49］和番茄（Solanum lycopersicum）^［50］等物种中关于DREB基因的结果相同。A₂组基因在干旱和高盐胁迫处理下，表达量发生变化。其中ZjDREB9受干旱胁迫诱导先下降后上升，而在高盐胁迫诱导下先上升后下降，Wang等^［40］早期用3′和5′ RACE的方法克隆得到该基因，并命名为ZjDREB1，发现该基因在3种不同的结缕草品系（“Meyer”“Palisades”和“Lanyin 3”）中受低温诱导上调表达，表明该基因可能在结缕草的非生物胁迫耐受性中发挥重要调节作用。

4 结论

本研究基于结缕草基因组数据，对ZjDREB转录因子家族基因进行了系统的筛选与鉴定，共鉴定到64个 ZjDREB基因。系统进化分析将其分为A₁~A₆共6组，其中61个基因不均匀地分布在20条染色体中的14条上。保守基序motif1、motif2和motif3在所有ZjDREB蛋白序列中的分布相对保守，而在所有ZjDREB基因中，未鉴定到串联重复基因，共有3对由于片段重复引起的重复基因。ZjDREB A₁和A₂组基因在结缕草的低温、ABA、干旱和高盐胁迫下的表达模式分析显示，A₁和A₂组基因广泛参与结缕草的低温、脱落酸、干旱和高盐胁迫响应过程。本研究结果为进一步探索 ZjDREB基因的功能奠定了基础，也为结缕草抗非生物胁迫新品种的创制提供了候选基因。

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基金资助

山东省牧草产业技术体系(SDAIT-23-01)