乳酸菌和抗真菌添加剂对湿啤酒糟全混合日粮青贮发酵品质、体外消化率及有氧稳定性的影响

Effects of biological and antifungal additives on ensiling characteristics， in vitro digestibility， gas production， and aerobic stability of fermented total mixed ration including wet brewers’ grains

摘要

湿啤酒糟是一种产量庞大且富含粗蛋白、维生素和矿物质等营养物质的工业副产物，但其含水量高不易保存，严重限制其应用于反刍动物养殖。为此，本试验旨在评价乳酸菌及抗真菌添加剂对湿啤酒糟全混合日粮（TMR）青贮发酵品质、体外消化率及有氧稳定性的影响。试验设对照组（control）、干酪乳杆菌组［LC，1×10⁶ cfu·g^-1 鲜重（FW）］、布氏乳杆菌组（LB，1×10⁶ cfu·g^-1 FW）、山梨酸钾组（POS，1 g·kg^-1 FW）、双乙酸钠组（SOD，5 g·kg^-1 FW）和丙酸钙组（CAP，5 g·kg^-1 FW）6个处理。青贮100 d后全部开窖（20 L），取样分析发酵品质、化学成分及微生物数量，同时将剩余TMR有氧暴露，分别在第6、9和14天取样分析，评价其有氧稳定性。结果表明，青贮100 d后，各组TMR发酵品质良好，具有较低的pH值（4.32~4.47）、丁酸［0.837~1.750 g·kg^-1 干重（DM）］及氨态氮（76.7~91.8 g·kg^-1 全氮）含量。对照、LB、POS和SOD组有氧稳定性均较好，其中POS组在有氧暴露第14天时具有更低的好氧菌（5.50 vs. 6.56~7.66 log₁₀ cfu·g^-1 FW）和霉菌数量（4.93 vs. 4.96~5.91 log₁₀ cfu·g^-1 FW）。相较于对照组，POS组和CAP组均提高了体外干物质消化率（62.5%、65.4% vs. 55.3%）和体外中性洗涤纤维消化率（56.3%、59.1% vs. 48.2%）。综合考虑，在生产湿啤酒糟（100 g·kg^-1 FW）发酵TMR饲料时可添加1 g·kg^-1 FW的山梨酸钾，既能改善有氧稳定性，还能提高体外消化率。

Abstract

Wet brewers’ grain （WBG） is an industrial by-product that is produced in large quantities， and is rich in nutrients， including crude proteins， vitamins， and minerals. However， the high water content makes it challenging to preserve WBG， and this severely limits its use in ruminant farming. Hence， the aim of this study was to investigate the effects of biological and antifungal additives on the fermentation quality， in vitro digestibility， and aerobic stability of fermented total mixed ration （TMR） containing WBG at a concentration of 100 g·kg^-1 fresh weight （FW）. The TMR was ensiled in 20-L silos with six treatments： 1） no additives （Control）； 2） Lacticaseibacillus casei （LC； applied at 1×10⁶ cfu·g^-1 FW）； 3） Lentilactobacillus buchneri （LB； 1×10⁶ cfu·g^-1 FW）； 4） potassium sorbate （POS； 1 g·kg^-1 FW）； 5） sodium diacetate （SOD； 5 g·kg^-1 FW）； and 6） calcium propionate （CAP； 5 g·kg^-1 FW）. All silos were opened after 100 days of ensiling to evaluate the fermentation quality and in vitro digestibility of the silages， followed by a 14-day aerobic stability test. All the TMR silages were well-preserved with low pH （4.32-4.47） and acceptable levels of butyric acid （0.837-1.750 g·kg^-1 dry matter） and ammonia nitrogen （76.7-91.8 g·kg^-1 total nitrogen）. The control， LB， POS， and SOD silages remained stable during the 14-day aerobic stability test， and the POS silage was the most stable. Compared with the other silages， the POS silage had smaller populations of aerobic bacteria （5.50 vs. 6.56-7.66 log₁₀ cfu·g^-1 FW） and mold （4.93 vs. 4.96-5.91 log₁₀ cfu·g^-1 FW） on day 14 of the aerobic stability test. The POS and CAP silages showed increased in vitro digestibility of dry matter （62.5%-65.4% vs. 55.3% in the control） and neutral detergent fiber （56.3%-59.1% vs. 48.2% in the control）. Overall， POS （applied at 1 g·kg^-1 FW） is recommended as an additive to improve the fermentation quality， aerobic stability， and in vitro digestibility of fermented TMR containing 100 g·kg^-1 FW WBG.

关键词

乳酸菌 / 抗真菌添加剂 / 全混合日粮 / 发酵品质 / 有氧稳定性

Key words

lactic acid bacteria / antifungal additives / total mixed ration / fermentation quality / aerobic stability

全混合日粮（total mixed ration， TMR）含有精料、粗饲料、矿物质和维生素等原料，具有各营养物质比例平衡的特点，可满足动物生长需求，目前已被广泛用于饲喂反刍动物^［1］。将TMR饲料置于密闭厌氧环境中进行长时间青贮发酵，即可制成发酵TMR饲料（fermented TMR， FTMR）^［2］。与传统TMR饲料相比，制备发酵TMR饲料时对大型机械（TMR搅拌机等）和人力的依赖较少，发酵后可中和原料中的难闻气味，同时在贮藏期间仍可保持各营养成分均一^［3］。湿啤酒糟（wet brewers’ grains， WBG）富含粗蛋白、维生素和矿物质等营养物质，是啤酒工业生产中的副产物^［4］。中国每年生产的湿啤酒糟超过1000万t，湿啤酒糟的生产成本低廉^［5］。若对湿啤酒糟进行人工干燥处理，会大幅增加生产成本，且湿啤酒糟的利用存在一定季节性。因此，将湿啤酒糟开发为可长期贮存的发酵TMR饲料原料是一种较好的加工利用方式。但湿啤酒糟水分含量高且易变质，为此，需要添加一些乳酸菌及抗真菌添加剂来改善湿啤酒糟TMR青贮饲料的发酵品质。

近年来，多种青贮添加剂已被开发用于改善青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性^［6］。Nishino等^［7］研究发现，添加干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei， LC）能有效降低青贮饲料中的生物胺含量。Kleinschmit等^［8］发现添加布氏乳杆菌（Lentilactobacillus buchneri， LB）可明显提高全株玉米（Zea mays）青贮饲料的有氧稳定性。然而，乳酸菌接种剂的活性高度依赖于饲料原料的特性和环境条件^［9］，因此，化学添加剂通常比乳酸菌接种剂发挥得更加稳定^［10］。山梨酸钾（potassium sorbate， POS）和双乙酸钠（sodium diacetate， SOD）是具有抗真菌特性的有机酸盐类添加剂。山梨酸钾凭借其抗菌活性已被添加应用在全株玉米青贮饲料中，防止其发生有氧腐败^［11］。Knický等^［12］发现，山梨酸钾能有效抑制酵母、霉菌和梭菌的生长。双乙酸钠易解离形成乙酸，因此可在青贮过程中抑制有害微生物的活性^［13］。Okur等^［14］也发现，添加双乙酸钠可有效改善全株玉米青贮饲料的有氧稳定性。丙酸钙（calcium propionate， CAP）是食品及饲料防腐剂中的主要成分，能有效抑制霉菌和其他微生物^［15］。目前关于乳酸菌接种剂和抗真菌添加剂对湿啤酒糟发酵TMR饲料品质、有氧稳定性及体外消化率的影响尚不清楚。

本试验旨在研究干酪乳杆菌、布氏乳杆菌、山梨酸钾、双乙酸钠和丙酸钙对湿啤酒糟TMR青贮发酵品质、有氧稳定性和体外消化率的影响，为扩大粗饲料来源、降低饲料成本、生产优质发酵TMR饲料提供理论依据和技术支撑，促进当地养殖业可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

全混合日粮由湿啤酒糟、全株燕麦（Avena sativa，收获于乳熟期）、精料、箭筈豌豆（Vicia sativa，收获于结荚期）和青稞（Hordeum vulgare var. coeleste）秸秆（收获籽实后剩余部分）配制而成。箭筈豌豆、燕麦和青稞均种植于西藏日喀则地区草原工作站试验地（29.27° N，88.88° E），材料草于2023年7月25日刈割。精料主要含200 g·kg^-1 鲜重（fresh weight， FW）菜籽粕、75 g·kg^-1 FW玉米粉、275 g·kg^-1 FW玉米酒糟（distillers dried grains with soluble， DDGS）、200 g·kg^-1 FW小麦（Triticum aestivum）麸、200 g·kg^-1 FW全棉（Gossypium hirsutum）籽、50 g·kg^-1 FW维生素矿物质。全株燕麦、箭筈豌豆和青稞秸秆均被铡刀切成10~20 mm长度，按照试验设计与精料充分混匀。全混合日粮饲料中各原料的化学成分如表1所示。青贮前全混合日粮中各原料组成、微生物数量及化学成分如表2所示。

试验采用完全随机设计，设对照组（control，添加等量去离子水）、干酪乳杆菌组（LC，添加1×10⁶ cfu·g^-1 FW）、布氏乳杆菌组（LB，添加1×10⁶ cfu·g^-1 FW）、山梨酸钾组（POS，添加1 g·kg^-1 FW，食品级添加剂，纯度98%，购于中国宁波王龙科技有限公司）、双乙酸钠组（SOD，添加5 g·kg^-1 FW，食品级添加剂，纯度99%，购于中国锦州吉荣氨基酸有限公司）和丙酸钙组（CAP，5 g·kg^-1 FW，食品级添加剂，纯度99%，购于中国南通奥凯生物科技发展有限公司）。每组设6个青贮密封桶作重复（每个塑料青贮桶容积为20 L，圆柱状，有内外盖，密封性良好）。接种前，将乳酸菌菌株在MRS（deMan， Rogosa and Sharp）液体培养基（10 g蛋白胨、5 g牛肉粉、4 g酵母粉、2 g葡萄糖、1 mL吐温-80、2 g磷酸氢二钾、5 g乙酸钠、2 g柠檬酸三铵、0.2 g硫酸镁、0.05 g硫酸锰、1000 mL蒸馏水）（购于上海百维科技有限公司）中进行培养，当布氏乳杆菌和干酪乳杆菌均达到目标接种浓度1×10⁶ cfu·g^-1 FW后在TMR中进行接种。将乳酸菌接种剂与去离子水混合后，利用手动喷壶将乳酸菌接种剂均匀喷洒在TMR上，并持续搅拌5 min。用去离子水对化学添加剂进行稀释，每kg（FW）TMR原料上用手动喷壶喷洒10 mL化学添加剂稀释液。在对照组中喷洒等量去离子水。每个青贮桶中可装入约9 kg FW的TMR原料，压实密度可达约250 kg干物质（dry matter， DM）·m^-3。共计36个青贮桶（6个处理×6个重复），室温（20~24 ℃）下密封保存100 d（2023年8-11月）。

青贮100 d后，开启青贮桶，将每个桶表面上方约3 cm厚的TMR饲料丢弃。随后将每个桶中剩余的饲料倒在干净塑料膜上充分混匀后取样。每个桶中取约1 kg FW的发酵TMR饲料用于分析发酵品质和微生物计数。留下约3 kg FW的发酵TMR饲料进行有氧稳定性评估。

将约3 kg FW的TMR青贮饲料无压实装填至10 L的敞口无菌塑料桶中，桶口用双层纱布包裹，防止环境污染和水分散失，空气可自由进入桶中，置于室温（环境温度为18~22 ℃）下有氧暴露14 d。每个处理设6个重复，分别在有氧暴露0、6、9和14 d后取样分析pH、氨态氮、有机酸、水溶性碳水化合物含量和微生物数量的动态变化。若青贮饲料中pH值比初始pH值（有氧暴露第0天时）升高0.5即可判定发生了有氧腐败^［16］。

1.2 化学与微生物成分分析

分别对TMR原料和青贮前后的发酵TMR饲料进行取样分析。将第一份子样品（20.0 g FW）与100 mL去离子水混合并打碎成匀浆，经双层无菌纱布过滤后得到滤液，保存于-20 ℃冰箱，用于测定发酵品质。使用pH计（S400-K，瑞士苏黎世梅特勒-托莱多公司）测定样品pH值。采用氢氧化钠-盐酸滴定法测定新鲜原料的缓冲能（buffering capacity）^［17］。使用高效液相色谱法［安捷伦1260型高效液相检测系统，配备示差检测器；流动相为2.5 mmol·L^-1硫酸溶液，流速0.5 mL·min^-1，柱温55 ℃；色谱柱采用Carbomix H-NP柱（型号260508-7830），购自苏州赛分科技股份有限公司］测定样品中的乙醇及有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）含量^［5］。采用次氯酸-苯酚比色法测定样品中的氨态氮（ammonia nitrogen， NH₃-N）含量^［18］。依据Conaghan等^［19］的方法对青贮饲料发酵品质进行评价。挥发性脂肪酸（volatile fatty acids， VFAs）为乙酸、丙酸和丁酸含量的总和。发酵终产物（fermented products， FP）为乳酸（lactic acid，LA）、乙酸、丙酸、丁酸（butyric acid， BA）和乙醇含量的总和。乳酸浓度以乳酸含量与发酵终产物的比值（LA∶FP）表示。青贮饲料品质可分为极差（LA∶FP≤50%，BA≥25 g·kg^-1 DM）、差（LA∶FP≤50%，BA<25 g·kg^-1 DM）、中（LA∶FP为50%~60%）、好（LA∶FP为61%~70%）、优（LA∶FP>70%）5个等级。

将第二份子样品（150 g FW）在65 ℃下烘干48 h至恒重。随后用小型饲料粉碎机（型号SFSP999，中鼎饲料机械生产有限公司）粉碎，过1 mm筛网（型号FW100，泰斯特仪器有限公司）后用于测定样品的营养成分。采用硫酸-蒽酮比色法测定样品中水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量^［20］。参照美国公职分析化学协会（Association of Official Analytical Chemists， AOAC） ^［21］的方法分别对酸性洗涤纤维（不含粗灰分）（acid detergent fiber expressed exclusive of residual ash， ADFom）、干物质（DM）、粗脂肪（ether extract， EE）、粗灰分（ash）和粗蛋白（crude protein， CP）含量进行测定。 根据Van Soest等^［22］的方法测定中性洗涤纤维（添加热稳定性淀粉醇，不含粗灰分）（neutral detergent fiber assayed with a heat stable amylase and expressed exclusive of residual ash， aNDFom）含量，测定时加入了耐高温α淀粉酶。非纤维性碳水化合物（non-fibrous carbohydrate，NFC）含量依据美国国家研究理事会（National Research Council， NRC）^［23］公布的肉牛营养需要公式计算（NFC=1000-CP-aNDFom-EE-Ash）。

参考Wang等^［5］的方法，取第3份子样品（10.0 g FW），与90 mL无菌生理盐水（0.85% NaCl）在200 mL锥形瓶中混合，置于水平摇床振荡2 h（速度120 r·min^-1）。振荡结束后，从锥形瓶中吸取1 mL液体进行梯度稀释，用于乳酸菌、好氧菌、霉菌和酵母菌计数。乳酸菌采用MRS（deMan， Rogosa， Sharpe）琼脂培养基（10 g蛋白胨、5 g牛肉粉、4 g酵母粉、2 g葡萄糖、1 mL吐温-80、2 g磷酸氢二钾、5 g乙酸钠、2 g柠檬酸三铵、0.2 g硫酸镁、0.05 g硫酸锰、15 g琼脂、1000 mL蒸馏水）在37 ℃厌氧培养箱中培养3 d。好氧菌采用营养琼脂培养基（nutrient agar；10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g氯化钠、15~20 g琼脂、1000 mL蒸馏水）培养，霉菌和酵母菌采用马铃薯（Solanum tuberosum）葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar；200 g马铃薯、20 g葡萄糖、15~20 g琼脂、1000 mL蒸馏水）培养，好氧菌、霉菌和酵母菌均在37 ℃生化培养箱中培养3 d，培养基均购自上海盛思生化科技有限公司。

1.3 体外产气及消化试验

根据Menke等^［24］的方法测定发酵TMR饲料样品的体外消化率及产气量（gas production， GP）。选取5只健康成年波尔公山羊（平均初始体重为99.7 kg）作为瘤胃液供体，试验期间在早晨7：30和傍晚5：30分别饲喂含有45%（DM）商品精料和55%（DM）粗饲料（由50%燕麦干草和5%箭筈豌豆干草组成）的基础饲粮，保证自由饮水。在晨饲前2 h收集山羊瘤胃液，经4层粗纱布过滤挤压至血清瓶（128 mL）中，血清瓶中含有预热过的（39 °C）缓冲液［瘤胃液∶缓冲液=1∶2（体积比），共50 mL］和烘干后的饲料样品（1 g DM），并持续用CO₂冲洗。在39 °C的水浴摇床中培养72 h，每组3个重复，分别在2、4、8、12、24、36、48和72 h时记录产生的气体体积（mL）。利用烘干草粉样品测定干物质消化率（in vitro dry matter digestibility， IVDMD）和中性洗涤纤维消化率（in vitro neutral detergent fiber degradability， IVNDFD）^［5］，计算公式分别如下：

IVDMD（%）＝100×［发酵前底物重（g）-发酵后残留底物重（g）］/发酵前底物重（g）

IVNDFD（%）＝100×［发酵前底物NDF含量（g）-发酵后残留底物NDF含量（g）］/发酵前底物NDF含量（g）

根据以下动态发酵模型，利用SAS软件计算体外动态产气参数^［5］，计算公式如下：

Y＝b×（1-e^－ct ）

式中：Y代表t时间点1 g发酵底物的产气量（mL）；b代表1 g发酵底物72 h理论最大产气量（mL）；c代表产气速率（mL·h^-1）；t代表体外发酵时间（h）。

1.4 数据处理与统计分析

在评价TMR青贮饲料发酵品质和体外消化率及产气的试验中，采用完全随机试验设计，共设6个处理，每个处理6个重复。使用SPSS（13.0）软件进行统计分析。采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）对TMR饲料的发酵品质及体外产气和消化率数据进行分析：

Y_i =μ+T_i +e_ij

式中：μ为最小二乘平均值；Y_i 为因变量（i=1，2，3，4，5，6）；e_ij 为残差项；T_i 为青贮添加剂处理。

在有氧暴露期间，试验采用完全随机设计，设有6种青贮添加剂和4个有氧暴露时间点，每个处理6个重复。根据6种青贮添加剂和4个有氧暴露时间点，为6×4因子试验设计，对样品化学成分及微生物数量进行双因素方差分析（two-way ANOVA），使用SPSS（13.0）软件分析：

Y_ij =μ+T_i +D_j +（T×D） _ij +e_ij

式中：Y_ij 为因变量；μ为总体均值；T_i 是青贮添加剂处理（i=1，2，3，4，5，6）；D_j 是有氧暴露时间点（j=1，2，3，4）；（T×D） _ij 为青贮添加剂与有氧暴露时间点的交互作用；e_ij 是残差项。采用多项式正交对比（线性及二次）来评估不同处理下有氧暴露时间对发酵TMR饲料化学及微生物成分的影响。

采用Tukey方法对处理间及有氧暴露天数间数据进行多重比较，采用平均值和均值标准误（standard error of the mean， SEM）表示结果数据，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 TMR饲料发酵品质、化学成分及微生物数量

各青贮添加剂均显著（P<0.01）影响TMR饲料发酵品质、化学成分和微生物数量（表3）。青贮100 d后，LC组中乳酸含量最高。与对照组相比，POS、SOD和CAP组中乳酸含量显著降低。LB组中乳酸含量显著低于LC组。CAP和SOD组中丙酸及乙酸含量分别最高。各组丁酸及氨态氮含量分别低于2.00 g·kg^-1 DM和93.0 g·kg^-1总氮。与对照组相比，LC和LB组中丁酸含量较高。与其他组相比，CAP和SOD组中挥发性脂肪酸（VFAs）含量较高。LC组中LA∶FP最高，各处理组中乙醇含量均显著低于对照组。

与其他组相比，LC和LB组中DM含量均较低。LB和CAP组中CP含量均高于其他组。各处理组中粗灰分含量均高于对照组。LC组中粗脂肪和ADFom含量最低，aNDFom含量最高。相较于青贮前的TMR，青贮后除LB组外各组aNDFom含量均出现升高，而处理组中ADFom含量则出现不同程度下降；青贮后，各组乳酸菌数量升高，酵母菌、霉菌和好氧菌数量则出现不同程度变化。

2.2 有氧稳定性

青贮添加剂与有氧暴露天数的交互作用对发酵TMR饲料的pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙醇、WSC和NH₃-N含量及乳酸菌、好氧菌、酵母菌和霉菌数量均有显著影响（P<0.001）（表4和表5）。青贮添加剂对pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙醇、WSC和NH₃-N含量及乳酸菌、好氧菌、酵母菌数量有显著影响（P<0.001）。有氧暴露14 d内，对照组、LC、LB、POS和CAP组的pH值分别增加了0.07、0.68、0.02、0.09和2.28，SOD组pH下降0.01。LC组中乳酸含量呈线性降低趋势（P<0.001）。有氧暴露的第9、14天时，LB和SOD组中乙酸含量较高（>15.0 g·kg^-1 DM）。有氧暴露期间，对照组中乙醇含量呈降低趋势（P<0.001）。有氧暴露第14天时，POS组中好氧菌数量（5.50 vs. 6.56~7.66 log₁₀ cfu·g^-1 FW）和霉菌数量（4.93 vs. 4.96~5.91 log₁₀ cfu·g^-1 FW）均低于其他组。

2.3 体外消化率及产气动力学指标

青贮添加剂对体外消化率和产气动力学指标均有显著影响（P<0.05）（表6）。LB、POS和CAP组的IVDMD和IVNDFD均高于对照组。LC、LB和CAP组的72 h累积产气量（GP₇₂）和潜在产气量均高于对照组。

3 讨论

3.1 发酵TMR原料特性

优质的青贮饲料需要具备适宜的干物质含量（250~400 g·kg^-1 DM）、较高的WSC含量、较低的缓冲能和充足的乳酸菌数量^［25］。本试验中，TMR原料中较高的干物质含量可能会抑制青贮过程中的乳酸发酵。水分是乳酸菌生长代谢所必需的，同时对青贮过程中氧气的初始水平和运输具有显著影响，因此，青贮原料中的水分含量对青贮发酵品质的优劣至关重要^［26］。Keshri等^［27］发现青贮饲料中较高的干物质含量可能会抑制青贮原料自身附着乳酸菌的繁殖能力和代谢活性。此外，青贮原料中充足的WSC含量也是获得优质青贮饲料的重要保证^［28］。本试验中，青贮前TMR饲料的WSC含量高于60~70 g·kg^-1 DM（此含量被认为是制作优质青贮饲料的理论最低值），这有助于青贮中乳酸菌的生长繁殖，促进乳酸发酵，可确保青贮发酵过程成功进行^［29］。

本试验中，TMR原料上发现附着有较高数量的酵母菌和霉菌。青贮过程中，酵母菌大量繁殖会导致青贮饲料中干物质和能量损失较大^［30］。有氧暴露后，酵母菌通过消耗发酵底物和乳酸引起青贮饲料中pH值和内部温度升高，造成有氧腐败^［31］。最终，霉菌也会介入促使青贮饲料发霉变质^［32］。研究表明，对于保存良好的青贮饲料，霉菌和酵母菌数量不应超过3~4 log₁₀ cfu·g^-1 FW^［33］，青贮饲料中酵母菌和霉菌的数量越多，有氧暴露后其有氧腐败的风险就越大。此外，青贮前TMR原料中较高的粗脂肪含量也会促使青贮饲料中不良微生物的生长繁殖，最终影响青贮发酵品质^［34］。因此，使用一些抗真菌添加剂来改善发酵TMR饲料的卫生品质是很有必要的。本试验中，提出可以利用生物和化学添加剂将含湿啤酒糟的TMR原料发酵制成优质TMR青贮饲料。

3.2 添加剂对TMR青贮饲料发酵品质的影响

青贮100 d后，各组发酵TMR饲料均保存良好，但其pH值均大于4.2，这可能是由于各组中干物质含量较高导致的。研究表明，干物质含量较高的青贮饲料在较高的pH条件下依然能得到良好贮存^［35］。此外，各组发酵TMR饲料中乳酸含量均在80~120 g·kg^-1 DM的理想范围内^［36］。LC组中乳酸含量最高，这可能是由于干酪乳杆菌属于兼性异型发酵乳酸菌，通常将己糖同型发酵为乳酸，但在特殊条件下会进行异型发酵，产生乳酸、CO₂和乙醇（或乙酸）^［37］。LB组中乳酸含量低于LC组，可能与乳酸菌（LAB）接种剂中乳酸菌菌株的代谢途径不同有关。布氏乳杆菌属于专性异型发酵乳酸菌，可将己糖发酵为乳酸、二氧化碳和乙醇（或乙酸），其产乳酸效率低于干酪乳杆菌^［37］。因此，作为发酵TMR饲料的乳酸菌接种剂，干酪乳杆菌在青贮发酵过程中的产乳酸能力要强于布氏乳杆菌。LC组中较高的LA∶FP也证实了LC组中较强的同型发酵。

与对照组相比，POS、SOD和CAP组中乳酸含量较低，可能是由于这些化学添加剂的抗菌特性抑制了青贮饲料中微生物（包括乳酸菌）的生长和活性^［2］。山梨酸钾、双乙酸钠和丙酸钙添加剂可以电离产生相应的有机酸（主要有山梨酸、乙酸、丙酸）和盐离子，它们具有酸性特性和抗菌性能^［38］。这些有机酸的未解离分子可以穿过质膜，释放质子使细胞质酸化，从而阻止微生物的生长和活动^［39］。Han等^［40］发现施用苯甲酸钠（1 g·kg^-1 FW）添加剂不仅可以抑制发酵TMR饲料中不良微生物的生长，还会抑制乳酸菌的活性。因此，有机酸盐的适宜添加量还需在今后研究中进一步评估。此外，CAP和SOD组的丙酸和乙酸含量分别在各处理组中均最高，这可能是由于丙酸钙和双乙酸钠添加剂电离产生了一定的丙酸和乙酸，这也侧面解释了CAP和SOD组中VFAs含量高于其他组的现象。

优质的青贮饲料中丁酸含量应低于5 g·kg^-1 DM^［41］。各组发酵TMR饲料中丁酸含量均小于5 g·kg^-1 DM，表明发酵良好。青贮饲料中的氨态氮含量是反映蛋白质降解程度的指标，它直接影响着青贮饲料的营养价值。在发酵良好的青贮饲料中，氨态氮含量不应超过100 g·kg^-1 总氮（total nitrogen， TN）^［42］。本试验中，各组的氨态氮含量均小于92 g·kg^-1TN，证明各组TMR青贮饲料发酵品质良好。较高的干物质含量可有效抑制梭菌和肠杆菌的生长^［40］，这可能是各组丁酸及氨态氮含量均较低的原因。此外，LC和LB组中丁酸含量高于对照组，这可能是由于发酵TMR饲料中较高的干物质含量抑制青贮早期干酪乳杆菌和布氏乳杆菌的代谢活性。LB和LC组中干物质含量远低于其他组，这可能与LB和LC组中的LAB代谢活性增强有关。青贮过程中的酸性环境导致各处理组中ADFom含量降低，这可能与青贮饲料中结构性碳水化合物发生酸解有关^［4］。此外，相比于青贮前的TMR，发酵后除LB组外各组aNDFom含量升高，这可能是由于青贮过程中存在干物质损失，造成一定干物质含量范围内的aNDFom浓度增加。青贮后，各组乳酸菌数量出现升高，而酵母菌、霉菌和好氧菌数量均出现不同程度变化，其中乳酸菌接种剂和山梨酸钾添加剂对酵母菌和霉菌的抑制效果较为明显，这可能是由于青贮过程中的厌氧和酸性环境促进了乳酸菌的生长，同时乳酸菌的代谢产物和山梨酸钾解离生成的山梨酸均能有效抑制不良微生物的增殖。

青贮过程中，酵母菌可以代谢WSC产生二氧化碳和乙醇^［43］。本试验中，各处理组的乙醇含量均低于对照组，表明生物与化学添加剂均可抑制酵母菌活性，这可能是因为酸性环境及电离产生的有机酸抑制了酵母菌^［44-45］。与其他组相比，LC和LB组中干物质含量较低，且干物质损失较高，这可能与干酪乳杆菌和布氏乳杆菌具有不同的代谢途径有关。Holzer等^［37］研究发现，在异型发酵过程中，由于二氧化碳的产生，基于消耗WSC的干物质损失为5%~24%。

3.3 添加剂对TMR青贮饲料有氧稳定性的影响

引起有氧腐败的微生物往往会造成青贮饲料pH值升高和营养物质大量损失^［46］。有氧暴露期间，LC和CAP组中pH值升高，表明LC和CAP组在有氧暴露14 d后发生了有氧腐败，这可能与LC和CAP组中较高的乳酸和WSC含量有关。有氧腐败主要是由于耐酸的酵母大量消耗乳酸引起的^［47］。青贮窖开启后，较高的剩余WSC含量极易被酵母利用引起有氧腐败^［48］。因此，发酵TMR饲料中乳酸和WSC含量越高，越易发生有氧腐败。Holzer等^［37］也发现较高含量的乳酸和WSC以及VFAs的缺乏容易导致青贮饲料有氧腐败。

本试验中，LC和CAP组中乳酸含量的急剧下降进一步证明了在有氧暴露期间大量乳酸被酵母菌消耗利用。此外，LB和SOD组有氧暴露14 d后pH升高幅度较小，表明其有氧稳定性良好，这可能与它们含有较高的乙酸含量有关。研究表明，乙酸可有效抑制不良微生物的生长和活性，从而提高青贮饲料的有氧稳定性^［44］。酵母菌可通过消耗WSC产生乙醇，青贮饲料中较高的乙醇含量常伴随着较高的酵母菌数量和活性^［49］。因此，有氧暴露期间对照组中降低的乙醇含量表明了对照组中酵母菌的代谢活性也在不断下降。

有氧暴露14 d后，POS组中好氧菌和霉菌数量均低于其他各组，表明在有氧暴露期间山梨酸钾对好氧菌和霉菌的抑制效果要优于其他添加剂，这可能是由于山梨酸钾可以电离形成具有抗菌特性的山梨酸，而未解离的山梨酸可以穿过微生物的细胞膜，破坏微生物的代谢活性^［4］。此外，有机酸添加剂的抗菌效果取决于其解离常数（pKa）和环境pH，当环境pH低于其pKa时，有机酸添加剂会表现出更高的抗菌活性^［44］。POS、SOD和CAP的pKa值相近，青贮发酵100 d后，POS组比SOD和CAP组的抑菌效果更显著，这可能与POS组中pH值较低有关。

3.4 添加剂对TMR青贮饲料体外产气及消化率的影响

体外瘤胃产气量受可利用的氮含量和可发酵的碳水化合物含量影响^［50-51］。Menke等^［52］研究发现，体外产气量与饲料的有机物消化率之间具有很强的相关性。大量研究人员已成功应用这项技术来评估饲料的消化率^［53-54］，因为产气速率可以反映瘤胃的消化速率，从而影响干物质采食量。本试验中，与对照组相比，各处理组中发酵TMR饲料的潜在产气量和GP₇₂均有所增加，这可能是由于不同的添加剂处理减少了营养物质损失，从而提高了体外产气量，这与Kozelov等^［55］和Li等^［56］的研究结果相一致。体外干物质消化率是反映瘤胃饲料利用率的一个重要参数，对干物质的消化主要包括WSC、蛋白质、纤维等物质^［57］。LB、POS和CAP组中的IVDMD和IVNDFD均高于对照组，这可能是由于LB、POS和CAP组中的WSC含量高于对照组。与对照组相比，LC、LB和CAP组的GP₇₂和潜在产气量更高，这可能是由于这3种添加剂对酵母菌和霉菌的生长及活性具有抑制作用，从而减少了营养损失，为微生物的代谢活动提供了充足的底物和能量^［2］。

4 结论

青贮100 d后，各组发酵TMR饲料均保存良好。对照组、LB、POS和SOD组在有氧暴露的14 d内均呈稳定状态，而POS组在有氧暴露第14天时凭借好氧菌和霉菌数量较低而更加稳定。POS和CAP组提高了发酵TMR饲料的IVDMD和IVNDFD。综合考虑，在生产含100 g·kg^-1 FW湿啤酒糟发酵TMR饲料时可添加1 g·kg^-1 FW的山梨酸钾，既能改善有氧稳定性，还可提高体外消化率。本研究结果可为养殖户开发当地非常规饲料资源提供新思路，有效实现降本增效，具有一定推广价值，最终促进当地养殖业的蓬勃发展。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(32301500)

江苏现代农业产业技术体系建设专项资金(JATS［2023］398)

农业农村部种养结合重点实验室开放课题基金(202303)

江苏省大型科学仪器开放共享自主研究课题资助