太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期生长的影响

Effects of space mutagenesis on the growth of alfalfa （Medicago sativa） seedlings under PEG-6000 simulated drought stress

摘要

为探讨太空诱变对聚乙二醇6000（PEG-6000）模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期生长的影响，以14份诱变和14份未诱变材料为研究对象，以蒸馏水处理作为对照，采用PEG-6000模拟干旱胁迫处理方式，测定处理后生长相关指标，并利用隶属函数法进行综合评价。结果表明，干旱胁迫处理降低了大部分材料的株高、基茎粗、根长、单株鲜重、叶面积、叶周长、叶长和叶宽，而SPAD值反而升高。与未诱变材料相比，部分材料太空诱变后可缓解干旱胁迫引起的生长指标降低，而促进SPAD值升高。其中，巨能7诱变材料除株高外，其余生长指标均显著高于未诱变材料（P<0.05）；除此，诱变材料中，WL354的基茎粗和叶长， DS310FY的叶面积、叶周长、叶长和SPAD值，盐宝的叶面积、叶宽和SPAD值，WL343的叶面积、叶长、叶宽和SPAD值，甘农3号的叶长和SPAD值，皇冠的叶宽，中苜1号、南苜501和阿迪娜的SPAD值均显著高于其未诱变材料（P<0.05）；而未诱变材料中，阿迪娜的基茎粗，甘农6号的单株鲜重，甘农4号的叶面积、叶周长、叶长及WL354的叶宽和SPAD值均显著高于其诱变材料（P<0.05）。将各材料苗期耐旱性生长指标进行隶属函数综合分析得出，经PEG-6000干旱胁迫后，甘农3号、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜这8份材料的太空诱变材料生长指标隶属函数平均值较其未诱变材料高，说明从生长指标来看，这8份材料经太空诱变后耐旱性能得到提升。

Abstract

The aim of this work was to explore the effects of space mutagenesis on the growth of alfalfa （Medicago sativa） seedlings under simulated drought stress. An experiment was conducted in which 14 mutated and 14 non-mutated alfalfa materials were treated with polyethylene glycol 6000 （PEG-6000） to impose drought stress or with distilled water as the control. Growth-related indexes were measured for all the plant materials， and the membership function method was used for multivariate data evaluation. The results showed that the plant height， base stem diameter， root length， fresh weight per plant， leaf area， leaf circumference， leaf length， and leaf width of most materials was lower under drought stress than in the control， whereas the SPAD value was higher in the drought-stressed plants than in the control plants. Compared with the non-mutated materials， the most mutated materials showed lower levels of inhibition under drought stress， and higher SPAD values. With the exception of plant height， the growth indexes of mutated Juneng 7 were significantly higher than those of its non-mutated counterpart （P<0.05）. In addition， the base stem diameter and leaf length of mutated WL354， the leaf area， leaf circumference， leaf length， and SPAD value of mutated DS310FY， the leaf area， leaf width， and SPAD value of mutated Yanbao， the leaf area， leaf length， leaf width， and SPAD value of mutated WL343， the leaf length and SPAD value of mutated Gannong No.3， the leaf width of mutated Huangguan， and the SPAD value of mutated Zhongmu No.1， Nanmu 501， and Adina were all significantly higher than those of their respective non-mutated counterparts （P<0.05）. The base stem diameter of Adina， fresh weight per plant of Gannong No.6， leaf area， leaf circumference， leaf length of Gannong No.4， and leaf width and SPAD value of WL354 were significantly higher than those of their respective mutated counterparts （P<0.05）. We conducted a membership function analysis based on the growth indexes of the materials at the seedling stage under drought stress， and obtained a comprehensive score for each material. The average scores of eight mutated materials （Gannong No.3， DS310FY， Juneng 7， Nanmu 501， Huangguan， Yanbao， WL343 and Adina） were higher than those of their non-mutated counterparts. These results indicate that the drought resistance of these eight materials was improved by space mutagenesis.

Graphical abstract

关键词

太空诱变 / PEG-6000 / 干旱胁迫 / 紫花苜蓿 / 苗期 / 生长

Key words

space mutagenesis / PEG-6000 / drought stress / alfalfa / seedling stage / growth

紫花苜蓿（Medicago sativa）是我国重要的豆科牧草之一，是草食动物重要的优质饲料来源，它的优质高产与养殖业的健康发展息息相关^［1］。但紫花苜蓿具有异花授粉特性，遗传背景复杂，育种难度大，且周期较长。太空诱变育种是利用返回式航天器等诱发植物产生变异，在地面选育新种质、新材料，培育新品种的作物育种新技术^［2］。与其他育种方法相比，其具有诱变频率高、变异幅度大、育种时间短等特点^［3］。杨红善^［4］对太空诱变紫花苜蓿材料进行研究，筛选出了多叶、高产等正向变异的单株44株，并成功选育出紫花苜蓿新种质航苜2号。任卫波等^［5］研究发现，经卫星搭载后，紫花苜蓿茎粗、分枝数和产草量有所增加。因此，开展太空诱变紫花苜蓿材料的相关研究，可为紫花苜蓿航天育种及种质资源创制奠定基础。

干旱胁迫是影响植物生长的重要自然因素之一。在植物的生长阶段中，种子的萌发和幼苗生长阶段对干旱最为敏感^［6］。曾泽堂^［7］研究了干旱环境对紫花苜蓿苗期生长的影响，表明干旱胁迫可影响其苗期分枝数、株高和叶面积等生长指标。聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG-6000）是一种亲水性非常强的大分子聚合物，可阻塞植物系统的输导组织，常作为渗透调节剂应用到模拟干旱胁迫中^［8］。程波等^［9］利用PEG-6000模拟干旱胁迫环境，分析了5种紫花苜蓿种子萌发期的抗旱性强弱。另有研究发现，利用太空搭载技术对各种植物种子进行空间诱变处理，在许多植物中实现了抗逆性的提高^［10-11］。李晶等^［12］研究也表明，卫星搭载后提高了紫花苜蓿过氧化物酶活性，并进一步影响其抵抗外界胁迫的能力。因此，本研究以航天搭载和未搭载的紫花苜蓿种子材料为对象，研究太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期生长的影响，为紫花苜蓿太空诱变育种和耐旱性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料为2020年5月搭载由CZ-5B火箭发射的新一代载人飞船试验船的14份太空诱变种子和14份未诱变种子材料（共28份），名称分别为甘农6号、甘农4号、阿迪娜、劲能、WL354、甘农3号、WL343、南苜501、中苜3号、中苜1号、巨能7、DS310FY、盐宝和皇冠。试验材料均由宁夏农林科学院动物科学研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗的培养

本试验于2023年9月在宁夏农林科学院固原分院实验室进行。试验选择颗粒饱满、均匀一致的紫花苜蓿种子，种植于装有普通花土（花土∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1）的塑料花盆中（高15.5 cm，底径12 cm，外口径15 cm），每盆10株，室温下采用常规统一管理，培养1月左右每个处理选取长势一致的30株幼苗进行试验。

1.2.2 PEG-6000模拟干旱胁迫处理

将配制好的PEG-6000 溶液倒入容器中，将长势一致的幼苗从土里挖出，迅速将根清洗干净，用滤纸吸干水分后放入PEG-6000 溶液中，叶片在溶液之上，防止全部浸入溶液中，进行干旱胁迫处理^［13］。太空诱变材料和未诱变材料分别以蒸馏水处理相同的时间为对照，处理结束后测定各组试验材料的相关生长指标。试验处理具体分为4组，CK₁：未诱变材料蒸馏水处理；T₁：未诱变材料干旱处理；CK₂：诱变材料蒸馏水处理；T₂：诱变材料干旱处理。［备注：试验前期已根据叶片感应干旱胁迫的敏感点筛选出了各材料干旱胁迫的最适浓度和时间（表1）。为了诱变和未诱变材料后期比较相一致性，选择其材料中最先出现感应干旱胁迫的时间进行试验。］

1.3 指标测定及方法

每个处理选取10株植株，利用直尺（精度0.1 cm）测量株高和根长，用游标卡尺（精度0.02 mm）测定基茎粗。每个处理选9株（每组3株，3次重复），利用电子天平（精度0.001 g）测定整株鲜重，并计算单株鲜重。每个处理选取9片成熟的叶片（每组3片，3次重复），利用YMJ-CH智能叶面积测定仪系统（中国）测量叶面积、叶周长、叶长和叶宽，并计算单个叶片数值。每个处理选取10片成熟的叶片利用便携式叶绿素测定仪（SPAD-502，日本）测定SPAD值。

1.4 数据统计方法

采用Excel 2016初步整理试验数据，采用SPSS 26.0 进行单因素方差分析，Duncan’s 法进行多重比较，以 P<0.05作为差异显著性判断标准，利用GraphPad Prism 8对相关指标进行作图。利用隶属函数法对生长指标进行综合评价^［14］。

2 结果与分析

2.1 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期株高的影响

由图1可知，除阿迪娜诱变材料外，干旱胁迫处理降低了各材料株高，且未诱变材料中苜1号、WL354、DS310FY、阿迪娜和诱变材料中劲能、甘农3号、WL343分别与对照差异显著（P<0.05）。干旱胁迫处理后，诱变材料劲能、中苜3号、巨能7、皇冠、WL343和阿迪娜株高较未诱变材料高，但差异未达到显著水平（P>0.05）。

2.2 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期基茎粗的影响

由图2可知，干旱胁迫处理降低了各材料基茎粗，除劲能、中苜1号、甘农6号外的未诱变材料和除劲能、WL354、甘农6号和皇冠外的诱变材料与对照差异显著（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料劲能、WL354、DS310FY、甘农6号、甘农4号、巨能7、南苜501、皇冠和盐宝的基茎粗较未诱变材料高，且WL354和巨能7诱变材料与未诱变材料基茎粗差异显著（P<0.05），而阿迪娜未诱变材料基茎粗显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.3 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期根长的影响

由图3可知，干旱胁迫处理降低了部分材料根长，其中未诱变材料甘农3号、巨能7和诱变材料WL354的根长与对照差异显著（P<0.05），部分材料干旱胁迫后根长反而升高，但与对照差异均不显著（P>0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料劲能、甘农3号、甘农6号、巨能7、盐宝、WL343和阿迪娜的根长较未诱变材料高，且巨能7诱变材料与未诱变材料根长差异显著（P<0.05）。

2.4 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期单株鲜重的影响

由图4可知，干旱胁迫处理后，大部分材料单株鲜重降低，其中未诱变材料劲能、WL354、巨能7、南苜501、盐宝、WL343、阿迪娜和诱变材料中苜1号、WL354、甘农6号、南苜501、盐宝和WL343的单株鲜重与对照差异显著（P<0.05），部分材料干旱胁迫后单株鲜重反而升高，但与对照差异均不显著（P>0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料甘农3号、巨能7、皇冠、盐宝和阿迪娜的单株鲜重较未诱变材料高，且巨能7诱变材料与未诱变材料的单株鲜重差异显著（P<0.05），而甘农6号未诱变材料单株鲜重显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.5 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期叶面积的影响

由图5可知，干旱胁迫处理降低了各材料的叶面积，未诱变材料中除甘农6号、南苜501、阿迪娜外和诱变材料劲能、甘农3号、WL354、甘农4号、中苜3号、南苜501、WL343的叶面积与对照差异显著（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料除甘农4号和中苜3号外均较未诱变材料高，且DS310FY、巨能7、盐宝和WL343诱变材料与未诱变材料的叶面积差异显著（P<0.05），而甘农4号未诱变材料的叶面积显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.6 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期叶周长的影响

由图6可知，干旱胁迫处理降低了各材料叶周长，其中未诱变材料劲能、甘农3号、DS310FY、甘农6号、中苜3号、皇冠、盐宝、WL343、阿迪娜和诱变材料劲能、甘农3号、DS310FY、甘农6号、甘农4号、皇冠、盐宝、WL343、阿迪娜的叶周长与对照差异显著（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料甘农3号、WL354、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜的叶周长较未诱变材料高，且DS310FY和巨能7诱变材料与未诱变材料的叶周长差异显著（P<0.05），而甘农4号未诱变材料的叶周长显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.7 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期叶长的影响

由图7可知，干旱胁迫处理降低了各材料叶长，其中未诱变材料劲能、甘农3号、WL354、DS310FY、甘农4号、巨能7、皇冠、盐宝、WL343和诱变材料劲能、DS310FY、甘农6号、甘农4号、中苜3号的叶长与对照差异显著（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料甘农3号、WL354、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜的叶长较未诱变材料高，且甘农3号、WL354、DS310FY、巨能7和WL343诱变材料与未诱变材料的叶长差异显著（P<0.05），而甘农4号未诱变材料的叶长显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.8 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期叶宽的影响

由图8可知，干旱胁迫处理降低了各材料叶宽，其中未诱变材料甘农3号、WL354、DS310FY、甘农6号、甘农4号、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和诱变材料甘农3号、WL354、DS310FY、甘农6号、甘农4号、中苜3号、南苜501、皇冠、WL343、阿迪娜的叶宽与对照差异显著（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料甘农3号、巨能7、皇冠、盐宝和WL343的叶宽较未诱变材料高，且巨能7、皇冠、盐宝和WL343诱变材料与未诱变材料的叶宽差异显著（P<0.05），而WL354未诱变材料的叶宽显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.9 太空诱变对PEG-6000模拟干旱胁迫下紫花苜蓿材料苗期SPAD值的影响

由图9可知，干旱胁迫处理后，大部分材料的SPAD值升高，其中未诱变材料巨能7、南苜501和诱变材料劲能、甘农3号、巨能7、南苜501、WL343、阿迪娜的SPAD值与对照差异显著（P<0.05），而甘农4号未诱变和诱变材料干旱胁迫处理后均显著低于对照（P<0.05）；干旱胁迫处理后，诱变材料劲能、中苜1号、甘农3号、DS310FY、中苜3号、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜的SPAD值较未诱变材料高，且中苜1号、甘农3号、DS310FY、巨能7、南苜501、盐宝、WL343和阿迪娜诱变材料与未诱变材料的SPAD值差异显著（P<0.05），而WL354未诱变材料的SPAD值显著高于诱变材料（P<0.05）。

2.10 各指标隶属函数综合分析

将各材料苗期耐旱性生长指标进行隶属函数分析（表2），平均隶属函数值越大，说明综合表现越好。结果显示，经PEG-6000干旱胁迫后，甘农3号、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜这8份材料的太空诱变材料生长指标隶属函数平均值较其未诱变材料高，说明从生长指标来看，这8份材料经太空诱变后耐旱性能得到提升。

3 讨论

水分胁迫是限制植物生长发育与形态指标的重要因子^［15］。植物受到干旱胁迫时，常表现出叶片失水，甚至干枯死亡等现象，轻度的干旱胁迫会导致叶片萎蔫，严重时会使植物停止生长，甚至发生萎蔫干枯，且抗旱性不同的材料对干旱的响应不同^［13］。本研究对14份太空诱变和14份未诱变紫花苜蓿材料用PEG-6000溶液进行胁迫，各试验材料植株叶片在不同浓度和时间呈现不同程度萎蔫，大部分材料在30%的PEG-6000溶液胁迫2 h感受到干旱胁迫，而皇冠和WL343的未诱变和诱变材料均在20%的PEG-6000溶液胁迫2 h感应干旱胁迫。陈奋奇等^［16］利用PEG模拟干旱胁迫环境，对23份紫花苜蓿种质材料苗期抗旱性进行评价，也得出不同的紫花苜蓿种质材料响应干旱胁迫程度不同，但不同的是其PEG-6000溶液胁迫浓度为15%，这可能与研究材料、材料来源及处理方法不同有关。本研究还发现，干旱胁迫处理不同程度地降低了各材料的叶面积、叶周长、叶长和叶宽等叶片形态特征指标。相关指标下降是由于干旱引起的叶片萎蔫所致，而不同材料的形态相关特征指标不一致也正是说明了不同的紫花苜蓿种质材料响应干旱胁迫的程度不同。韩瑞宏等^［17］研究表明，干旱胁迫下大部分苜蓿种质幼苗的苗长、根长、苗鲜重、苗干重等均受到不同程度的抑制，而对部分种质材料影响相对较小，本研究干旱胁迫降低了部分材料株高、基茎粗、根长和单株鲜重的结果与之相一致。此外，研究中有6份材料的根长和2份材料的单株鲜重经干旱胁迫后反而升高，这与张翠梅等^［18］的研究结果一致。分析可能是植物可通过增加根系长度等来抵抗干旱胁迫，说明不同苜蓿种质抵抗干旱胁迫的方式也不同。研究表明，植物的光合作用依赖于叶绿素对光能的吸收，干旱胁迫可使叶绿体超微结构被破坏，导致叶绿素合成减少，所以，植物叶绿素含量的变化一定程度上能够反映植物对干旱胁迫的抵抗力^［19］。陈力等^［20］研究表明，干旱胁迫显著降低了不同品种紫花苜蓿叶绿素含量，本研究大部分材料经干旱胁迫后，相对叶绿素含量升高与之不一致。对比分析发现，可能与干旱处理的程度有关，本研究利用PEG-6000溶液模拟干旱胁迫试验时间较短，植株幼苗短时间感应干旱胁迫，而上述研究采用自然干旱法，处理7 d后叶绿素含量显著降低。短时间的干旱胁迫下叶绿素的升高可能是其快速响应干旱胁迫的表现，而长时间的干旱可能使叶绿素体超微结构被破坏，导致叶绿素含量下降。另有研究表明，适度的干旱条件可提高沙地云杉（Picea mongolica）的叶绿素含量^［21］，这也正好说明了上述观点的可能性。

与农作物相比，草类植物的空间诱变育种相对滞后，但随着新型搭载工具的出现和农业科学的发展，草类植物太空诱变育种日益受到重视^［22-23］。徐云远等^［24］研究了空间诱变对红豆草（Onobrychis viciaefolia）、苜蓿和沙打旺（Astragaius huangheensisi）3种牧草的影响。尹琼等^［25］对航天诱变黔草1号高羊茅（Festuca arundinacea Qiancao No.1）形态多样性进行研究。本试验利用PEG-6000模拟干旱胁迫环境，对2020年载人航天飞船搭载的14份紫花苜蓿材料苗期生长指标进行了研究。结果表明，与未诱变材料相比，部分紫花苜蓿经太空诱变后，可缓解干旱胁迫导致相关生长指标的下降，并促进了相对叶绿素含量的升高，而部分材料结果相反。如巨能7诱变材料，干旱胁迫下其根长、单株鲜重、叶面积、叶周长和相对叶绿素含量等显著高于未诱变材料，太空诱变提高了植株抵抗干旱胁迫的能力。匡倩等^［26］研究表明，空间诱变提高了部分材料的叶长、叶面积、叶重、分枝数等指标，本研究结果与之一致。但本研究中，干旱胁迫后的诱变材料中，甘农4号叶面积、叶周长和叶长，甘农6号单株鲜重，WL354叶宽和相对叶绿素含量均显著低于其未诱变材料，说明太空诱变具有随机性，可以出现有利的变异，也可出现不利的变异。胡洁等^［27］对紫羊茅（Festuca rubra）空间诱变SP₁代单株材料田间农艺性状的变异进行分析，发现空间搭载后紫羊茅出苗率明显高于对照组，但植株变矮且叶长明显低于对照。隶属函数法是对植物抗性进行综合评价的有效方法之一。侯瑞虹等^［28］使用隶属函数法筛选出耐旱性更强的紫花苜蓿种质资源。本研究利用隶属函数法综合分析得出，干旱胁迫下，甘农3号、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜这8份材料的太空诱变材料生长指标综合评价较其未诱变材料高，说明从生长指标来看，这8份材料经太空诱变后耐旱性能得到提升。

4 结论

在本试验条件下，经PEG-6000干旱胁迫后，甘农3号、DS310FY、巨能7、南苜501、皇冠、盐宝、WL343和阿迪娜这8份材料的太空诱变材料生长指标综合评价较其未诱变材料高，说明从生长指标来看，这8份材料经太空诱变后耐旱性能得到提升。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2023AAC03439)

宁夏科技基础条件建设专项“宁夏农业种质资源库基础条件建设(2022DPC05001┫”和宁夏生态农业产业专家服务基地项目资助)