蒺藜苜蓿MtBMI1基因克隆及抗旱性分析

Cloning of the MtBMI1 gene from Medicago truncatula and its role in drought tolerance

摘要

干旱不利于植物的正常生长、发育及繁殖，是造成农作物及饲草产量降低的重要因素之一。BMI1蛋白作为PcG蛋白复合体中唯一介导组蛋白泛素化的成员，在参与植物对外界非生物胁迫响应的表观遗传调控中发挥重要的作用。以蒺藜苜蓿为材料，克隆得到PcG家族成员MtBMI1，该基因全长5386 bp，编码429个氨基酸，具有zf-C3HC4和RAWUL两个保守的功能结构域。系统进化树分析表明该基因与菜豆PvBMI1-1和大豆GmBMI1-1亲缘关系更接近。烟草表皮亚细胞定位结果表明该基因编码的蛋白定位在细胞核上。GUS化学染色结果表明在成熟的拟南芥花序及柱头、花茎和果柄中具有较强的MtBMI1启动子表达活性。将MtBMI1在拟南芥中过表达进行功能分析，结果表明转基因拟南芥H2AK119ub组蛋白含量相比野生型显著（P<0.05）升高，同时干旱处理后的转基因株系相比野生型产生明显的失水表型，且根长、根鲜重和地上鲜重显著（P<0.05）低于野生型，丙二醛含量显著（P<0.05）高于野生型。以上结果表明MtBMI1在蒺藜苜蓿干旱胁迫响应中发挥负调控作用，该研究可为进一步揭示蒺藜苜蓿响应干旱胁迫的表观遗传调控机制提供理论依据。

Abstract

Drought significantly impedes the normal growth， development， and reproduction of plants， and has emerged as a pivotal factor contributing to the decline in crop and forage yields. The BMI1 protein， a key component of the Polycomb Group （PcG） protein complex that mediates histone ubiquitination， is crucial for the epigenetic regulation of plant responses to abiotic stresses. This study reports the cloning of MtBMI1， which encodes a member of the PcG family， from Medicago truncatula. Our analyses showed that the MtBMI1 gene sequence spans 5386 base pairs and encodes a protein comprising 429 amino acids， featuring two functional domains： zf-C3HC4 and RAWUL. Phylogenetic analyses revealed close relationships between MtBMI1 and PvBMI1-1 of Phaseolus vulgaris and GmBMI1-1 of Glycine max. A subcellular localization analysis in tobacco epidermal cells confirmed the nuclear localization of the MtBMI1 protein. Moreover， GUS staining analyses revealed robust activity of the MtBMI1 promoter in the mature inflorescence， stigma， flower， stem， and pedicel of Arabidopsis. Functional analysis via overexpression in Arabidopsis demonstrated that the histone H2AK119ub content was significantly higher （P<0.05） in transgenic lines than in wild type. Under drought stress， transgenic lines exhibited pronounced water-loss phenotypes， with reduced root length， root fresh weight， and aboveground fresh weight （P<0.05）， and elevated levels of malondialdehyde （P<0.05）， compared with the wild type. These findings suggest that MtBMI1 exerts a negative regulatory effect on M. truncatula’s response to drought stress. The results of this study offer insights into the epigenetic mechanisms underlying drought stress tolerance in this model legume species.

Graphical abstract

关键词

蒺藜苜蓿 / MtBMI1 / 基因克隆 / 抗旱性

Key words

Medicago truncatula / MtBMI1 / gene cloning / drought resistance

多梳蛋白（polycomb group，PcG）介导的基因沉默是真核生物发育过程中一个重要的调控机制。PcG通过形成包括多梳蛋白抑制复合物1（polycomb repressive complexes 1，PRC1）和多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complexes 2，PRC2）在内的复合体，使目标染色质失活或保持沉默状态^［1］。植物中的PRC2成分相对保守，该组分的相关成员在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已被广泛识别，但最初PRC1的存在受到了学者的质疑，因为植物基因组并不编码清晰的PRC1组分，且尚未检测到组蛋白H2A单泛素化（H2Aub1）^［2-3］。直到2010年才有研究人员明确将BMI1A和BMI1B鉴定为PRC1的组分，它们与RING1B形成一个活性异源二聚体泛素连接酶，催化组蛋白H2A赖氨酸第119位泛素化（H2AK119ub1），与PRC2介导的组蛋白H3赖氨酸第27位三甲基化（H3K27me3）一起，在维持细胞身份中发挥关键作用^［4-5］。2011年拟南芥的第3个BMI1（AtBMI1C）被鉴定出，其与AtBMI1A和AtBMI1B在进化上保守，是一种新颖的、普遍表达的核PcG蛋白^［1］。研究表明BMI1是胚胎后植物生长过程中抑制胚胎性状所必需的，例如种子成熟基因的抑制需要BMI1基因介导的H2A泛素化^［6］；同时BMI1积极参与干细胞调控因子的沉默以及体细胞分化状态的维持，例如AtBMI1A/AtBMI1B介导H2Aub1，并且一些干细胞调节因子被发现在Atbmi1a-1/b子叶中异位表达^［5］。

相关研究表明拟南芥共有3个BMI1蛋白，即AtBMI1A、AtBMI1B和AtBMI1C^［5］，它们与AtRING1的两个蛋白AtRING1A和AtRING1B组成5个环指蛋白共同参与PRC1的表观遗传修饰功能^［7］。先前的研究发现蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）有且只有一个BMI1蛋白（MtBMI1）^［8］，MtBMI1蛋白是否兼具拟南芥中3个BMI1蛋白的功能以催化H2AK119单泛素化，该基因对逆境胁迫是否具有调控作用尚不清楚。

因此，为了解MtBMI1在蒺藜苜蓿中的功能与作用，本研究对该基因的基因特征、进化、蛋白序列及逆境胁迫下的表型、生理和基因表达谱进行了分析，同时克隆了MtBMI1基因编码序列（coding sequence，CDS）和启动子序列，进行亚细胞定位和拟南芥组织GUS化学染色分析，最后将蒺藜苜蓿MtBMI1基因转入拟南芥开展功能分析，进一步明确MtBMI1基因在干旱胁迫下的调控作用，为揭示PcG蛋白复合体参与蒺藜苜蓿逆境表观遗传调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究于2022年1月在中国农业科学院生物技术研究所开展，试验所需的材料为蒺藜苜蓿（Jemalong A17）、本式烟草（Nicotiana benthamiana）和拟南芥（Col-0）种子，植物表达载体pCAMBIA3301和亚细胞定位载体pART-CAM-EGFP由陕西博瑞德生物科技有限公司提供，大肠杆菌DH5α感受态细胞购于南京诺唯赞（Vazyme）生物科技股份有限公司，根癌农杆菌感受态GV3101购于上海唯地生物技术有限公司。

1.2 MtBMI1生物信息学分析

根据蒺藜苜蓿已有基因组数据及结构注释信息（v4.0），使用在线工具GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）对MtBMI1基因结构（内含子-外显子）进行可视化，同时通过在线网站ProtParam ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）对该基因对应的蛋白序列进行理化性质分析。利用A Plasmid Editor v2.0.61软件对基因的CDS序列及对应的蛋白序列进行可视化。通过在线网站Batch web CD search tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）预测分析获得基因的保守结构域，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）获得蛋白质二级结构，三级结构则通过SWISS-MODEL在线分析工具（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）完成。借助在线软件CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行多序列比对，利用Jalview软件对结果进行可视化展示。使用MEGA-X软件对蒺藜苜蓿和大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、拟南芥、水稻（Oryza sativa）的BMI1蛋白构建系统进化树^［9］。

1.3 MtBMI1的表达模式分析

对生长6、14、21、40、49和63 d的蒺藜苜蓿叶片及结实初期的叶、茎、花和果实取样，检测蒺藜苜蓿MtBMI1在不同发育时期和不同组织中的表达模式；同时对6周苗龄的蒺藜苜蓿叶片进行260、300、360 mmol·L^-1浓度甘露醇处理0、3、12和24 h，检测蒺藜苜蓿MtBMI1在不同程度干旱胁迫处理下的表达模式，每个试验设置3次生物学重复。通过Primer Premier v6.0软件进行qRT-PCR引物的设计，并使用蒺藜苜蓿Actin基因作为内参（表1）。基因的相对表达水平则依据2^-ΔΔCt方法进行计算^［10］，结果通过GraphPad Prism v8.0.2软件进行可视化。

1.4 MtBMI1的亚细胞定位

使用Primer Premier 5.0设计克隆MtBMI1基因CDS的引物（表1），以蒺藜苜蓿cDNA为模板进行目的基因的扩增，按照同源重组的方法将MtBMI1基因与pART-CAM-EGFP载体连接，使用热激法转化GV3101农杆菌感受态。通过测序分析验证后，加入1 mL渗透液（MgCl₂·6H₂O： 2.033 g·L^-1+MES： 2.32 g·L^-1）重悬至OD₆₀₀为0.4。选择室温生长4~6周的本氏烟草，选取从上往下第3~6片叶片背部进行农杆菌侵染。通常注射后2~3 d瞬时转化基因的表达量最高。将标记区域的叶片表皮撕下制片，并于共聚焦显微镜（徕卡TCS SP8 SR，德国）下进行观察。

1.5 拟南芥组织GUS化学染色

使用Primer Premier 5.0设计克隆MtBMI1基因启动子全长序列的引物（表1），以蒺藜苜蓿DNA为模板进行目的基因启动子的扩增，按照同源重组的方法将MtBMI1启动子与pCAMBIA3301载体连接，并转化GV3101农杆菌感受态。通过花序浸染法将MtBMI1启动子转化拟南芥，使未露白的花苞完全浸泡在制备好的拟南芥侵染液（重悬液）45~60 s，然后套袋24 h暗培养，一周侵染一次，共侵染3次（3周）。选择阳性拟南芥成熟的花序、花茎、果荚以及3周龄的整株幼苗进行GUS染色，将各取样组织部位置于提前配置好的GUS染色工作液中，避光条件下37 ℃孵育24 h后再用无水乙醇将各组织部位的叶绿素脱去，此时具有GUS活性的部位呈现出蓝色，进行观察拍照。

1.6 MtBMI1转化拟南芥及阳性苗的鉴定

将克隆得到的MtBMI1基因经过限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后使用T4 DNA连接酶与pCAMBIA3301载体连接，转化GV3101农杆菌感受态。同样使用蘸花法侵染拟南芥，侵染后收种为T₀代种子，当T₀代种子发芽长至三叶期开始使用1/1500 10%的basta溶液进行喷洒筛选后收种，记为T₁代种子；继续按照上述方式筛选T₂代种子。待T₂代株系生长到30 d左右进行DNA水平上的鉴定，分别使用MtBMI1 F/MtBMI1 R和Bar F/Bar R这两对引物进行PCR检测（表1），检测后出现目的条带的拟南芥认为是阳性植株。进一步使用qRT-PCR技术对这些阳性株系的MtBMI1基因表达水平进行检测。

1.7 转基因拟南芥表型分析、抗旱性评价及H2AK119ub组蛋白含量分析

以300 mmol·L^-1甘露醇处理来模拟干旱胁迫，处理0、24、48 h后对叶片取样（3个生物学重复），用于丙二醛和脯氨酸含量的测定。在处理72 h后，拍照观察表型差异。另外选表达量高的3个转基因株系和野生型分别在正常和含有150 mmol·L^-1甘露醇固体1/2 MS培养基垂直培养10 d后开展抗旱性评价试验。以300 mmol·L^-1甘露醇处理0 h的样品作为对照，处理24和48 h后分别取样，样品重量不低于0.05 g，各时间点采集3个生物学重复，用于测定H2AK119ub组蛋白含量。将取好的样品按照10%的比例（即1 g组织加9 mL的磷酸盐缓冲液，pH 7.4）进行溶解，离心20 min左右（2000~3000 r·min^-1）仔细收集上清液^［11］。分装后一份待检测，其余冷冻备用。试验对H2AK119ub组蛋白含量采用酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）进行反应并在芬兰（Labsystems Multiskan MS）325型酶标仪上进行测定。

1.8 数据处理

所有数据均在Excel 2013 中进行整理，采用SPSS 20.0 对各指标进行单因素方差分析，处理间的差异选取P<0.05显著差异进行Duncan多重比较，并使用Excel 2013和GraphPad Prism version 8.0.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 MtBMI1生物信息学分析

2.1.1 MtBMI1基因特征

蒺藜苜蓿MtBMI1基因全长5386 bp，具有7个外显子和6个内含子（图1）。通过ExPASy在线工具获取了MtBMI1基本理化性质，蛋白分子量为47.37 kDa，等电点为9.24，在蒺藜苜蓿数据库中的Gene ID为：Medtr7g096210。

2.1.2 MtBMI1蛋白序列分析

MtBMI1的CDS全长为1290 bp，编码429个氨基酸（图2）。其中丝氨酸含量最高，为11.19%，其次为赖氨酸，为10.26%，色氨酸含量最少，仅为0.7%。该基因的蛋白序列具有zf-C3HC4和RAWUL两个保守结构域（图3A），图3B和图3C为蒺藜苜蓿MtBMI1蛋白质二级结构和三级结构预测，其中MtBMI1的α螺旋为31.24%，延伸链为7.93%，β 折叠为2.1%，无规则卷曲为58.74%。

将大豆（GmBMI1-1：XP_003520583）、菜豆（PvBMI1-1：XP_007162503）、拟南芥（AtBMI1A：NP_001323803）、水稻（OsBMI1a：XP_015633275）和蒺藜苜蓿（MtBMI1：XP_013449836）5种植物的BMI1蛋白进行多序列比对，如图4所示，不同物种间（包括单子叶和双子叶植物）BMI1的结构域相似度较高，且zf-C3HC4和RAWUL结构域保守性较好，其中zf-C3HC4横跨越约41个氨基酸，RAWUL横跨越约42个氨基酸。同时通过多序列比对，发现蒺藜苜蓿MtBMI1与菜豆的PvBMI1-1序列一致性最高，为73.96%，其次是大豆（71.05%）和拟南芥（43.65%），与水稻的OsBMI1a的序列一致性最低，只有30.90%。

2.1.3 MtBMI1进化分析

为进一步预测蒺藜苜蓿MtBMI1的功能，使用MEGAX软件对已有报道的大豆、菜豆、蒺藜苜蓿、拟南芥、水稻5种植物的BMI1基因与蒺藜苜蓿MtBMI1基因进行系统进化树构建，如图5所示。MtBMI1基因与大豆的GmBMI1-1、GmBMI1-2、GmBMI1-3、GmBMI1-4和菜豆的PvBMI1-1、PvBMI1-2亲缘关系较近，表明MtBMI1与这6个基因相似性较高，功能相似。相反MtBMI1基因与拟南芥AtBMI1C、菜豆PvBMI1-4以及大豆的GmBMI1-7和GmBMI1-8亲缘关系较远。

2.2 MtBMI1在不同组织，不同发育时期的表达谱分析

为明确蒺藜苜蓿MtBMI1在不同发育时期以及不同组织中的表达模式，通过qRT-PCR检测该基因在6个发育时期（6、14、21、40、49和63 d）叶片及结实初期4个组织（叶、茎、花和果实）中的表达量，结果表明MtBMI1在发育初期6 d时表达量最低，然后随着生长时间的增加MtBMI1表达量呈先升高再降低再升高的趋势，在生长到40 d时MtBMI1表达量急剧降低，到63 d时MtBMI1表达量达到最高。在同时期4个组织中MtBMI1表达量的结果显示，叶片中的MtBMI1表达量最高，其次是果实和花，茎中MtBMI1表达量最低（图6）。

2.3 MtBMI1在不同程度干旱胁迫下的表达谱分析

为了分析蒺藜苜蓿MtBMI1在不同干旱胁迫条件下的表达模式，使用甘露醇模拟干旱胁迫，通过qRT-PCR试验测定该基因在不同浓度（260、300、360 mmol·L^-1）甘露醇胁迫下6周龄蒺藜苜蓿叶片的表达水平。结果表明对于不同浓度的甘露醇处理，在300 mmol·L^-1处理12 h时MtBMI1表达量达到最高，360 mmol·L^-1处理下的整体表达量均低于260和300 mmol·L^-1处理。在260 mmol·L^-1处理下MtBMI1表达量随处理时间的增加而下降，而300和360 mmol·L^-1处理下MtBMI1表达量随处理时间的增加呈先增后降的变化趋势（图7）。

2.4 MtBMI1基因的亚细胞定位

为了确定蒺藜苜蓿MtBMI1蛋白所在的亚细胞位置，通过同源重组的方法成功构建了pART-CAM-EGFP-MtBMI1瞬时表达载体，使用热激法将载体转化GV3101农杆菌。通过注射农杆菌液来侵染烟草表皮细胞，在注射后2~3 d MtBMI1表达量最高时，将侵染区域撕下表皮制片放于激光共聚焦显微镜（徕卡TCS SP8 SR，德国）下进行观察，如图8所示，MtBMI1绿色荧光蛋白在细胞核上有荧光信号，且与叶绿体自发荧光信号重叠，证实MtBMI1蛋白定位在细胞核。

2.5 MtBMI1：GUS转基因拟南芥组织GUS化学染色

为了能直观地看到MtBMI1在蒺藜苜蓿组织部位的表达情况，将MtBMI1的启动子替换pCAMBIA3301载体中GUS的启动子序列，进而转到拟南芥中进行GUS化学染色。通过MtBMI1基因所在位置向前推2000 bp碱基找到该基因的启动子序列，通过在序列两头设计扩增该启动子全长的引物，成功的以蒺藜苜蓿DNA为模板克隆出了MtBMI1启动子序列（图9）。

将克隆得到的启动子序列利用同源重组的方法成功构建了pCAMBIA3301-MtBMI1启动子表达载体。将构建好的pCAMBIA3301-MtBMI1启动子表达载体通过热激法转化农杆菌，通过花序浸染法转化拟南芥。分别取3周的阳性幼苗和成熟的拟南芥花序、花茎及长角果进行GUS染色。如图10所示，GUS活性在3周拟南芥莲座叶中较弱，根尖处有表达，对于成熟的拟南芥，花序及柱头、花茎和果柄中具有较强的MtBMI1启动子表达活性，而在果荚中未检测到GUS活性，说明MtBMI1启动子可能在成熟的种子中不表达。

2.6 MtBMI1转基因拟南芥功能分析

2.6.1 pCAMBIA3301-MtBMI1重组载体转化拟南芥

通过先前的基因家族鉴定，在蒺藜苜蓿数据库中获得了MtBMI1基因的CDS序列，为了克隆该全长序列，在CDS起始和终止密码子处设计扩增MtBMI1基因全长的引物，成功地在蒺藜苜蓿cDNA中克隆出MtBMI1基因（图11）。测序结果表明该基因共含有1290个碱基，能够编码429个氨基酸，与从数据库获得的信息是一致的。将克隆得到的MtBMI1基因通过酶切连接的方法与pCAMBIA3301载体连接，成功构建了pCAMBIA3301-MtBMI1表达载体。通过花序侵染法转入拟南芥中，使用1/1500浓度10%的basta初步筛选后，共获得了23株拟南芥抗性株系，将这23株抗性株系分别取样进行目的基因和抗性标记（Bar）的PCR检测，共有11个株系含有MtBMI1 F/MtBMI1 R和Bar F/Bar R这两对引物的PCR扩增产物。因此，这11株拟南芥被鉴定为转基因阳性植株。可通过继续筛选获得T₃代转MtBMI1基因纯合拟南芥。

进一步通过qRT-PCR检测每个阳性株系中的MtBMI1基因的表达水平。如图12所示，与野生型拟南芥相比，这11株转基因株系均检测到MtBMI1基因的表达，其中株系OE-7的MtBMI1的表达量最低，OE-6、OE-9、OE-18的MtBMI1的表达量较高，分别是OE-7的7.28、5.68、6.10倍。

2.6.2 MtBMI1转基因拟南芥表型分析及抗旱性评价

通过观察，并未发现转基因株系和野生型在苗期（14 d）及抽薹期（40 d）的表型存在明显差异（图13）。

基于之前对MtBMI1在不同胁迫下的表达模式研究发现，与冷胁迫相比，MtBMI1在不同浓度甘露醇处理下响应更强烈，且在300 mmol·L^-1处理下表达量最高。为了进一步开展对MtBMI1基因功能分析及对转基因拟南芥进行抗旱性评价，使用300 mmol·L^-1的甘露醇处理模拟干旱胁迫，选择表达量较高的3个转基因拟南芥阳性株系OE-6、OE-9、OE-18进行表型观察和后续试验。如图14所示，当甘露醇处理72 h后转基因株系出现明显的失水表型，表现为茎秆下垂且叶片萎蔫，相比野生型受到的伤害更严重。

进一步分析了甘露醇处理下转基因与野生型株系丙二醛和脯氨酸含量的变化，如图15A所示，转基因与野生型材料随处理时间增加丙二醛含量均呈升高趋势，在相同处理时间下前者的丙二醛含量显著高于后者。处理24 h时，OE-6、OE-9和OE-18丙二醛含量相比WT分别增加了30.52%、25.13%和44.13%（P<0.05）；处理48 h时，OE-6、OE-9和OE-18丙二醛含量相比WT分别增加了30.02%、37.52%和53.03%（P<0.05）。如图15B所示，转基因与野生型材料随处理时间的增加脯氨酸含量均升高，在相同处理时间下前者的脯氨酸含量明显高于后者。与处理0 h相比，处理24 h时的WT、OE-6、OE-9和OE-18脯氨酸含量分别增加了14.93%、286.50%、255.01%和333.57%（P<0.05）；处理48 h分别增加了208.38%、420.87%、435.63%和443.99%（P<0.05）。

同时在1/2 MS培养基上开展MtBMI1转基因拟南芥抗旱性评价试验。将野生型和转基因株系分别置于正常及含有150 mmol·L^-1甘露醇的1/2 MS培养基上垂直培养10 d，并分别统计4个基因型拟南芥的根长及根鲜重。在正常培养基10 d，野生型和转基因株系长势良好（图16A），当在含有150 mmol·L^-1甘露醇的培养基上10 d，野生型和转基因株系生长明显受到抑制（图16B）。进一步计算根长、根鲜重、地上鲜重和根冠比，结果表明正常培养基下生长的野生型与转基因株系相比，根长、根鲜重、地上鲜重和根冠比均无显著差异（图16C~F），而在含有150 mmol·L^-1甘露醇的培养基上生长10 d后的转基因株系根长、根鲜重和地上鲜重均显著低于野生型（P<0.05），根冠比差异不显著。

2.6.3 MtBMI1转基因拟南芥H2AK119ub组蛋白含量分析

此外，MtBMI1作为一种泛素连接酶，通过测定该基因介导的H2AK119ub组蛋白含量，进一步验证MtBMI1转基因对拟南芥H2AK119ub组蛋白含量的影响。如图17所示，正常条件下，MtBMI1转基因拟南芥的H2AK119ub组蛋白含量显著高于野生型，OE-6、OE-9和OE-18相比WT分别增加了20.80%、28.34%和15.34%（P<0.05）。甘露醇处理后各株型的H2AK119ub组蛋白含量均有所增加，且转基因植株仍显著高于野生型。处理24 h时，OE-6、OE-9和OE-18相比WT分别增加了20.70%、28.76%和33.00%（P<0.05）；处理48 h时，OE-6、OE-9和OE-18相比WT分别增加了16.41%、18.87%和20.15%（P<0.05）。

2.6.4 MtBMI1转基因拟南芥中与表观修饰相关基因的表达变化

先前的研究表明各种表观遗传修饰之间具有密切的联系，因此在转基因拟南芥株系中检测主要与表观遗传修饰相关基因的表达水平可在分子水平上阐释MtBMI1基因的功能。图18为转基因拟南芥中与表观遗传修饰相关的12个基因表达水平，其中与DNA甲基化修饰相关的基因有3个：AtCMT1、AtDRM2、AtMET1；与组蛋白甲基化修饰相关的基因有3个：AtATX1、AtCLF、AtSDG8；与组蛋白泛素化修饰相关的基因有4个：AtHUB1、AtHUB2、AtRING1A、AtRING1B；与组蛋白乙酰化修饰相关的基因有2个：AtHAC1、AtHAG1。结果表明，与表观修饰相关的这12个基因在正常情况下（0 h）转基因株系表达量均比野生型高，也有部分基因在转基因株系中的表达量与野生型持平，差异不显著，例如：AtDRM2、AtATX1、AtHAC1、AtHAG1等，而这些基因普遍存在于OE-9株系中，可能与该株系在3株阳性株系中MtBMI1基因表达量最低有关。当甘露醇处理12 h后，所有株系的这些基因均显著升高（P<0.05），其中转基因株系各基因表达水平升高幅度普遍大于野生型，且在转基因株系中OE-18的各基因水平升高幅度最大。另外处理后转基因株系的各基因水平也显著高于处理后的野生型，最高是其处理后野生型的54.98倍（AtHUB2）（P<0.05）。

3 讨论

3.1 MtBMI1的表达模式

BMI1蛋白是植物介导H2AK119ub1的PRC1组分，该表观遗传标记与PRC2介导的H3K27me3在维持细胞特性中起着关键作用^［12-13］。在植物中只有少数物种鉴定出了该基因，研究也正处于起步阶段。在植物中研究较为清楚的就是拟南芥，拟南芥中有3个AtBMI1，其中拟南芥中的AtBMI1A和AtBMI1B也被称为DRIP1和DRIP1^［5］。

不同物种中存在的BMI1基因数目是不同的，除拟南芥外已报道小麦（Triticum aestivum）中有6个TaBMI1^［14］，大豆中有8个GmBMI1基因，菜豆中有4个PvBMI1基因，水稻中有4个OsBMI1基因，玉米（Zea mays）中有7个ZmBMI1等^［15］。但是在蒺藜苜蓿中只鉴定到一个MtBMI1基因^［8］，推测该基因很有可能是一个多效性基因，具有其他植物中的多个BMI1基因的功能。目前关于BMI1基因功能的研究仅在拟南芥中有报道，其中AtBMI1A和AtBMI1B在拟南芥发育过程中普遍表达^［16］，且AtBMI1A组织特异性表达模式结果表明在3周龄AtBMI1Apro：GUS转基因植株中GUS在莲座叶中表达较弱，根部根尖和伸长区活性明显，以及GUS在已开放花的花药中表达，授粉后的柱头上也有启动子活性，但是AtBMI1A在成熟的干种子中几乎没有表达^［17］。而AtBMI1C仅在拟南芥根、胚乳和雄蕊中表达，且AtBMI1C表现出胚乳优先表达^［18］。本研究GUS染色结果与AtBMI1A一致，但是本试验中对蒺藜苜蓿MtBMI1基因在不同组织表达谱分析与GUS染色结果存在部分差异，表达谱分析表明该基因在茎、叶、花、果实中均有表达，在叶中的相对表达量较高，在茎中的相对表达量较少，这主要是因为本研究GUS染色的叶片来自于3周龄的莲座叶，而表达谱分析用的叶片为花期成熟的叶片，另外GUS染色使用的是成熟的果荚，表达量分析用的是未成熟的果荚。此外，对不同发育时期的MtBMI1基因表达量分析表明在蒺藜苜蓿生长至40 d时该基因的表达量显著降低，此时蒺藜苜蓿的生长状态为营养阶段向生殖阶段转变的过渡阶段，MtBMI1基因表达量下降可能是因为调控蒺藜苜蓿生殖生长的基因抑制了该基因的表达，推测该基因在维持蒺藜苜蓿营养发育和抑制生殖发育中具有重要作用。拟南芥BMI1系统进化分析表明AtBMI1A的全长蛋白及RING结构域都与AtBMI1B高度相关，其在进化树上的分布较近而与AtBMI1C的距离略远，这表明AtBMI1C在拟南芥发育过程中可能具有不同的功能^［1］。本研究通过系统进化树构建发现蒺藜苜蓿MtBMI1与拟南芥AtBMI1A和AtBMI1B亲缘关系较近，而与AtBMI1C亲缘关系较远，表明MtBMI1与AtBMI1A和AtBMI1B在功能上更相近。Li等^［1］研究发现AtBMI1C是一种普遍表达的核蛋白，AtBMI1A和AtBMI1B也均定位在细胞核上^［19］，本试验亚细胞定位结果与之一致。

3.2 MtBMI1在干旱胁迫下的负调控作用

关于AtBMI1A和AtBMI1B在表观修饰中的作用很早就有学者开展研究，Bratzel等^［5］通过体外泛素化试验表明AtBMI1A和AtBMI1B能够特异性的单泛素化H2A，然而对第3种BMI1基因AtBMI1C知之甚少，Li等^［1］通过酵母双杂验证了AtBMI1C与AtBMI1A和AtBMI1B相互作用，均为拟南芥PRC1组分。本研究结果表明转基因拟南芥株系中的H2AK119ub组蛋白含量显著升高，该结果进一步证明了蒺藜苜蓿中的MtBMI1也具有组蛋白泛素化的作用。使用35S启动子来过表达AtBMI1A的转基因植物，所有转基因株系的生长与野生型植物相似，没有任何显著的表型变化^［17］，然而AtBMI1C过表达导致H2Aub1化增加和早花表型^［1］。本试验将蒺藜苜蓿MtBMI1在拟南芥中进行了过表达研究，通过对过表达株系和野生型的观察并未发现二者在表型上具有显著差异，这与拟南芥AtBMI1A过表达表型符合。结合MtBMI1在不同胁迫下表达量的研究结果，进一步使用300 mmol·L^-1的甘露醇处理模仿干旱胁迫，当处理72 h后转基因株系出现了明显的失水表现，相比野生型其茎秆下垂叶片萎蔫更严重，同时丙二醛含量进一步升高，根系生长明显减缓，说明MtBMI1基因的转入影响了植物的耐旱强度。研究发现atbmi1a/b在脱水处理下的离子渗漏率远小于野生型，干旱胁迫下野生型的存活率为37.5%，双突变体的存活率为65.4%，且双突变体在应对水分胁迫时的标准化含水量也高于野生型^［17］。进一步研究表明AtBMI1A和AtBMI1B通过介导DREB2A在水分胁迫下的泛素化，导致其蛋白被26S蛋白酶体水解，该转录因子对控制缺水诱导基因的表达具有重要作用，因此AtBMI1A/AtBMI1B突变能够增强胁迫响应基因的表达，赋予拟南芥对脱水胁迫的耐受性^［1］。综合本试验结果表明MtBMI1介导组蛋白泛素化在参与表观遗传调控的同时，也在蒺藜苜蓿干旱胁迫响应中发挥了新的负调控作用。在后续的研究中可以借助基因编辑的手段将苜蓿中的该基因敲除，从而获得优质抗旱苜蓿新品种。另外本研究结果也表明在蒺藜苜蓿中唯一的BMI1基因与拟南芥中的AtBMI1A和AtBMI1B功能更接近。

4 结论

本研究克隆了蒺藜苜蓿PcG家族中唯一的BMI1成员MtBMI1，该基因具有7个外显子和6个内含子，CDS全长1290 bp，编码429个氨基酸，蛋白亚细胞定位在细胞核上。在拟南芥花序、柱头、花茎和果柄中具有较强的MtBMI1启动子表达活性。MtBMI1在不同发育阶段的表达量呈波动式变化，在不同组织中叶片表达量最高，在300 mmol·L^-1甘露醇处理12 h表达量最高。转MtBMI1拟南芥在正常生长条件下与野生型表型无明显差异，而在干旱处理后转基因株系出现明显失水表型，且根长、根鲜重和地上鲜重均显著降低，丙二醛含量显著升高。综上，MtBMI1基因在蒺藜苜蓿干旱响应中具有负调控作用。

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基金资助

省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室自主课题(2024-ZZ-16)

青海省重大科技专项(2023-NK-A3)

青海大学青年科研基金(2023-QNY-6)