青贮玉米真菌性病害对青贮发酵微生物多样性的影响

Effects of fungal diseases of silage maize on microbial diversity of silage fermentation

摘要

为探究青贮玉米真菌性病害对青贮发酵微生物多样性的影响，以CK（未发生任何病害的青贮玉米）、YLG（发生链格孢叶斑病青贮玉米）、YM（发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病青贮玉米）、YL（发生瘤黑粉病青贮玉米）、YX（发生锈病青贮玉米）为研究对象，每个处理3个重复。青贮发酵40 d后，采用Illumina扩增子测序技术分析各样品微生物多样性。分析发现各青贮玉米样品微生物结构由6门、50目、164属真菌和11门、43目、123属细菌组成。真菌群落中子囊菌门和担子菌门是各样品优势菌门，在各样本中的总丰度达90%以上；镰刀菌属和念珠菌属丰度在发生病害组高于未发生病害组，青霉菌属和曲霉菌属丰度在发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病和锈病组高于未发生病害组，发生病害的青贮玉米中威克汉姆酵母属丰度均低于健康组。细菌群落中厚壁菌门和变形菌门是各样品优势菌门，在各样本中的总丰度达99%以上；未发生病害组中肠球菌属、魏斯氏菌属丰度均高于发生病害组；链球菌属仅出现在未发生病害组中，相对丰度为0.003%。本研究明确了不同病害玉米青贮样本中微生物群落结构及各优势菌属，并发现真菌性病害会导致致病菌丰度增加，使得肠球菌属、魏斯氏菌属、链球菌属丰度降低，破坏青贮发酵环境，影响发酵过程正常进行，从而可能导致青贮饲料品质下降，为后续青贮玉米品质研究提供了理论依据。

Abstract

This research explored the effects of fungal diseases of silage maize on microbial diversity and community structure of maize silage during fermentation. Fermentation of maize silage without any disease （CK） was compared with that of silage maize infected by Alternaria leaf spot disease （YLG）， Bipolaris sorokiniana leaf spot disease （YM）， Ustilago maydis silage maize （YL） and common rust （YX）， with three replicates per treatment. After 40 days of silage fermentation， Illumina amplicon sequencing technology was used to analyze the fungal and bacterial diversity of microbial communities in each sample. The analysis revealed that the microbial structure of silage maize samples was composed of 6 phyla， 50 orders and 164 genera of fungi and 11 phyla， 43 orders and 123 genera of bacteria. The fungal taxa Ascomycota and Basidiomycota were the dominant phyla in each sample， with a total abundance of more than 90% in each sample. The abundance of the fungal genera Fusarium and Candida in silage maize with disease was higher than that in the CK treatment， and the abundance of Penicillium and Aspergillus in the YM and YX was higher than that in the CK treatment， while the abundance of Wickerhamomyces in silage maize with disease was lower than in the CK treatment. Firmicutes and Proteobacteria were the dominant bacterial phyla in each sample， with a total abundance of more than 99% in each case. The abundance of Enterococcus and Weissella was higher in the CK treatment than in the treatments with disease； and Streptococcus was only present in the CK treatment， with a relative abundance of 0.003%. In summary， this study has clarified the microbial community structure during maize silage fermentation in disease-free crop substrate and in crops affected by four different fungal diseases and identified the dominant bacterial genera present during fermentation in each case. Our study showed that the presence of fungal diseases resulted in an increase in the abundance of disease-causing pathogens， which decreased the abundance of Enterococcus， Weissella and Streptococcus. These changes would potentially have a negative impact on the silage fermentation environment， and affect the normal progress of the fermentation process， possibly leading to a decline in silage quality. Our results also provide information for the subsequent study of quality in maize silage.

Graphical abstract

关键词

青贮玉米 / 病原真菌 / 微生物多样性 / Illumina测序

Key words

silage corn / pathogenic fungi / microbial diversity / Illumina sequencing

随着全球畜牧业的发展，玉米（Zea mays）已成为重要的饲料、粮食和经济兼用性作物；同时也是中国的第一大粮食作物。青贮玉米是利用高水分玉米全株或部分植株，在玉米进入成熟期前进行收割、切割、压实和封存的一种优质饲草^［1］，主要用于解决牛羊等反刍动物养殖过程中优质粗饲料短缺的问题^［2］。青贮玉米富含粗蛋白质、粗脂肪和糖类，营养丰富，但是也含有难以消化的粗纤维^［3］。

根据中国当前社会现状和农业产业结构，动物畜产品的需求量在农产品社会需求中的占比大大提高，这一趋势加快了草食家畜的发展，尤其是奶牛业等畜牧业迅速发展。而在畜牧业生产所用的饲料中，青贮玉米可以提供的能量为25%左右，是当前草食畜牧业不可或缺的饲料资源^［4］。青海省作为我国5大牧区之一，草地资源丰富，工业污染较少，畜牧产业较发达，形成区域特色农业发展格局^［5］。但又因为其地处青藏高原，平均海拔较高，气候寒冷，热量条件较差，导致青海省生态体系脆弱，冬季草场供应不足，牲畜面临夏肥冬瘦问题^［6］。因此，青海省大力发展青贮玉米产业，以减轻草场畜牧压力和推动畜牧产业可持续发展。前期研究发现，青海省东部青贮玉米农业区病害发生较严重，影响青贮玉米产业发展^［7］。目前发现引起青海东部青贮玉米农业区玉米病害的病原菌有链格孢属（Alternaria）^［8］、镰刀菌属（Fusarium）^［9］和亚隔孢壳属（Didymella）^［10］真菌，多种蠕形菌^［11］、玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）和高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）等。

青贮是一个非常复杂的生化物质转化和微生物活动过程，青贮过程中饲草的营养成分和微生物菌群的变化都会对青贮饲料的发酵品质产生影响^［12］。青贮玉米发酵完成后进入饲喂阶段，随着开窖、取料和饲喂的进行，青贮饲料与氧气产生接触，易使饲料发生二次发酵，发生有氧腐败^［13］，有氧腐败是青贮饲料营养物质损失的重要原因^［14］。不同种类的微生物对青贮饲料品质的影响也不相同^［15］，其中乳酸菌在青贮发酵过程中产生大量的乳酸，可以防止营养物质流失，保证青贮营养品质。但乳酸菌含量过高会降低青贮饲料中抗真菌物质的含量，使青贮饲料在有氧暴露后容易发生霉变^［16-17］。霉菌及其有毒代谢产物对饲料的污染较为严重，易引起家畜致癌、致突变和中毒等一系列的生理和生物毒害，被认为是饲料和食品中的最大危害^［18］。酵母菌在青贮过程中可以产生芳香物质，增加青贮饲料的风味，但在发酵过程中还会产生正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸、丙酸和异丁酸，产生的代谢物易分解乳酸并使青贮饲料pH升高，腐败菌滋生，是导致青贮饲料初期腐烂变质的重要微生物因素^［19］。

当下针对病原菌影响青贮玉米微生物多样性和群落结构的相关研究较少，对于病原菌能否影响青贮菌群平衡尚不明确。因此，本研究通过Illumina测序技术深入分析青贮玉米真菌性病害对青贮发酵微生物多样性及群落结构的影响，对后续开展青贮饲料解毒研究及分析青贮玉米营养品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源及青贮处理

试验材料为2023年9月中旬在青海大学试验田采集的仅发生链格孢叶斑病（Alternaria leaf spot disease of silage maize，YLG）、麦根腐平脐蠕孢叶斑病（Bipolaris sorokiniana leaf spot disease of silage maize，YM）、瘤黑粉病（Ustilago maydis silage maize，YL）、锈病（rust silage maize，YX）和未发生任何病害（CK）的乳熟期全株青贮玉米。试验材料中锈病和瘤黑粉病利用病状和病症区分，麦根腐平脐蠕孢叶斑病和链格孢叶斑病分离病原菌并进行形态学鉴定。各采集3株玉米，用铡草机（锋钢40 cm，山东临沂）切割为1 cm×1 cm小段后装入500 g青贮发酵袋，每种样品各青贮3个重复。常温避光青贮发酵40 d后，从各处理青贮袋不同位置取10 g样本直接提取DNA或置于-80 ℃冰箱备用。

1.2 青贮样品DNA提取及PCR扩增

总DNA的提取采用CTAB^［20］法，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量。使用带条形码的特异引物对总DNA的16S rRNA V3~V4区（779F：5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′，1193R：5′-ACGTCA TCCCCACCTTCC-3′）和ITS1（ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS2R：5′-GCTGCG TTCTTCATCGATGC-3′）进行PCR扩增。采用50 μL扩增体系，扩增反应条件为98 ℃预变性5 min，98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物置于2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余样品4 ℃保存备用^［21］。扩增产物采用Illumina平台进行双端测序。测序由上海美吉生物科技有限公司完成。原始数据上传至NCBI SRA数据库，登录号为：PRJNA1105876和PRJNA1106232。

1.3 数据处理

使用fastp^［22］（version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH^［23］（version 1.2.7）软件进行拼接，使用UPARSE^［24］软件（version 7.1），根据97%^［25-26］的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit， OTU）聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier^［27］ （version 2.2） 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库（version 138）和UNITE ITS数据库（version 8.0）设置比对阈值为70%。利用Mothur（version 1.30.2）软件将所有样本抽平到相同的测序深度，在OTU水平上计算丰富度和多样性指数^［28］。比例<0.01%的分类群归为“其他”。使用R语言（version 3.3.1）进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 不同发病青贮玉米OTU分类

根据97%相似度对抽平后的序列进行OTU聚类分析（图1），未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组，5组处理总共得到353个真菌OTU和270个细菌OTU。5组样品含有的真菌OTU分别为74、63、83、71和93；共有的真菌OTU有33个，占真菌OTU总数的9.3%。未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组中特有的真菌OTU分别为45、22、38、25和57，其中发生锈病组中特有的OTU数目最多，发生链格孢叶斑病组中特有的OTU数目最少。不同发病处理5组样品含有的细菌OTU分别为48、102、42、86和45；共有的细菌OTU有28个，占细菌OTU总数的10.37%，5类样品未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组中特有的细菌OTU分别为18、64、10、39和7，其中发生链格孢叶斑病组中特有的OTU数目最多，发生锈病组中特有的OTU数目最少。

2.2 不同发病处理青贮玉米样品真菌和细菌α多样性

对5组处理进行α多样性分析（表1和表2），显示真菌和细菌覆盖率均在99%以上，表明测序数据的合理性与真实性。真菌多样性中发生锈病组样品Chao1指数和ACE指数最大，为93.1111和93.4416，表明其物种最丰富，并且比未发生病害组样品高16.2111和16.7951；发生锈病组样品Shannon指数最大，为2.8101，表明其物种均匀度最高，比未发生病害组样品高1.6170。细菌多样性中发生链格孢叶斑病组样品Chao1指数和ACE指数最大，为113.3268和118.3162，表明其物种最为丰富，比未发生病害组样品高58.5238和61.3536；发生链格孢叶斑病组样品Shannon指数最大，为0.9392，表明其物种均匀度最高，比未发生病害组样品高0.2839。

2.3 不同发病处理的青贮玉米真菌群落结构差异性

在门分类水平上（图2a），5组处理的青贮玉米真菌优势门有6个，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分类的真菌（unclassified_k_fungi）、被孢霉门（Mortierellomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）和壶菌门（Chytridiomycota）。子囊菌门占比最高，分别占未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组的82.68%、79.78%、64.38%、75.94%和61.40%；担子菌门占比次之，分别占各组的17.06%、20.22%、35.59%、23.97%和38.38%。毛霉菌门只出现在未发生病害组中，相对丰度为0.17%；壶菌门只出现在发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组样品中，相对丰度为0.17%。

在目分类水平上（图2b），不同发病处理的青贮玉米真菌优势目有10个，分别为酵母菌目（Saccharomycetales）、银耳目（Tremellales）、肉坐菌目（Hypocreales）、线黑粉菌目（Filobasidiales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、担孢酵母目（Erythrobasidiales）、伞形束梗孢菌目（Agaricostilbales）、黑粉菌目（Ustilaginales）和囊担菌纲未定分类（Cystobasidiomycetes_ord_incertae_sedis）。酵母菌目在各组样品中相对丰度最高，在样品未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组中的占比分别为78.75%、72.54%、41.51%、71.24%和25.89%；银耳目在各组样品中的相对丰度仅次于酵母菌目，5组样品中的占比分别为10.54%、19.92%、16.99%、17.67%和19.34%。黑粉菌目在发生瘤黑粉病组中的相对丰度最高，为5.09%；肉坐菌目和担孢酵母目在发生锈病组中的相对丰度较高，为16.81%和1.68%；刺盾炱目在发生锈病组中的占比最高，为14.88%；格孢腔菌目和伞形束梗孢菌目在发生链格孢叶斑病组中的相对丰度较高，为6.42%和5.09%。

在属分类水平上（图2c），不同发病处理的青贮玉米真菌优势属有30个，样品中占比大于1%的属有18个，分别为：伊萨酵母属（Issatchenkia）、Papiliotrema、线黑粉酵母属（Filobasidium）、Hannaella、亚格孢壳属（Didymella）、Vishniacozyma、Symmetrospora、异常威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）、念珠菌属（Candida）、镰刀菌属（Fusarium）、Kondoa、担孢酵母属（Erythrobasidium）、Preussia、Occultifur、Pseudozyma、外瓶霉属（Exophiala）、枝孢霉属（Cladosporium）和帚枝霉属（Sarocladium）。5组样品共有的优势属有15属，在样品未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组中共有菌属占比前5的有：伊萨酵母属占比分别为75.34%、72.36%、7.80%、78.28%和14.17%；Papiliotrema属占比分别为2.50%、19.02%、10.88%、16.72%、11.97%；镰刀菌属占比分别为0.11%、0.15%、3.23%、15.75%、10.35%；线黑粉酵母属占比分别为2.38%、0.16%、8.96%、0.97%和5.46%；Hannaella属占比分别为5.70%、0.21%、2.46%、0.28%和4.28%。优势菌属中仅出现在发生链格孢叶斑病组、麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、瘤黑粉病组和锈病组的有5属，分别为：念珠菌属、外瓶霉属、帚枝霉属、Occultifur和附球菌属（Epicoccum）。念珠菌属在各组占比为0.11%、33.59%、0.05%和11.62%；外瓶霉属在各组占比为0.39%、0.67%、0.14%和14.79%；帚枝霉属在各组占比为0.02%、0.51%、0.48%、2.59%；Occultifur属在各组占比为0.06%、1.21%、0.03%和1.39%；附球菌属在各组占比为0.68%、0.10%、0.02%和0.06%。有益真菌异常威克汉姆酵母属在未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组中的占比分别为3.39%、0.07%、0.02%、0.06%、0.04%。青霉菌属在发生锈病、麦根腐平脐蠕孢叶斑病和未发生病害青贮样本中的丰度分别为0.80%、0.30%和0.04%；曲霉菌属在发生锈病、麦根腐平脐蠕孢叶斑病和未发生病害青贮样本中的丰度分别为0.50%、0.30%和0.22%。

2.4 不同发病处理的青贮玉米细菌群落结构差异性

在门分类水平上（图3a），不同发病处理的青贮玉米细菌优势门有10个，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、未分类门的细菌（unclassified_k_norank_d_bacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、隐杆菌门（Abditibacteriota）、奇异球菌门（Deinococcota）、Patescibacteria和黏球菌门（Myxococcota）。在样品未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组中，相对丰度大于1%的门是厚壁菌门和变形菌门，厚壁菌门在各组的相对丰度为95.22%、95.06%、96.71%、98.85%和99.73%；变形菌门在各组的相对丰度为4.74%、4.46%、3.22%、1.12%和0.20%；黏球菌门和Patescibacteria门只出现在发生链格孢叶斑病组中，相对丰度为0.0006%和0.0020%；只有发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组中不存在拟杆菌门，相对丰度为0。

在目分类水平上（图3b），不同发病处理的青贮玉米细菌优势目有10个，分别为乳杆菌目（Lactobacillales）、肠杆菌目（Enterobacterales）、黄色单胞菌目（Xanthomonadales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、微球菌目（Micrococcales）、黄杆菌目（Flavobacteriales）、梭菌目（Clostridiales）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）和芽孢杆菌目（Bacillales）。在样品未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组中占比最高的菌目是乳杆菌目，其在各组中的占比分别为95.09%、94.98%、96.43%、98.81%和99.72%。未发生病害组、发生瘤黑粉病组和发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组中相对丰度较大的菌目为肠杆菌目，占比分别为4.61%、2.08%和0.87%；发生链格孢叶斑病组中相对丰度较大的菌目为黄色单胞菌目，占比2.14%。未发生病害组和发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组中无黄色单胞菌目，相对丰度为0。

在属分类水平上（图3c），不同发病处理的青贮玉米细菌优势属有10个，分别为乳杆菌属（Lactobacillus）、拉乌尔菌属（Raoultella）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、未分类属产碱杆菌科（unclassified_f_Alcaligenaceae）、沙雷菌属（Serratia）、明串珠菌属（Leuconostoc）、丛毛单胞菌属（Comamonas）和未分类纲肠杆菌目（unclassified_o_Enterobacterales）。乳杆菌属在未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组的相对丰度分别为93.67%、93.72%、96.19%、97.69%和99.22%，是5组中的优势菌属，发生锈病组中乳杆菌属含量最高。未发生病害组中无寡养单胞菌属和丛毛单胞菌属，相对丰度均为0。除乳杆菌属外，未发生病害组中相对丰度大于1%的属为拉乌尔菌属（4.38%）和肠球菌属（1.01%），发生链格孢叶斑病组中为寡养单胞菌属（2.14%）和乳球菌属（1.11%），发生瘤黑粉病组中为拉乌尔菌属（1.63%）。乳酸菌中肠球菌属在未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组中相对丰度为1.009%、0.135%、0.079%、0.716%和0.200%；明串珠菌属在各组中相对丰度为0.106%、0.005%、0.003%、0.076%和0.276%；魏斯氏菌在各组中相对丰度为0.012%、0.006%、0.001%、0和0.001%；链球菌属仅出现在未发生病害组中，相对丰度为0.003%。

2.5 不同发病处理的青贮玉米真菌和细菌β多样性分析

真菌OTU散点图结果表明（图4a），第一主坐标与第二主坐标贡献率分别为15.56%和12.13%，未发生病害组、发生瘤黑粉病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组相聚较近，说明3组真菌OTU较为接近；发生锈病组与各组相比较远，说明发生锈病组真菌OTU与其他组有差异。细菌OTU散点图结果表明（图4b），第一主坐标与第二主坐标贡献率分别为20.28%和15.35%，未发生病害组、发生锈病组、发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组相聚较近，说明3组细菌OTU分类相似；发生瘤黑粉病组、发生链格孢叶斑病组与其他3组无交接，且距离较远，说明发生瘤黑粉病组与发生链格孢叶斑病组细菌OTU与其他组有明显差异。

2.6 不同发病处理的青贮玉米真菌和细菌LEfSe物种差异性分析

真菌群落线性判别分析（linear discriminant analysis， LDA）（LDA>2，P<0.05）表明，属水平上伊萨酵母属、酵母属（Saccharomyces）和外瓶霉属的丰度分别对未发生病害组、发生瘤黑粉病组和发生锈病组差异效果影响最大，目水平上肉坐菌目、黑粉菌目和刺盾炱目的丰度分别对发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病、瘤黑粉病组和锈病组差异效果影响最大。细菌群落LDA分析（LDA>2，P<0.05）表明属水平上拉乌尔菌属、寡养单胞菌属、拉恩氏菌属（Rahnella）和乳杆菌属的丰度分别对未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和锈病组差异影响效果最大，目水平上肠杆菌目、黄色单胞菌目、类芽孢杆菌目和乳杆菌目的丰度分别对未发生病害组、发生链格孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组和锈病组差异影响效果最大（图5）。

3 讨论

研究结果表明，微生物α多样性中，未发生病害组真菌多样性略高于发生瘤黑粉病组和发生链格孢叶斑病组，但显著低于发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组和发生锈病组，未发生病害组细菌多样性高于发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病组、发生瘤黑粉病组、发生锈病组，但低于发生链格孢叶斑病组。陈义勇等^［29］的研究结果显示在茶饼病发病叶片中细菌多样性明显低于健康叶片；发病叶片真菌多样性高于健康叶片。而涂敏等^［30］的研究结果显示患红根病橡胶树（Hevea brasiliensis）根际土壤真菌多样性显著降低，OTU数量和Alpha多样性指数均低于健康橡胶树根际土壤；患病植株根际土壤细菌多样性略高于健康植株。本研究结果与他人研究结果既有相似又有不同，可能是植物种类和所患病害种类不同等导致。

在检测样本中真菌群落子囊菌门、担子菌门、未分类的真菌、被孢霉门、毛霉菌门和壶菌门为优势菌门；其中子囊菌门和担子菌门是真菌群落中的优势菌门，占各样本丰度的90%以上。本研究结果与胡子贤^［31］的患病结香（Edgeworthia chrysantha）和健康结香根际土壤主要优势真菌门的结果基本一致。检测样本中细菌门分别为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、未分类门的细菌、疣微菌门、隐杆菌门、奇异球菌门、Patescibacteria和黏球菌门；其中厚壁菌门和变形菌门是优势细菌门。陈三冬等^［32］对青贮玉米有氧暴露条件下细菌群落多样性进行研究发现，厚壁菌门和变形菌门为优势细菌门。李冬丽等^［33］对海南香蕉（Musa nana）枯萎病的研究中发现健康植株和患病植株的土壤均以变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门、黄杆菌门、绿弯菌门和螺旋菌门为主要优势菌群。本研究结果与其基本一致。

青贮完成后不同样品中各菌属成分和丰度均有差异，镰刀菌属在发生瘤黑粉病玉米、链格孢叶斑病玉米、麦根腐平脐蠕孢叶斑病玉米、锈病玉米和未发生病害玉米组中的丰度分别为15.75%、0.15%、3.23%、10.35%和0.11%，发生病害的青贮玉米中镰刀菌属丰度均高于未发生病害组。祁鹤兴等^［9］研究发现镰刀菌可以引起青贮玉米病害，为青贮玉米致病真菌。青霉菌属在发生锈病、麦根腐平脐蠕孢叶斑病和未发生病害青贮样本中的丰度分别为0.80%、0.30%和0.04%，这两种发生病害样本中青霉菌属丰度显著高于未发生病害组；曲霉菌属在发生锈病、麦根腐平脐蠕孢叶斑病和未发生病害青贮样本中的丰度分别为0.50%、0.30%和0.22%，这两种病害中曲霉菌属丰度均高于未发生病害组。镰刀菌、青霉和曲霉等真菌会产生多种真菌毒素，从而影响青贮品质和畜牧安全^［34-36］。念珠菌属在发生瘤黑粉病玉米、链格孢叶斑病玉米、麦根腐平脐蠕孢叶斑病玉米、锈病玉米组中的丰度分别为0.05%、0.11%、33.59%、11.62%，念珠菌属未出现在未发生病害组中，发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病玉米中念珠菌属丰度最高。念珠菌会通过饲草进食侵染牲畜导致牲畜患病^［37］。

未发生病害组异常威克汉姆酵母属丰度高于各发病组，说明异常威克汉姆酵母菌可以抑制部分病原真菌，具有一定的抑制毒素作用，从而降低或抑制未发生病害组中镰刀菌属、青霉菌属、曲霉菌属等有害微生物的丰度。蓝黄博恩^［38］和Zhu等^［39］发现异常威克汉姆酵母菌对番茄（Solanum lycopersicum）病害病原真菌抑制作用明显；此外，有研究证明异常威克汉姆酵母菌可以用于饲料中的毒素降解^［40］。各组样品细菌群落属水平菌群有乳杆菌属、拉乌尔菌属、寡养单胞菌属、乳球菌属、肠球菌属、未分类属产碱杆菌科、沙雷菌属、明串珠菌属、丛毛单胞菌属和未分类纲肠杆菌目。本研究结果与陈三冬等^［32］和张咚咚等^［41］的研究结果基本一致。本试验结果中，在发生瘤黑粉病玉米、链格孢叶斑病玉米、麦根腐平脐蠕孢叶斑病玉米、锈病玉米和未发生病害玉米组中肠球菌属丰度分别为0.079%、0.135%、0.716%、0.200%和1.009%；魏斯氏菌属在以上组中丰度为0.001%、0.006%、0、0.001%和0.012%；链球菌属仅出现在未发生病害组中，相对丰度为0.003%。肠球菌属、魏斯氏菌属和链球菌属都是乳酸菌类菌种，可以促进发酵进程、提高青贮品质^［42-43］；发生病害组中这3类菌属丰度低于未发生病害组，原因可能是病原菌影响了该类乳酸菌正常生长。

4 结论

本研究针对4种真菌性病害对青贮微生物群落多样性影响进行分析，发现病原菌会影响青贮微生物群落多样性。发生病害组中的微生物群体较未发生病害组更复杂多样，其中锈病对真菌多样性影响最大，香农指数最高，链格孢叶斑病对细菌多样性影响最大，香农指数最高。镰刀菌属和念珠菌属丰度在发生病害组高于未发生病害组，青霉菌属和曲霉菌属丰度在发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病和锈病组高于未发生病害组，其中发生麦根腐平脐蠕孢叶斑病和锈病的玉米中这4种致病菌丰度较高。肠球菌属、魏斯氏菌属、链球菌属在未发生病害玉米中丰度较高。综上，真菌性病害会影响青贮微生物群落多样性，导致致病病菌增加，使得肠球菌属、魏斯氏菌属、链球菌属丰度降低，破坏青贮发酵环境，影响发酵过程正常进行，从而可能导致青贮饲料品质下降。

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基金资助

国家自然科学基金(32460653)