“凹凸棒-有机基质”菌肥载体最佳配比的筛选及对紫花苜蓿的促生效果研究

Screening of the best ratio of ‘attapulgite-organic matrix’ bacterial fertilizer carrier and its growth-promotion effect on alfalfa

摘要

为了探究凹凸棒加有机基质作为菌肥载体的可行性以及制作菌肥时菌液的最佳添加量。本试验通过向有机基质中添加不同梯度凹凸棒（分别为5%、7.5%、10%）作为菌肥载体，然后向其中添加不同梯度菌液（分别为25%、27.5%、30%）制作成固体菌肥；通过测定菌肥货架期及紫花苜蓿盆栽试验验证菌肥促生效果，确定凹凸棒添加量以及菌液添加量。结果显示：菌肥保存180 d后，不同载体菌肥有效活菌数均大于2×10⁸ cfu·g^-1，杂菌数均小于3×10⁶ cfu·g^-1，其中5%凹凸棒加25%的菌液（F₂+25%菌液）处理效果最好；7.5%凹凸棒加30%菌液（F₃+30%菌液）处理下，紫花苜蓿结瘤数最多，为62.7个·盆^-1，较对照提高了317.8%。5%凹凸棒加25%的菌液（F₂+25%菌液）处理下，紫花苜蓿地上、地下生物量、叶绿素含量较对照分别提高了46.5%、86.2%和54.9%；总根长、总根表面积、根尖数和根分叉数较对照提高了87.7%、108.4%、96.2%和252.0%；通过隶属函数分析得出，5%凹凸棒加25%的菌液（F₂+25%菌液）处理对紫花苜蓿促生效果最好。

Abstract

This experiment explored the feasibility of attapulgite plus an organic matrix as a carrier of bacterial fertilizer and the optimal amount of bacterial liquid to be added when making bacterial fertilizer. Different amounts of attapulgite （5%， 7.5%， 10%； F₁， F₂ and F₃， respectively） were added to an organic matrix as the carrier for bacterial fertilizer， and then different quantities of bacterial liquid （25%， 27.5%， 30%） were added to make solid bacterial fertilizer. The shelf life of bacterial fertilizer was evaluated and the growth-promotion effect of the bacterial fertilizer was verified by measuring plant traits of alfalfa（Medicago sativa） in a pot experiment， for the various attapulgite and bacterial liquid addition treatments. It was found that 180 days after preparation， the effective viable count of all the different bacterial fertilizer carrier formulations was more than 2×10⁸ cfu·g^-1， and the number of miscellaneous bacteria was less than 3×10⁶ cfu·g^-1. The number of alfalfa nodules was the highest （62.7 per pot； 317.8% higher than control plants with no bacterial fertilizer added） under the treatment combination F₃+30% bacterial liquid. The above-ground and below-ground biomass and chlorophyll content of alfalfa under the treatment comprising F₂+25% bacterial liquid were increased by 46.5%， 86.2% and 54.9%， respectively， while the total root length， total root surface area， root tip number and root bifurcation number were increased by 87.7%， 108.4%， 96.2% and 252.0%， respectively， compared with the control plants. However， when data were analyzed by multivariate membership function， the treatment comprising F₂+25% bacterial liquid was found to have the best effect on the growth of alfalfa.

Graphical abstract

关键词

凹凸棒 / 菌肥载体 / 紫花苜蓿 / 促生特性

Key words

attapulgite / bacterial fertilizer carrier / alfalfa / plant growth-promoting characteristics

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界各国广泛种植的优良豆科牧草，具有生长快、生物量大和对不良环境适应性强等特性^［1］。虽然苜蓿可通过根瘤固氮获得生长发育所需要的氮素营养，但作为一种需磷量大的多年生作物，其对磷素的含量极为敏感^［2］，在种植过程中对磷肥的需求量较高，主要通过大量化肥来补充，但长期大量施用化肥会对环境造成严重污染。因此，寻找一种绿色、安全、环保的新型肥料已成为当前的热点，近些年来菌肥的发展为这一问题的解决带来了新的思路。

菌肥作为一种新型环保型肥料，具有促进植物对养分的吸收、抑制病原菌、提高肥料利用率、改良土壤质量等优点，已广泛应用于禾谷类、油料类等作物，且增产与土壤改良效果明显^［3］。但菌肥自身的特殊性直接影响其在农业生产中的推广应用，尤其是质量控制方面，比如用于菌肥的载体质量较差^［4］，载体能够给微生物提供一个稳定的环境，以免受到外界不利环境的影响。理想的载体应该具有较大的比表面积、较强的吸附性、来源广泛，对菌种、土壤和作物无毒无害，同时载体必须有利于菌种生存且可持续生产^［5］。我国对菌肥载体的研究起步较晚，目前以泥炭作为菌肥载体的研究较多^［6］，但其作为天然矿产资源再生能力较低，长期持续开采会对生态环境造成极大的破坏，并且开采成本较高。因此，寻找其他的材料来替代泥炭已成为菌肥生产中的重要问题之一。

凹凸棒（attapulgite， ATP）是一种存在于自然界中2∶1型的层链状晶质水合镁铝盐矿物，具有较大比表面积、丰富的孔隙及较强的极性，其特殊的胶体性质和晶体结构提供了出色的离子交换性能^［7］，被广泛用于材料学以及土壤修复领域。有研究表明，凹凸棒可以钝化修复重金属污染土壤，缓解金属铬对植物的胁迫^［8］，改良土壤，调理土壤结构，和其他材料组合包埋制作新型肥料^［9］。此外，凹凸棒能够吸附霉菌毒素和重金属离子^［10］。因此，将凹凸棒作为菌肥载体具有很大的应用潜力，然而凹凸棒在作为菌肥载体方面的研究较少。

因此，本试验选用有机肥加凹凸棒作为复合菌系的载体，分析了该物质作为菌肥载体的可行性，并通过对紫花苜蓿的促生效果评价，以期筛选出优良且平价的菌肥载体配方。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

由甘肃农业大学草地微生物多样性实验室提供，菌株分离自不同植物根际，其促生特性见表1。

1.1.2 供试载体及制作

载体由有机基质（有机肥）和凹凸棒两部分组成，按照一定比例向有机肥中添加凹凸棒（表2）制成菌肥载体。

有机肥来源于甘肃大行农业科技开发有限公司，含水率为9.26%，pH为7.87，有机质含量为48.14%，全氮含量为3.28 g·kg^-1，全钾含量为1.28 g·kg^-1，全磷含量为2.69 g·kg^-1；凹凸棒购自甘肃临泽县兰花循环农业示范园区，形状为棕色大圆颗粒，pH为7.63，含水率14.5%，全氮含量为0.35 g·kg^-1，全钾含量为0.37 g·kg^-1，全磷含量为0.48 g·kg^-1，还富含钙、钾、镁和锌等营养元素。

1.2 试验方法

1.2.1 载体吸水率测定

在无菌条件下，将无菌水与各载体材料充分混匀，每次加入无菌水的量按照一定梯度逐渐增加，使载体材料保持湿润、疏松、不结块。以100 g载体所含无菌水量为载体吸水率，重复3次，取平均值（表3）。

1.2.2 载体理化性质分析

全氮（半微量凯氏定氮法）、全磷（钼锑抗试剂测定法）、有效磷（0.5 mol·L^-1 NaHCO₃法）、全钾（氢氧化钠熔融-原子吸收分光光度计法）、速效钾（醋酸铵-原子吸收分光光度计法）含量参考鲍士旦^［11］的方法测定。不同载体配方之间氮、磷、钾含量差异不显著（表4）。

1.2.3 菌肥制作

将供试菌株LY、LM3、LM2分别单独接种于LB液体培养基（氯化钠5.0 g、酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、1000.0 mL蒸馏水）中，160 r·min^-1、28 ℃培养24 h，待菌株充分生长后，采用牛津杯法^［12］对菌株进行拮抗测定，将确定无拮抗反应的各菌株分别接种于LB培养基中180 r·min^-1、28 ℃培养24 h后，将3种菌液按体积比1∶1∶1接种于LB液体培养基中160 r·min^-1、28 ℃混合培养48 h，测定并调节菌液含菌量约10⁸ cfu·mL^-1，备用^［13］。

将1.1.2节中不同载体组合灭菌2 h后分装成250 g小袋，接种制作好的菌株悬浮液（接菌量为载体质量的25.0%、27.5%和30.0%），先将菌液与载体充分混匀后装入自封袋中立即封口，用灭菌针在塑料袋的四周随机扎4个孔，再外套一个聚乙烯塑料袋，一切操作均在无菌条件下进行。将制作好的固体菌肥置于28 ℃下培养15 d，之后常温保存备用。

1.2.4 菌肥货架期测定

用LB培养基^［14］对储存于室温下的菌肥进行培养；于30、60、90、120、150、180 d采用稀释平板计数法^［15］各测定一次有效活菌数；同时，检查是否有霉变和产生异味等。

用马丁培养基^［16］（磷酸二氢钾1.0 g、葡萄糖10.0 g、七水硫酸镁0.5 g、蛋白胨5.0 g、1%孟加拉红水溶液3.3 mL、氯霉素0.1 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1000 mL）对储存于室温下的菌肥进行培养；于30、60、90、120、150、180 d采用稀释平板计数法各测定一次杂菌数量。

1.3 菌肥促生效果评价

1.3.1 供试植物

供试植物为紫花苜蓿中苜一号（M. sativa cv. Zhongmu No. 1），由甘肃农业大学草业学院提供。

1.3.2 土壤来源

土壤取自于甘肃省白银市景泰县五佛乡旱坝；地理位置N 37°15′，Ｅ104°07′，位于景泰县东北部；地处低山丘陵区，平均海拔1300 m，年平均气温10.8 ℃，年平均降水量156.6 mm，蒸发量3038 mm，年平均日照时数2725.5 h，无霜期160 d左右，试验地土壤pH为8.01，全氮为0.25 g·kg^-1，全钾为1.69 g·kg^-1，全磷为0.98 g·kg^-1。

1.3.3 盆栽试验设计

于2023年10月在甘肃农业大学恒温生长室内种植，白天24 ℃、湿度45%、光照6000 lx、时间16 h；夜晚24 ℃、湿度45%、时间8 h。选择饱满且大小一致的紫花苜蓿种子，用20%的NaClO灭菌2 min左右，蒸馏水冲洗5次。将种子（30粒·盆^-1）均匀种植于盛有1 kg土壤的花盆（上口径11.6 cm、底径8.8 cm、高度15.8 cm）中，待幼苗生长60 d左右，测定各项指标。播种前将菌肥与紫花苜蓿种子进行拌种，菌肥用量为112.5 kg·hm^-2。试验共有16个处理，每个处理3次重复（表5）。

1.3.4 测定指标及方法

每盆随机选取6株，测定土壤到枝条的垂直高度为株高。将各处理的植株地上、地下部分分开采集，装入自封袋中，用烘干法^［17］测定生物量。采用LA2400 scanner 型根系扫描仪（Epson Expression 1000 XL，中国）测定总根长、总根表面积和总根体积等指标^［18］。将每个处理植株的根全部取出，采用传统计数法^［19］测定每盆紫花苜蓿的根瘤数。采用乙醇提取法^［20］测定叶绿素含量，计算公式如下：

Chla=\mathrm{13.95}{D}_{\mathrm{665}}-\mathrm{6.68}{D}_{\mathrm{649}}

Chlb=\mathrm{24.96}{D}_{\mathrm{649}}-\mathrm{7.32}{D}_{\mathrm{665}}

\mathrm{叶绿}\mathrm{素总}\mathrm{含量}=Chla+Chlb

式中：Chla代表叶绿素a的含量；Chlb代表叶绿素b的含量；D₆₆₅代表665 nm下的吸光值；D₆₄₉代表649 nm下的吸光值。

1.4 数据分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验，采用Duncan’s新复极差法进行显著性方差分析；采用Origin 2022进行绘图与数据处理。用模糊数学隶属函数法对各处理紫花苜蓿各项指标进行综合评价^［21］。

2 结果与分析

2.1 菌肥货架期的测定

2.1.1 不同处理菌肥有效活菌数变化

菌肥中的有效活菌数量是判定菌肥质量的关键指标（图1）。随着菌肥存放时间的延长，不同处理中的有效活菌数大部分呈先上升后下降趋势。贮存0~30 d，当菌液添加量为25%时，除F₄以外，其余处理有效活菌数均呈上升趋势；当菌液添加量为27.5%时，F₃和F₄有效活菌数呈下降趋势，F₁和F₂呈上升趋势；当菌液添加量为30%时，F₂有效活菌数呈下降趋势。60~180 d时，各处理有效活菌数整体呈先上升后缓慢下降趋势。不同处理菌肥保存180 d时，有效活菌数均大于2×10⁸ cfu·g^-1；其中当菌液添加量为25%时，F₃处理的有效活菌数最高，当菌液添加量为27.5%和30%时，F₂处理的有效活菌数最高。

2.1.2 不同处理菌肥杂菌数变化

国家农用微生物菌剂要求固体菌肥保存6个月之后杂菌数必须低于3×10⁶ cfu·g^-1［22］。在0~30 d时，不同处理菌肥杂菌数迅速增长（图2）。在30~180 d时，不同处理菌肥杂菌数呈缓慢增长趋势。当贮存180 d时，菌液添加量为25%时，F₂处理杂菌数最少，菌液添加量为27.5%时，F₄处理杂菌数最少，菌液添加量为30%时，F₄处理杂菌数最少，但不同处理菌肥杂菌数均不超过3×10⁶ cfu·g^-1，符合国家菌肥制作标准。

2.2 盆栽试验结果

2.2.1 不同处理菌肥对紫花苜蓿农艺性状的影响

不同载体和菌液添加量对紫花苜蓿株高均有显著影响（图3）。在同一载体处理下，添加菌液处理紫花苜蓿株高较不添加菌液处理下显著提高，且添加25%和27.5%菌液处理株高较添加30%菌液处理有显著提高；在相同菌液添加量下，F₂处理紫花苜蓿株高最高，与F₄相比有显著差异（除0菌液添加）；F₂+25%菌液处理紫花苜蓿株高最高，为33.9 cm，较无添加的对照处理提高了70.4%。

不同载体和不同菌液添加量对紫花苜蓿地上生物量的影响呈不同的趋势（图4A）。在相同的菌液添加量下，不同载体影响了紫花苜蓿的地上生物量，当菌液添加量为27.5%时，F₃处理比F₁、F₂和F₄处理紫花苜蓿地上生物量增加了21.3%、3.4%和181.2%。在F₂处理下，不同菌液之间没有显著差异，F₃处理下，27.5%菌液与30%菌液之间有显著差异；在F₃+27.5%的菌液处理下，紫花苜蓿地上生物量最高，较无添加对照处理增加了58.3%。

不同载体和不同菌液添加量对紫花苜蓿地下生物量有显著影响（图4B）。在25%菌液添加下，F₂处理紫花苜蓿地下生物量最高，较F₁、F₃和F₄处理分别提高了40.1%、62.5%和64.4%。在相同载体处理下，不同菌液处理之间存在显著差异。在F₂+25%的菌液处理下，紫花苜蓿地下生物量最高，较无添加对照处理提高了86.2%。

2.2.2 不同处理菌肥对紫花苜蓿根系形态的影响

在F₂+25%菌液处理下，紫花苜蓿总根长、总根表面积、根尖数和根分叉数增加最多；F₄+0菌液处理下总根体积最大；F₂+27.5%菌液处理下，根交叉数最多（表6）。

2.2.3 不同处理菌肥对紫花苜蓿叶绿素含量的影响

在25%的菌液添加下，F₂处理较F₁处理对紫花苜蓿叶绿素含量促进作用显著（P<0.05）；除F₃+25%菌液及F₄+30%菌液之外，添加菌液25%、27.5%和30%较不添加菌液均对紫花苜蓿叶绿素含量有促进作用。F₂+25%菌液处理下，紫花苜蓿的叶绿素含量最高，为38.44 mg·L^-1，较无添加的对照处理提高了54.9%（图5）。

2.2.4 不同处理菌肥对紫花苜蓿根系结瘤数的影响

根系结瘤数随着菌液添加量的增加而增多，当菌液添加量为30%时，根系结瘤数最多（F₂除外）；在F₃+30%菌液处理下根系结瘤数最多，为62.7个·盆^-1，较无添加处理提高了317.8%（图6）。

2.2.5 隶属函数综合性分析

采用模糊隶属函数法对所测的10个盆栽指标进行计算分析，综合评价不同处理菌肥对紫花苜蓿生长的促进作用。结果表明，在所有的处理中，F₂+25%菌液处理隶属函数值最高，表现最好，其次为F₂+27.5%菌液；隶属函数值最低的为F₄+25%菌液处理（表7）。

3 讨论

菌肥是由于微生物生命活动而使农作物得到特定肥料效应的一类制品^［23］。许多有益微生物在生长发育过程中能够为植物提供一些营养元素以及分泌对植物生长有利的初级或次级代谢产物，如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）、脱落酸（abscisic acid， ABA）等^［24］，进而促进植物生长。因此菌肥中的有效活菌数是评价菌肥质量的一个重要指标。本试验通过稀释平板计数法测定了不同处理菌肥的有效活菌数；结果表明：不同处理菌肥的有效活菌数整体随贮存时间的延长而降低，在贮存180 d后各处理有效活菌数均符合菌肥行业GB 20287-2006国家标准^［22］；其中，在0~90 d，F₂+25%菌液处理有效活菌数最高；90~180 d，F₂+27.5%菌液处理有效活菌数最高；整体来看，在0~180 d，F₂+25%菌液处理有效活菌数最高。原因可能是不同梯度菌液添加影响了菌肥的含水率。菌肥中含水量过低会导致细菌的活性受到抑制，含水量过高会造成厌氧环境，导致需氧细菌的死亡，菌肥中有效活菌数降低；添加5%凹凸棒时菌剂中有效活菌数比其他凹凸棒添加量高的原因可能是，少量凹凸棒添加时会对微生物提供一定的营养物质，当添加量过高时有效活菌数反而低的原因可能是在有机肥中添加凹凸棒的量超过10%时，将会使得有机肥中氮素损失增加，有机质含量降低^［25］，微生物可利用的营养减少，使得菌剂中有效活菌数降低，具体原因有待进一步探究。

根系是土壤养分的利用者和产量的贡献者^［26］，且对植株起固定作用，同时根系是作物吸收水分和营养物质的主要通道，以供植物体正常生长发育^［27］。本研究结果发现，菌肥中有效活菌数与紫花苜蓿的根系形态呈正相关，在F₂+25%菌液处理下菌肥活菌数最高，同时该处理能够有效促进紫花苜蓿总根长、总根表面积、根尖数和根分叉数，这是因为菌肥中包含的有益微生物可产生大量的有机酸，将土壤中的不溶性磷转变为植物可利用的有效磷，从而增强土壤中磷对作物的供应。此外植物根系周围的促生菌还可将少量固定的氮素供给植物，发挥良好的固氮促生作用^［28］。其部分原因还可能来自菌肥载体，本试验所用的菌肥载体由有机肥加不同比例凹凸棒构成，为富营养介质，在幼苗生长阶段为其提供了部分营养。杨建军等^［29］发现凹凸棒能显著提高红芪（Radix hedysari）主根长和地下根干物质积累量，本试验结果与其基本一致。

根系与地上部分的生长关系复杂而微妙，根系发达且生理活动旺盛，可以有效促进地上部分枝叶的生长发育，为植株其他部分的生长提供能源和原材料。紫花苜蓿作为一种多年生豆科植物，以其高生物量产出和优良的营养价值而著称^［30］。株高和生物量则是衡量紫花苜蓿生长发育状况的重要指标，可作为描述紫花苜蓿生长状况及产量的直观表象。本研究结果表明，F₂+25%菌液处理对紫花苜蓿的株高和地上、地下生物量促进作用最明显，分别较对照提高了70.4%、46.5%和86.2%。贺生兵等^［31］研究发现，在葡萄（Vitis vinifera）上施用凹凸棒复合微生物肥料能够使葡萄表现出增产和提质的效果，Guan等^［32］研究发现凹凸棒包衣化肥可以使玉米（Zea mays）产量提高15.1%~18.4%，李昌宁等^［33］研究发现植物根际促生菌能够有效促进紫花苜蓿的生长、改善紫花苜蓿的品质，本试验结果与其基本一致。

植物的光合作用对生态系统的能量和物质循环有非常重要的作用，是作物产量和品质的决定性因素^［34］。叶绿素是植物光合作用不可或缺的物质^［35］，本研究发现，在25%的菌液添加下，F₂处理紫花苜蓿叶绿素含量最高；本研究还发现，与不添加菌液相比，添加25%、27.5%和30%菌液整体上均对紫花苜蓿叶片叶绿素含量有促进作用，其中添加25%菌液促进效果最明显。菌肥含水量过高或过低都会影响菌肥中有效活菌的数量，添加25%菌液较27.5%和30%菌液效果好的原因可能是添加25%菌液的菌肥中含水量更适合微生物存活。综合凹凸棒与菌液添加量分析发现，F₂+25%菌液处理下紫花苜蓿叶绿素含量最高，可能是由于该处理下菌肥有效活菌数高，促进了植物根系吸收周围土壤中的氮、磷等叶绿素合成所需要的关键营养元素，进而导致叶绿素含量增加。

4 结论

不同处理菌肥有效活菌数在保存180 d后均大于2×10⁸ cfu·g^-1，杂菌数均低于3×10⁶ cfu·g^-1，符合国家菌肥制作标准。其中F₂+25%菌液处理能够有效提高菌肥中的有效活菌数，通过对植物生长指标进行模糊隶属函数分析发现，该处理对紫花苜蓿的促生效果最好，可作为豆科植物紫花苜蓿的菌肥载体进一步推广应用。

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基金资助

甘肃农业大学科研启动经费(GAU-KYQD-2022-01)

“有机肥-土壤-牧草”中的传播机制研究(GAU-KYQD-2022-01)

基于科技小院的农业人才培养及草畜肥循环技术集成与示范资助