棘孢木霉bai5对紫花苜蓿根腐病病原菌的抑菌效果及其促生作用研究

Trichoderma asperellum bai5 inhibits root rot pathogens of alfalfa （Medicago sativa） and promotes alfalfa plant growth

摘要

为挖掘对紫花苜蓿根腐病致病菌具有抑制作用的有益菌株，本研究采用稀释分离法从白桦根围土壤中分离、获得1株真菌bai5，通过形态学和分子生物学鉴定，确定为棘孢木霉。以紫花苜蓿常见的7种根腐病病原菌（燕麦镰刀菌FAV-7、木贼镰刀菌FEQ-10、锐顶镰刀菌FAC-11、厚垣镰刀菌FCH-13、三线镰刀菌FTR-14、尖孢镰刀菌FOX-15、茄病镰刀菌FSO-16）为靶标菌，利用两点对峙法、固体稀释法、平板对扣法综合评估bai5菌株对病原菌的抑制作用，结果表明，在对峙培养下，bai5对7种病原菌的抑制率均大于69%；在发酵滤液抑菌试验中，bai5对FAC-11、FTR-14、FEQ-10、FCH-13、FAV-7和FSO-16的抑制率分别为63.14%、49.80%、40.78%、33.33%、16.08%、8.20%，而对FOX-15无抑制效果；棘孢木霉bai5的挥发性物质对FTR-14和FAC-11的抑制率分别高达74.51%、72.00%。通过对bai5菌株的生物学特性和促生特性分析，结果表明，棘孢木霉bai5生长速度快，不仅有较强的抗逆能力，还具有固氮和产纤维素酶能力。通过盆栽试验，测定棘孢木霉bai5对紫花苜蓿生长和生理指标的影响，结果表明，bai5能够显著提高紫花苜蓿的鲜重、地上部长、干重、叶绿素含量和可溶性糖含量。综上，棘孢木霉bai5是具有较高开发价值的生防真菌，可以抑制7种苜蓿根腐病菌生长并显著促进苜蓿生长。

Abstract

The aim of this work was to screen for fungal biocontrol strains with inhibitory effects on the pathogens causing root rot of alfalfa （Medicago sativa）. To this end， the fungal strain bai5 was isolated and obtained from the soil surrounding the roots of Betula platyphylla by the dilution isolation method. This strain was identified as Trichoderma asperellum through morphological and molecular biological identification methods. Seven common root rot pathogens of alfalfa （Fusarium avenaceum FAV-7， Fusarium equiseti FEQ-10， Fusarium acuminatum FAC-11， Fusarium chlamydosporum FCH-13， Fusarium tricinctum FTR-14， Fusarium oxysporum FOX-15， Fusarium solani FSO-16） were used as target pathogens， and the inhibitory effect of strain bai5 on these pathogens was comprehensively evaluated using the two-point standoff method， the solid dilution method， and the plate-pair buckling method. The inhibitory rate of strain bai5 against the seven fungal pathogens was higher than 69% in the standoff culture test. In the fermentation filtrate inhibition test， strain bai5 inhibited the growth of FAC-11， FTR-14， FEQ-10， FCH-13， FAV-7， and FSO-16 by 63.14%， 49.80%， 40.78%， 33.33%， 16.08%， and 8.20%， respectively， but it had no inhibitory effect on FOX-15. The volatile compounds of strain bai5 inhibited the growth of FTR-14 and FAC-11 by up to 74.51% and 72.00%， respectively. Analyses of the biological properties and growth-promoting characteristics of strain bai5 showed that it grows fast， is strongly stress resistant， and has nitrogen-fixation and cellulase-producing abilities. The effect of T. asperellum bai5 on the growth and physiological indexes of pot-grown alfalfa plants was determined. The results show that bai5 significantly increased the fresh weight， height of above-ground parts， dry weight， chlorophyll content， and soluble sugars content of alfalfa plants. In conclusion， T. asperellum bai5 can inhibit the growth of at least seven root rot fungi of alfalfa and significantly promote alfalfa plant growth. Therefore， it is a biocontrol fungus with high development potential.

Graphical abstract

关键词

棘孢木霉 / 分离鉴定 / 苜蓿根腐病 / 镰刀菌 / 抑菌效果 / 促生

Key words

Trichoderma asperellum / separation and identification / alfalfa root rot disease / Fusarium / antibacterial effect / promote growth

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种多年生豆科草本植物，富含蛋白质、膳食纤维、矿物质和维生素等营养物质^［1］。该植物也是优质牧草的重要来源，在世界范围内被广泛种植^［2］。此外，由于近年来饲料工业的发展促使苜蓿的种植和利用显著增加，对苜蓿的产量提出了更高的需求。然而，根腐病作为紫花苜蓿的常见病害，主要由镰刀属病原菌引起，普遍发生于我国主要苜蓿种植区，发病率达15%~40%，高峰时发病率可达92%，严重影响了苜蓿的产量和品质^［3］。患根腐病的植株前期生长缓慢，后期茎叶枯萎，根部维管束变褐，侧根大量腐烂死亡^［4］。目前，苜蓿根腐病的防治主要依靠化学药剂和选育抗病品种。然而，化学制剂对人体健康有害，长期使用不仅会造成土壤和水污染，还会诱导病原菌产生抗性，造成根腐病难以防控的后果^［5-6］；而选育抗病品种存在工作量大、周期长、成本投入大和抗病性退化等问题^［7］。因此，探索安全绿色的生防制剂来防治苜蓿根腐病是解决这一问题的有效手段之一，也是农业绿色可持续发展的有效保障^［8］。

木霉（Trichoderma spp.）是重要的植物病害生防真菌，几乎存在于所有环境（包括农业、林业、山地、草原和沙漠生态系统以及淡水和海水）中，并且可以在各种基质上迅速生长、产生大量孢子^［9］。还可以通过多种作用发挥生防潜能，如重寄生作用、抗生作用、竞争作用、抵抗逆境压力、增强植物抗氧化防御、改变生态条件和促进植物生长等^［10-12］。有研究表明，棘孢木霉（Trichoderma asperellum）M2对8种植物病原菌均具有良好的抑菌效果^［13］；棘孢木霉152-42不仅具有耐高温和高盐碱的特性，还能够显著降低草坪褐斑病和币斑病的发病程度^［14］；棘孢木霉CMT10不产吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid，IAA），但对草莓（Fragaria×ananassa）株高、根长、总鲜重、根鲜重、茎鲜重均有促进作用^［15］。因此，木霉菌在农业生产和环境保护等领域展现了巨大的应用前景。

镰刀菌作为引起苜蓿根腐病的一类优势菌，已报道的该病害致病镰刀菌有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、锐顶镰刀菌（Fusarium acuminatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）^［16-17］等。为挖掘对紫花苜蓿根腐病病原菌有抑菌效果及促进紫花苜蓿生长的木霉菌株，本研究以这7种镰刀菌为靶标菌，以白桦（Betula platyphylla）根围土壤中分离获得的棘孢木霉bai5为拮抗菌，测定bai5对供试病原的抑菌效果；明确棘孢木霉bai5的生物学特性以及对紫花苜蓿的促生作用，以期为高效的微生物杀菌剂、菌肥的研制、开发和合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试拮抗菌：从采自哈尔滨市东北林业大学实验林场和帽儿山实验林场的白桦根围土壤中分离获得1株棘孢木霉bai5。

供试病原菌：燕麦镰刀菌FAV-7、木贼镰刀菌FEQ-10、锐顶镰刀菌FAC-11、厚垣镰刀菌FCH-13、三线镰刀菌FTR-14、尖孢镰刀菌FOX-15、茄病镰刀菌FSO-16，均分离自宁夏回族自治区银川市地区苜蓿根腐病株，前期经过形态学和rDNA-ITS、β-tubulin基因扩增鉴定后保存于宁夏大学农学院分子生物学实验室。

供试培养基为马铃薯（Solanum tuberosum）琼脂培养基（potato dextrose agar medium，PDA）：200 g马铃薯，琼脂粉15 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL；马铃薯葡萄糖肉汤培养基（potato dextrose broth，PDB）：PDA培养基不加琼脂；无机磷酸三钙培养基：硫酸铵0.5 g、氯化钠0.2 g、磷酸三钙5 g、氯化钾0.2 g、硫酸锰0.03 g、硫酸亚铁0.03 g、葡萄糖10 g、七水硫酸镁0.03 g、酵母浸出粉20 g、琼脂20 g和纯水1000 mL；亚力山德罗夫培养基：磷酸氢二钠2 g、钾长石粉1 g、七水硫酸镁0.5 g、碳酸钙0.1 g、氯化铁0.05 g、蔗糖5 g、琼脂18~20 g和纯水1000 mL；羧甲基纤维素钠培养基：氯化钾0.5 g、七水硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸铵2 g、羧甲基纤维素钠10 g、琼脂15 g和纯水1000 mL；蛋白酶培养基：脱脂奶粉10 g、琼脂15 g和纯水1000 mL；孟加拉红培养基（rose bengal medium，RB）：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g、孟加拉红0.03 g、氯霉素0.1 g；阿须贝氏培养基：磷酸二氢钾0.2 g、硫酸镁0.2 g、氯化钠0.2 g、碳酸钙5 g、甘露醇10 g、硫酸钙0.1 g和嗜铁素检测培养基（chrome azurol S agar medium，CAS）：铬天青S 60.5 mg、十六烷基三甲基溴化铵72.9 mg、六水氯化铁2.645 mg、二水磷酸二氢钠295.25 mg、十二水磷酸氢二钠1213.5 mg、氯化铵125 mg、磷酸二氢钾37.5 mg、氯化钠62.5 mg、琼脂9000 mg，购自海博生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 bai5菌株的分离与形态鉴定

采用土壤稀释法分离纯化菌落^［18］。2018年10月，采集哈尔滨市东北林业大学实验林场和帽儿山实验林场的白桦根围土壤，将采集的根围土样装入无菌采样袋标记后带回实验室去除砂石、枝叶、细根等杂质后混匀，置于4 ℃冰箱保存待用。取1 g土壤置于含有无菌蒸馏水的10 mL无菌离心管中，在摇床上加入无菌研磨珠以180 r‧min^-1振摇1 h。用无菌蒸馏水将样品稀释10^-1至10^-5倍，并将不同浓度稀释液200 µL涂布于RB平板上，设置3个重复。在28 ℃下培养5 d后，将木霉菌落转移到新的PDA培养基中进行纯化，获得单一菌株后进行保存。

2024年7月，通过观察进行形态鉴定。将纯化的木霉bai5接种在PDA平板上，并在黑暗中于28 ℃倒置培养7 d。观察菌落的宏观形态，包括培养基表面正反两面的纹理和有无色素沉着等特征，并留存菌落的图像。使用光学显微镜（Olympus BX51，日本）观察显微形态，包括分生孢子和分生孢子梗。使用莱卡体式显微镜（SP5，德国）观察木霉菌株孢子簇的形态特征。依赖于前人研究^［18］中发现的木霉菌描述进行形态学鉴定。

1.2.2 bai5菌株的分子鉴定

打取直径为0.5 cm的真菌bai5菌饼5个，置于300 mL PDB培养基中于（28±2） ℃、180 r‧min^-1下摇培7 d获得发酵液，使用4层无菌纱布过滤获得菌丝体，并使用DNA提取试剂盒（OMEGA）提取总DNA。用超微量分光光度计（Simpli Nano，美国）检测DNA浓度后，以提取的DNA为模板，分别选择内转录间隔区（intemnal transcribed spacers， ITS）引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和翻译延伸因子1-α（translation elongation factor， tef 1-α）引物EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）/Tef1R（5′-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3′）进行PCR扩增。聚合酶链式反应（PCR）体系为20 μL：双蒸水（ddH₂O，7 μL）、正向引物（1 μL）、反向引物（1 μL）、DNA模板（1 μL），2×Taq Mix（10 µL）^［19］。PCR程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（38个循环）；72 ℃总延伸15 min。

采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，引物合成及测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。获得的序列在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和上海交通大学木霉菌菌种保藏管理中心（http：//mmit.china-cctc.org/action1.php）进行在线比对，基于ITS和TEF1-α基因序列在MEGA 11.0软件中使用最大似然法（maximum likelihood，ML）联合构建系统发育树，并使用chiplot（https：//www.chiplot.online/）对发育树进行优化，确定木霉bai5的分类地位。经鉴定后，将序列提交Genbank获得登录号。

1.2.3 棘孢木霉bai5的抑菌率测定

采用平板对峙法测定木霉菌对7种病原菌的拮抗作用^［20］。在距离PDA平板（直径9 cm）直径最外围相对应2点上分别接种病原菌和木霉菌菌饼（直径5 mm）各1片，置于28 ℃倒置暗培养，当对照病原菌菌落近乎长满平板时，记录对峙条件下木霉菌与病原菌菌落的生长半径及非对峙条件下对照菌落的生长半径，每个处理设置3个重复。

\mathrm{木霉}\mathrm{菌抑}\mathrm{菌率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{对照}\mathrm{病原}\mathrm{菌菌}\mathrm{落半}\mathrm{径}-\mathrm{对峙}\mathrm{培养}\mathrm{的病}\mathrm{原菌}\mathrm{菌落}\mathrm{半径})/\mathrm{对照}\mathrm{病原}\mathrm{菌菌}\mathrm{落半}\mathrm{径}\times \mathrm{100}

1.2.4 棘孢木霉bai5无菌发酵液的抑菌率测定

取5个直径为5 mm的木霉菌菌饼接种于300 mL PDB培养液中，28 ℃下180 r‧min^-1振荡培养，于培养第7 天将发酵液通过4层无菌纱布过滤去除大部分菌丝体，8000 r‧min^-1、4 ℃离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤3次，获得无菌发酵液置于4 ℃冰箱备用。采用固体稀释法，待灭菌PDA培养基冷却至55 ℃左右，将木霉菌无菌发酵液与培养基以1∶1混合倒取平板，打取直径为0.5 cm的病原菌菌饼接种于含棘孢木霉bai5无菌发酵液的PDA平板上，以PDB和PDA培养基1∶1混合的平板接种病原菌为对照，（28±2） ℃下培养至对照病原菌长满平板后测量各处理菌落直径，计算抑菌率^［21］。每个处理设置3个重复。

\mathrm{抑菌}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}-\mathrm{处理}\mathrm{菌落}\mathrm{直径})/\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}\times \mathrm{100}

1.2.5 棘孢木霉bai5挥发性产物抑菌作用测定

采用平板对扣法测定bai5菌株挥发性物质对7种病原菌的抑制效果^［22］。打取木霉菌和病原菌的菌饼（直径=5 mm）接入PDA平板中央，将接入病原菌的PDA培养基平板倒扣于接种有木霉菌的PDA平板上，以只接种病原菌而未接种木霉菌的倒扣平板为对照，于28 ℃恒温培养箱中培养，每个处理3个重复。待对照病原菌长满平板时测量菌落直径并计算抑菌率。抑菌率计算同1.2.4。

1.2.6 棘孢木霉bai5的生长速度和抗逆性测定

吸取棘孢木霉bai5孢子悬浮液（10⁷个‧mL^-1）2.5 μL接种到PDA平板边缘上静置10 min，然后用封口膜密封置于（28±2） ℃下黑暗培养，设置3个重复，并在72 h使用直尺测量菌落半径。

为了研究棘孢木霉bai5对贫瘠土和盐碱土等恶劣环境的耐受性，建立模拟恶劣环境的培养基测定木霉菌bai5抗逆性^［23］。打取直径0.5 cm的棘孢木霉bai5菌饼分别接种于不同营养（4、2、1、3/4、1/2、1/4、1/8、1/16、0倍营养）的PDA培养基、加入NaCl（2%、4%、6%、8%、10% NaCl）的PDA培养基和加入NaHCO₃（0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3% NaHCO₃）的PDA培养基进行营养胁迫、盐胁迫和碱胁迫，置于（28±2） ℃下黑暗培养40 h后测量菌落生长直径，每个处理3个重复。

1.2.7 棘孢木霉bai5促生特性测定

采用Salkowski比色法测定其产生长素（indole acetic acid，IAA）的能力^［24］；使用无机磷酸三钙培养基检测菌株产无机磷的能力^［25］；通过亚力山德罗夫培养基检测菌株解钾能力^［25］；采用CAS检测培养基对其产铁载体的能力进行定性检测^［26］；利用羧甲基纤维素钠培养基测定bai5产纤维素酶的能力^［26］；通过阿须贝氏培养基测定菌株固氮能力^［25］；使用蛋白酶培养基定性菌株bai5是否产蛋白酶^［27］。所有检测设置3次重复。

打取5个直径5 mm的棘孢木霉bai5菌饼置于300 mL PDB培养基中28 ℃、180 r·min^-1振荡培养7 d，使用4层无菌纱布过滤后在冷冻离心机（Sigma 3K，美国）4 ℃、10000 r·min^-1离心10 min获得上清液，取0.5 mL上清液加入等体积Salkowski比色液混合，分别以等量50 mg·L^-1标准品和空白培养基为阳性对照和阴性对照，室温避光显色30 min，观察颜色变化，若溶液颜色变红则表示产生IAA。打取直径为5 mm的T. asperellum bai5菌饼，分别接种于无机磷酸三钙培养基、亚力山德罗夫培养基、CAS检测培养基和蛋白酶培养基28 ℃培养7 d后观察是否有透明圈产生，透明圈越大则能力越强。取直径5 mm的bai5菌饼接种于羧甲基纤维素钠培养基28 ℃培养7 d后用1 g·L^-1刚果红染色30 min、1 mol·L^-1 NaCl溶液脱色处理30 min，观察水解圈情况。取直径5 mm的bai5菌饼接种于阿须贝氏培养基28 ℃培养7 d转接3次，观察生长情况。设置3个重复。

1.2.8 棘孢木霉bai5的促生效果

在PDA平板上培养7 d的棘孢木霉bai5使用无菌水洗脱，制备浓度为10⁷个·mL^-1的孢子悬浮液备用。

通过本实验室前期试验结果，选取产孢量最优的发酵配方（无菌水250%、葡萄糖4.87%、蛋白胨4.87%、磷酸二氢钠1.17%、葡萄枝条粉末100%）进行棘孢木霉bai5的固态发酵。使用宽12.5 cm×长23 cm×高15 cm的长方形盆加入500 g的葡萄枝条粉末、1.25 L无菌水、24.35 g葡萄糖、24.35 g蛋白胨、5.85 g磷酸二氢钠，加盖灭菌冷却至常温后在无菌条件下接种棘孢木霉bai5孢子悬浮液1 mL，于（28±2） ℃下发酵12 d后加入500 mL无菌水进行洗脱备用。

本试验于2024年8月在宁夏大学农学院植物病理学实验室内进行。将购自宁夏上古农牧业开发有限公司的“甘农三号”紫花苜蓿种子浸入75%乙醇5 min，1%次氯酸钠2 h，无菌水冲洗3次后种入等量无菌营养土的盆中，每盆放入20粒种子，设置处理组和对照组，处理组每盆加入棘孢木霉bai5固态发酵洗脱液500 mL，对照组则加入等量无菌水，每组3个重复。每10 d每盆浇500 mL无菌水，4 d时统计发芽率，在35 d后分析统计处理和对照苜蓿植株的鲜重、根长、地上部长、叶片数、发芽率、干重、叶绿素含量和可溶性糖含量，每组3次重复。取鲜草样放入105 ℃烘箱内杀青10 min，65 ℃烘干至恒重，称量干重；取0.1 g新鲜叶片浸泡于10 mL无水乙醇中，常温暗处理至叶片完全褪色，使用紫外分光光度计（L5S，中国）测定溶液在665和649 nm处的吸光值，按照下述公式计算叶绿素含量；通过可溶性糖试剂盒（Solarbio）测定叶片可溶性糖含量。

\mathrm{叶绿}\mathrm{素}\mathrm{a}\mathrm{含量}=(\mathrm{13.95}\times \mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{665}}-\mathrm{6.88}\times \mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{649}})/\mathrm{鲜重}

\mathrm{叶绿}\mathrm{素}\mathrm{b}\mathrm{含量}=(\mathrm{24.96}\times \mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{649}}-\mathrm{7.32}\times \mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{665}})/\mathrm{鲜重}

\mathrm{叶绿}\mathrm{素含}\mathrm{量}=\mathrm{叶绿}\mathrm{素}\mathrm{a}\mathrm{含量}+\mathrm{叶绿}\mathrm{素}\mathrm{b}\mathrm{含量}

1.3 数据分析

利用Excel 2021进行试验数据整理，运用SPSS 26.0进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法和独立样本t检验对数据进行差异显著性分析。采用OriginPro 2024作图，运用MEGA 11.0构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 bai5菌株的分离、培养和鉴定

采用稀释分离法在白桦根围土壤分离纯化获得单一真菌菌株bai5。该菌株在PDA培养基上生长迅速，气生菌丝在3 d内向四周辐射生长完全覆盖整个培养皿。菌落最初呈白色，但随后变为绿色和白绿色，大量产生绿色分生孢子（图1A）。显微镜下观察到整个分枝呈锥形，顶端有2~5个瓶梗，瓶梗为安培瓶状，中部膨大，末端为分生孢子。侧枝由主轴发出，与主轴成90º角，轮生（图1D）。分生孢子为球形或卵圆型，直径2~4 μm（图1F）。综上所述，初步鉴定bai5真菌菌株为木霉菌。

对木霉bai5的ITS区和tef 1-α区进行扩增和测序，将测序结果上传至NCBI，获得GenBank登录号分别为MK377313和PQ280304。基于ITS和tef 1-α基因序列构建的系统发育树显示，木霉bai5与棘孢木霉聚为一支，具有较高的同源性（图2）。因此，通过形态学特征和分子生物学分析，将bai5菌株鉴定为棘孢木霉。

2.2 棘孢木霉bai5对7种镰刀菌的抑制效果

采用双重培养法评价棘孢木霉bai5对燕麦镰刀菌FAV-7、木贼镰刀菌FEQ-10、锐顶镰刀菌FAC-11、厚垣镰刀菌FCH-13、三线镰刀菌FTR-14、尖孢镰刀菌FOX-15、茄病镰刀菌FSO-16的抗真菌效果（图3）。结果表明，棘孢木霉bai5可以迅速占领共有营养空间，对峙培养72 h时，与各个病原菌菌落边缘完全接触，可以抑制病原菌正常生长，随后，棘孢木霉bai5菌丝会进一步侵入病原菌菌落，并在病原菌菌落中开始产孢。棘孢木霉bai5对供试病原菌的径向菌丝生长均有抑制作用，对锐顶镰刀菌FAC-11的抑制率最高（85.49%），对三线镰刀菌FTR-14的抑制率次之（82.35%），其次是对尖孢镰刀菌（77.65%）和茄病镰刀菌（76.86%）的抑制率。相比之下，对厚垣镰刀菌FCH-13的抑制效果最差（69.41%）。

2.3 棘孢木霉bai5无菌发酵液对7种镰刀菌的抑菌效果

棘孢木霉bai5在PDB液体培养基中进行振荡发酵，过滤后获得无菌发酵滤液，采用十字交叉法测定次生代谢非挥发性产物对7种镰刀菌的抑制作用（图4）。除尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌外的5个病原菌生长状况与对照相比均有拮抗效果。这表明棘孢木霉bai5在生长过程的非挥发性次生代谢产物对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制效果不明显，而对其他5种镰刀菌均有不同程度的抑制作用。其对锐顶镰刀菌的抑制效果最好，抑制率为63.14%；对三线镰刀菌、木贼镰刀菌和厚垣镰刀菌的抑制率相对较高，分别为49.80%、40.78%和33.33%；对燕麦镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制率较低，均小于20%；而对尖孢镰刀菌无抑制效果。

2.4 棘孢木霉bai5挥发性物质对7种镰刀菌的抑制效果

棘孢木霉bai5的挥发性物质对供试7种病原菌均具有抑制作用，平均抑菌率为55.36%（图5）。其对三线镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制作用远大于木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，其中对三线镰刀菌和锐顶镰刀菌的抑制率分别高达74.51%、72.00%，而对木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制率仅为47.06%、40.00%和43.92%。

2.5 棘孢木霉bai5的生长速度和抗逆性能

棘孢木霉bai5在不同营养程度、盐浓度和碱浓度培养基中生长40 h后测量菌落直径（图6和图7）。结果表明，棘孢木霉bai5在4、2、1、1/2、1/4、3/4、1/8、1/16、0倍营养的PDA培养基上均能生长，大多数生长直径都可超过5 cm。在营养浓度过高时（2倍营养的PDA培养基），其生长并未受到显著影响，生长直径甚至更优。在4、3/4和1/2倍营养的PDA培养基上，棘孢木霉bai5的直径分别为6.50、6.67和6.67 cm。然而，在1/16倍营养的PDA培养基上，棘孢木霉bai5的直径最小，仅有4.50 cm，并且在1/16和0倍营养的PDA培养基上出现产孢量减少、菌丝稀少和菌落厚度变薄的情况。棘孢木霉bai5在盐浓度为2%、4%、6%、8%和10%的培养基上均能生长，但菌落直径相差较大。当培养基的盐浓度为2%时，菌落直径最大（8.5 cm）。当培养基的盐浓度为10%时，菌落直径最小（0.58 cm），棘孢木霉bai5可以以极为缓慢的速度生长。随着培养基盐浓度的增大，棘孢木霉bai5的生长直径越小，生长速度越缓慢。在碱浓度为0.1%、0.4%和0.7%的培养基中，棘孢木霉bai5可以生长，但是在碱浓度为0.7%培养基中生长极为缓慢。而在碱浓度为1.0%和1.3%的培养基中棘孢木霉bai5几乎无法生长。相比于不同营养和高盐环境，棘孢木霉bai5对高碱环境更为敏感。

将棘孢木霉bai5孢子悬浮液定量接种到PDA培养基上，72 h后测量菌落半径，结果表明，棘孢木霉bai5生长速度快，平均半径为6.23 cm（图7A）。

2.6 棘孢木霉bai5的促生作用

经过Salkowski比色法测定，bai5的液体颜色不变，说明bai5菌株不具有产IAA的能力（图8A）。棘孢木霉bai5在无机磷酸三钙培养基、亚力山德罗夫培养基、CAS检测培养基和蛋白酶培养基上不产生透明圈，表明其没有溶磷、解钾、产铁载体和产蛋白酶的能力（图8B~D和图8G）。但其可以在羧甲基纤维素钠培养基上产生水解圈（图8E），也可以在阿须贝氏培养基上转接3次生长菌丝并产孢（图8F），说明bai5菌株具有产纤维素酶和固氮能力。另外其可以在无机磷酸三钙培养基、亚力山德罗夫培养基、CAS检测培养基和蛋白酶培养基上生长，其中，在蛋白酶培养基上生长良好，产孢量较多（图8G）；在亚力山德罗夫培养基中菌丝生长稀疏，产孢有限，孢子呈点状分布（图8B）；在CAS检测培养基上生长缓慢（图8D）。

2.7 棘孢木霉bai5对紫花苜蓿的促生效果

将灭菌的紫花苜蓿种子分别种植于棘孢木霉bai5处理和无菌水对照的盆中4 d统计发现，处理组和对照组的发芽率无显著差异。在苜蓿生长35 d后观察发现，与对照组相比，处理组的苜蓿鲜重、地上部长、干重、叶绿素含量和可溶性糖含量均显著增加，并且处理组侧根数量多于对照组，但是两组的根长和叶片数量未见显著变化（图9，表1）。此外，苜蓿植株的鲜重、地上部长、干重、叶绿素含量和可溶性糖含量的增长率分别为28.00%、28.87%、66.67%、32.51%和30.77%。

3 讨论

木霉存在于多种生态系统中，是防治植物病害的重要生防菌种，对多种植物病原菌具有显著抑制作用。薛德星等^［28］研究发现棘孢木霉GT30对大蒜白斑病菌（Stemphylium eturmiunum）和葡萄炭疽病菌（Colletotrichum truncatum）抑菌率分别为63.7%和61.4%。李佳昕等^［29］从分离的木霉菌中筛选出1株棘孢木霉GH-20，其对齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）抑菌率高达89.93%。本研究从哈尔滨白桦根围土壤中经过分离纯化获得一株木霉bai5，结合形态学和分子生物学鉴定，确定菌株bai5为棘孢木霉。对峙试验结果发现该菌株对苜蓿根腐病病原菌具有优良的抑制效果，抑菌谱较广，生长速度远快于各种靶标菌，可以显著压缩和挤占对方生存空间，与前人研究结果一致。此外，bai5在4、2、1、1/2、1/4、3/4、1/8、1/16、0倍营养程度和2%、4%、6%、8%以及10%盐浓度的培养基上均能生长，表现出较强的适应能力，因此具有在恶劣土壤环境下防治植物病害的潜力。

本研究结果表明，棘孢木霉bai5挥发性代谢产物对三线镰刀菌的抑制作用最强，抑制率为74.51%。相反，对尖孢镰刀菌的抑菌效果最低，仅为40%，而非挥发性代谢产物对锐顶镰刀菌的抑制效果最好，抑制率为63.14%。木霉拮抗作用涉及多种因素，挥发性代谢物的抑菌率与非挥发性代谢物的抑菌率不一定相关，与Ma等^［30］的研究结果一致。Amin等^［31］先前的研究表明，木霉衍生的挥发性有机化合物会抑制包括尖孢镰刀菌、芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）在内多种致病真菌的菌丝生长。陶玲芸等^［32］通过顶空固相微萃取气质联用法测定出棘孢木霉ZJSX5003和GDFS1009中挥发性次级代谢产物主要是醇类和酮类，进一步通体外抑菌试验表明过6-正戊基-2H-吡喃-2-酮（6-PAP）具有较好的抑制尖孢镰孢菌的效果。而本研究的木霉bai5菌株也产生抗真菌代谢物，可以抑制病原菌菌丝生长。为了获得更深入的了解，需要进一步的研究来分离和纯化挥发性代谢产物中存在的单个成分，并评估这些代谢物所表现出的抗真菌谱。郑传奇等^［33］研究发现钩状木霉发酵液的发酵时间在15和9 d时对薏苡黑粉菌（Ustilago coicis）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）的抑菌率相比于7 d时高，表明钩状木霉无菌发酵滤液的抑菌效果与发酵时间相关，不同发酵时间无菌发酵滤液的抑菌效果有显著差异。本研究中使用棘孢木霉bai5同一时间的无菌发酵滤液对部分靶标病原菌进行抑菌试验，结果发现bai5菌株对部分靶标病原菌抑制率低，根据前人研究发现，后续可对该菌株不同发酵时间无菌发酵滤液的抑菌效果进行测定，明确其非挥发性代谢产物最大抑菌效果的最佳发酵时间。

有研究发现，棘孢木霉表现出溶磷、产IAA和产铁载体能力^［34］。Li等^［35］研究发现棘孢木霉CHF78具有溶解Ca₃（PO₄）₂的能力并产生纤维素酶、铁载体、IAA、蛋白酶和几丁质酶，促进番茄（Solanum lycopersicum）植株的生长。本研究结果显示棘孢木霉bai5具有产纤维素酶和固氮能力，而没有产蛋白酶、产铁载体、溶磷和解钾能力，这与张晓梦等^［13］研究发现棘孢木霉M2具有产纤维素酶、蛋白酶、铁载体和溶磷能力的结果不同，说明棘孢木霉促生因子具有种间差异。姚晨虓等^［36］研究表明棘孢木霉Ta-0101有一定的促生能力和水解酶活性，可以使烟草（Nicotiana tabacum）植株最大叶面积增加56.55%，地上部鲜重提高136.69%，根系鲜重提高140.28%。本研究定性测定了棘孢木霉bai5的促生能力，发现该菌能促进紫花苜蓿的植株生长，但对其根长、叶片数量和发芽率并无显著促进效果，可能是由于bai5的洗脱液浓度并非最适浓度，后续可增加和减少洗脱液的孢子量，分析对植株生长的影响变化，寻找促进紫花苜蓿生长最适的孢子浓度。

4 结论

从哈尔滨市白桦根围土壤分离得到棘孢木霉bai5对包括燕麦镰刀菌FAV-7、木贼镰刀菌FEQ-10、锐顶镰刀菌FAC-11、厚垣镰刀菌FCH-13、三线镰刀菌FTR-14、尖孢镰刀菌FOX-15、茄病镰刀菌FSO-16在内的7种病原菌均有抑制作用，抑菌谱广，尤其是对锐顶镰刀菌FAC-11的综合抑制效果最好。棘孢木霉bai5的生长速率快，生防机制是以竞争作用为主，抗生作用为辅。在模拟贫瘠土和盐碱土等恶劣环境的培养基上，棘孢木霉bai5在不同营养程度和盐胁迫的培养基上生长良好，但对于碱性环境较为敏感，整体抗逆能力较强，可以在不良环境下生长，同时还可以促进紫花苜蓿的生长。综上所述，棘孢木霉bai5具有开发为生防菌剂的潜力。

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基金资助

宁夏重点研发计划项目(2023BCF01026-04)

高等学校科学研究项目(NYG-2024-029)