紫花苜蓿MsNAC053基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

Cloning of MsNAC053 from alfalfa and analysis of its transcript profile in response to abiotic stresses

摘要

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2）转录因子是植物特有的转录因子，在调控植物生长发育、激素信号转导及胁迫响应等过程中发挥重要作用。紫花苜蓿是世界范围内重要的豆科牧草之一，营养丰富，品质优良。为探究紫花苜蓿NAC053基因功能，利用SnapGene及NCBI设计特异性引物并利用PCR技术克隆MsNAC053基因，利用生物信息学软件分析其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位情况等，并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析MsNAC053基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式及对不同非生物胁迫的响应情况，利用农杆菌介导法将DNA酶切及连接构建的亚细胞定位载体导入烟草叶片进行亚细胞定位。结果表明：MsNAC053基因编码区全长903 bp，编码300个氨基酸，其蛋白相对分子量为34.62 kDa，脂溶指数为73.82，理论等电点为7.05，平均亲水性为-0.604，不稳定系数为47.28，为不稳定的亲水性蛋白，不具备跨膜结构，具有响应冷胁迫及脱落酸等的顺式作用元件。亚细胞定位结果显示其定位于细胞核中，系统进化树和氨基酸序列分析表明MsNAC053与蒺藜苜蓿、长柔毛野豌豆等豆科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明，MsNAC053基因表达具有组织特异性，在幼叶中表达量最高，在子叶中表达量最低；干旱、盐及脱落酸（ABA）处理均能诱导MsNAC053基因的表达，表明MsNAC053基因参与紫花苜蓿应对干旱、盐胁迫响应。本研究为紫花苜蓿抗逆分子育种提供了理论依据及候选基因。

Abstract

The NAC （NAM， ATAF1/2， CUC1/2） transcription factors are plant-specific regulators that play critical roles in plant growth and development， hormone signaling， and stress responses. Alfalfa （Medicago sativa）， one of the most important leguminous forage crops worldwide， is renowned for its high nutritional value and quality. To investigate the function of the MsNAC053 gene in alfalfa， specific primers were designed using SnapGene and NCBI to clone MsNAC053 through polymerase chain reaction （PCR） technology. The physicochemical properties， secondary structure， and subcellular localization of the protein were analyzed through bioinformatics tools. And the tissue-specific expression patterns of MsNAC053 and its responses to abiotic stresses were analyzed through quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. The subcellular localization analysis were conducted by introducing vector into tobacco （Nicotianatabacum） leaves via Agrobacterium-mediated transformation. The results showed that the coding region of MsNAC053 was 903 bp， encoding 300 amino acids， with a predicted molecular weight of 34.62 kDa， an aliphatic index of 73.82， a theoretical isoelectric point （pI） of 7.05， a grand average hydropathicity of -0.604， and an instability coefficient of 47.28， categorizing it as an unstable hydrophilic protein without transmembrane regions. Cis-acting elements responsive to low-temperature （LTR） and abscisic acid responsiveness （ABRE） were identified. Subcellular localization confirmed that MsNAC053 was localized in nucleus. Phylogenetic and amino acid sequence analyses revealed close evolutionary relationships between MsNAC053 and other NAC proteins from leguminous species such as Medicago truncatula and Vicia villosa. qRT-PCR demonstrated tissue-specific expression of MsNAC053， with the highest expression level in young leaves and the lowest expression level in cotyledons. Drought， salt， and ABA treatments significantly upregulated the expression level of MsNAC053， indicating that it plays a role in response to drought and salt stresses. In summary， the results of this study provides both theoretical insights and a candidate gene for molecular breeding of stress-resistant alfalfa varieties.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / NAC转录因子 / 基因克隆 / 表达分析 / 非生物胁迫

Key words

alfalfa / NAC transcription factor / gene cloning / expression analysis / abiotic stress

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科苜蓿属多年生草本植物，是世界范围内种植面积最广的豆科牧草，其营养价值丰富，草质优良，适口性好，是优良的高蛋白饲草，在畜牧业生产中具有重要地位^［1-2］。紫花苜蓿在生态修复中也发挥一定作用，大面积种植紫花苜蓿能够改良土壤、调节气候和改善农业生产及生态环境。在紫花苜蓿生产过程中如果受到高温、寒冷、盐及干旱等非生物胁迫，容易导致饲草品质降低、产量下降，加剧草畜平衡矛盾，制约畜牧业可持续发展。因此，利用分子育种技术筛选抗逆性强、产量高、营养价值高、适口性好的优良紫花苜蓿新品种对于扩大紫花苜蓿栽培面积，促进我国草牧业发展具有重要意义。

NAC转录因子是高等植物特有的转录因子，因其所编码的蛋白在N端有一段150 bp左右被称NAC结构域的NAM保守序列而得名^［3］。NAC转录因子在调控植物生长发育及胁迫响应过程中具有重要作用，如调控顶端分生组织的形成^［4］、果实的成熟^［5］和增强植物对干旱、寒冷及盐碱等非生物胁迫及病虫害等生物胁迫的抗性^［6-8］等。目前，NAC转录因子的功能在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）^［9］、大豆（Glycine max）^［10］、拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［11］等多种模式植物中报道。研究发现，短日照条件下，拟南芥ATAF1基因直接靶向调控下胚轴伸长的关键转录因子AtCDF1、AtCDF5且抑制其表达，负调控光敏色素互作因子AtPIF表达，导致拟南芥下胚轴缩短^［11］。草莓（Fragaria×ananassa）FaRIF是果实发育前期成熟的关键调控因子，通过控制脱落酸（abscisic acid，ABA）生物合成及信号传导、细胞壁的降解及修复等途径调控果实软化、色素和糖积累等相关过程^［5］。水稻（Oryzasativa）OsNAC2基因可以直接与OsLEA3及OsSAPK1的启动子区域特异性结合，通过脱落酸信号途径调控水稻对干旱及盐胁迫的抗性^［12］。干旱条件下过表达甘蓝（Brassica oleracea）BoNAC19基因的拟南芥植株中抗氧化酶和花青素含量降低，活性氧积累量增多^［13］。Zhang等^［14］在黄麻（Corchorus capsularis）中过表达黄麻CcNAC1基因，转基因植株中3-酮酯酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）基因相对表达量升高，转基因植株提前开花，抗旱性增强。在拟南芥中过表达玉米（Zea mays）ZmNAC074基因可以增强转基因植株对干旱和盐胁迫的耐受性^［7］。在紫花苜蓿中过表达MsNAC047基因提高了转基因植株对盐碱胁迫的抗性^［15］。

前期研究分析紫花苜蓿MsNAC转录因子家族挖掘到对干旱、盐胁迫响应较强的MsNAC053等候选转录因子。因此，本研究根据已有的紫花苜蓿转录组数据库中NAC053转录本序列，在紫花苜蓿中克隆MsNAC053基因，并利用生物信息学软件对紫花苜蓿MsNAC053基因编码的蛋白质进行分析，同时分析MsNAC053基因的组织特异性表达模式及对不同非生物胁迫的响应情况，为紫花苜蓿NAC基因研究及后续利用分子育种技术培育抗逆的紫花苜蓿新种质创造理论条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2024年3-9月在山西农业大学草业学院开展。选取颗粒饱满、大小一致的‘中苜1号’紫花苜蓿种子种植于营养土∶蛭石=1∶1的混合基质中，置于光照培养箱培养，培养条件：相对湿度为60%，昼夜温度均为25 ℃，日照条件为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 MsNAC053基因克隆

在已发表的紫花苜蓿转录组数据库中找到MsNAC053转录本序列，在‘中苜1号’紫花苜蓿基因组数据库进行比对，得到MsNAC053基因的目的序列。利用SnapGene及NCBI Primer-Blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）及Primer 6.0进行引物设计及引物特异性检验^［16］，引物序列见表1。利用RNA提取试剂盒（0416-50，北京华越洋生物科技有限公司）提取‘中苜1号’紫花苜蓿总RNA，并利用Nanodrop 2000对提取的RNA进行浓度及完整性检测，使用PrimerScript^TMRT reagent kit with gDNA Eraser（Code No. RR047A， TakaRa）将RNA反转录合成cDNA，并以此cDNA为模板，利用Tks高保真酶进行PCR扩增，PCR反应体系参考说明书。PCR扩增程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；30个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段胶回收后连接克隆载体pTOPO001，并转入大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定后送至生工生物工程有限公司（上海）进行测序。

1.3 生物信息学分析

对紫花苜蓿MsNAC053基因及其编码蛋白进行生物信息学预测，表2为生物信息学预测分析所用软件及网址。

1.4 MsNAC053亚细胞定位分析

以含MsNAC053基因的质粒为模板，利用无缝克隆技术构建以pBWA（V）HS为骨架的35S：：MsNAC053-GFP表达载体，35S：：GFP为空白对照载体，分别转化到农杆菌GV3101中，注射一月龄烟草（Nicotianatabacum）叶片后暗培养48 h，在共聚焦显微镜（Leica STELLARIS 5，德国）下观察烟草叶片中GFP荧光信号的分布情况，确定目的基因表达部位。

1.5 MsNAC053基因表达模式分析

试验选取4周龄‘中苜1号’紫花苜蓿幼苗，将其转移至1/2 Hoagland营养液培养48 h后分别进行干旱（15% PEG-6000）、盐胁迫（250 mmol·L^-1 NaCl）和脱落酸（abscisic acid，ABA，100 μmol·L^-1）处理，分别在处理0、2、4、8、12、24和48 h时取相同部位的叶片，置于液氮速冻处理后转移至-80 ℃冰箱保存备用，每个处理设置3次生物学重复，分析MsNAC053基因对干旱胁迫、盐胁迫和ABA处理的响应情况。取4周龄‘中苜1号’紫花苜蓿幼茎（从顶端数第1~2节间）、老茎（从基部数第2~3节间）、幼叶（从顶端数第2~3枚完全展开叶）、老叶（从顶端数第9片叶）、花、种子萌发后的子叶和真叶（种子萌发长出的第一片真叶）为材料进行组织特异性表达分析，每个部位3次生物学重复。提取各样品RNA，将其反转录成cDNA后为模板，利用特异性引物qNAC053-F/qNAC053-R进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应，以紫花苜蓿MsACTIN为内参基因，使用TakaRa RR420Q定量PCR试剂盒（日本）进行qRT-PCR反应，反应程序按照说明书设置，相对表达量以2^-ΔΔCt法^［12］计算。

1.6 数据处理及分析

利用Excel 2019和GraphPad Prism 10.0处理数据和制作图表，用SPSS 23.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 MsNAC053基因的克隆与序列分析

以紫花苜蓿cDNA为模板进行PCR扩增，获得大小约900 bp的条带，与‘中苜1号’基因组及转录本数据预测MsNAC053基因片段长度相近（图1）。测序结果表明，实际扩增片段长度为903 bp，编码300个氨基酸（图2）。结合前期研究基础，发现该基因定位于紫花苜蓿染色体第53顺位，因此将其命名为MsNAC053^［16］。

2.2 MsNAC053生物信息学分析

对MsNAC053基因编码的蛋白质进行理化性质分析，结果表明，MsNAC053蛋白分子式为C₁₅₄₇H₂₄₁₆N₄₁₆ O₄₅₈S₁₄，相对分子质量为34.62 kDa，脂溶指数为73.82，理论等电点（theoretical protein isoelectric，pI）为7.05^［16］，带负电荷精氨酸和赖氨酸残基（arginine+lysine，Arg+Lys）有39个，带正电荷天冬氨酸和谷氨酸残基（asparticacid+glutamicacid，Asp+Glu）39个，其中含量最高的氨基酸为亮氨酸（leucine，Leu），占9.0%，其次为赖氨酸（lysine，Lys），占8.3%，丝氨酸（serine，Ser）占7.3%，谷氨酸（glutamicacid，Glu）占7.0%，具体见表3。MsNAC053蛋白平均亲水性为-0.604，不稳定系数为47.28，表明MsNAC053为不稳定的亲水性蛋白。利用SMART及NCBI-conserved domain预测紫花苜蓿MsNAC053蛋白保守结构域，发现其包含NAM超家族结构域，属于NAC家族（图3A）。对MsNAC053蛋白进行跨膜结构预测分析，发现MsNAC053蛋白不存在跨膜结构域，没有跨膜转运功能（图3B）。利用ExPasy在线软件对MsNAC053蛋白进行亲疏水性分析，发现第88、89位天冬氨酸、精氨酸和第213位亮氨酸的亲水性和疏水性预测值分别为-2.589和1.378（图3C），因此推测MsNAC053蛋白应为亲水性蛋白。利用NetPhos 3.1和NetGlycate 1.0在线软件预测MsNAC053蛋白的磷酸化位点和糖基化位点，结果表明，MsNAC053蛋白含有16个丝氨酸（serine，Ser）位点，11个苏氨酸（threonine，Thr）位点，3个酪氨酸（tyrosine，Tyr）位点以及2个糖基化位点（图3D，E）。利用SignalP 5.0对MsNAC053蛋白进行信号肽预测分析，发现MsNAC053蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白（图3F）。MsNAC053蛋白二级结构预测分析表明，该蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成，其中无规则卷曲和α-螺旋结构分别占58.80%和25.91%（图3G）。利用Swiss-Model在线软件预测MsNAC053蛋白的三级结构，发现其与大豆GmNAC6蛋白三级结构相似，相似度为84.3%（图3H，I）。

2.3 NAC053系统进化分析

利用MEGA 6.0与Evolview将MsNAC053蛋白与在NCBI-blast上比对到的其他物种NAC蛋白序列构建系统进化树（图4），其中包括蒺藜苜蓿MtNAC6（XP_003607287.1），长柔毛野豌豆VvNAC6（XP_058735158.1），豌豆PsNAC6（XP_050898103.1），鹰嘴豆CaNAC6（ACS94039.1），红车轴草TpNAC6（XP_045825358.1），白车轴草TrNAC6（WJX44999.1），百脉根LjNAC6（XP_057456729.1），相思子ApNAC22（XP_027361228.1），毒羊豆GbNAC6（XP_061362427.1），野大豆GsNAC22（XP_028186389.1），大豆GmNAC6（NP_001236900.2），密花豆SsNAC94（TKY67790.1），刺毛黧豆MpNAC35（RDX62130.1），木豆CcNAC22（XP_020214708.1），绿豆VrNAC35（XP_014493331.1），赤豆VaNAC6（XP_017432427.1），豇豆VuNAC22（XP_027909063.1），蔓花生AiNAC32（XP_016187883.1），结果表明，紫花苜蓿MsNAC053与蒺藜苜蓿MtNAC6的同源性最高，其次为长柔毛野豌豆VvNAC6和豌豆PsNAC6。将紫花苜蓿MsNAC053的氨基酸序列与其他几种双子叶植物的NAC氨基酸序列进行同源比对，发现不同物种NAC氨基酸序列在N端都拥有5个保守的亚结构域，即NAM结构域（图5），说明紫花苜蓿MsNAC053蛋白属于NAC转录因子家族，并且与豆科植物NAC蛋白序列同源性更高，亲缘关系更近。

2.4 MsNAC053启动子顺式作用元件及基因结构分析

利用PlantCARE及TBtools对MsNAC053进行启动子区域顺式作用元件预测及基因结构分析，MsNAC053启动子区域含有大量的顺式作用元件（图6），如CAAT-box、ARE、LTR、ABRE和GT1-motif等，其中LTR元件与低温响应有关，GT1-motif是光响应元件，CGTCA-motif是茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）响应元件，ABRE则与脱落酸响应相关，表明MsNAC053可能在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。MsNAC053基因共含有3个外显子及2个内含子，全长2650 bp，编码区全长903 bp（图7）。

2.5 紫花苜蓿MsNAC053亚细胞定位分析

利用Cell-Ploc 2.0对MsNAC053编码的蛋白质进行亚细胞定位预测分析，结果显示其可能定位于细胞核中。为进一步确认MsNAC053在细胞中的定位情况，构建35S：：MsNAC053-GFP表达载体，将其注射至一月龄烟草叶片中暗培养48 h后，利用共聚焦显微镜进行观察，发现35S：：MsNAC053-GFP表达载体荧光信号分布在细胞核中（图8），35S：：GFP载体荧光信号散布在整个细胞中，说明MsNAC053蛋白在细胞核中表达，可能在细胞核中发挥相应功能，与Cell-Ploc 2.0预测结果一致。

2.6 MsNAC053基因表达模式分析

利用PEG-6000、NaCl及ABA分别对紫花苜蓿幼苗进行处理，结果显示PEG-6000模拟干旱胁迫下，MsNAC053基因相对表达量随处理时间的延长呈升高的趋势，在4 h时达到峰值，为0 h的18.86倍（图9）；在NaCl模拟盐胁迫下，随着胁迫处理时间的延长，MsNAC053基因表达量呈先上升后下降再上升的趋势，在12 h表达量达到峰值，为0 h的68.85倍；在脱落酸（ABA）处理下，MsNAC053基因表达趋势与盐胁迫类似，随着处理时间的延长，MsNAC053基因表达量呈先上升后下降再上升的趋势，在12 h时MsNAC053基因表达量最高，为0 h的24.81倍。以上结果表明，MsNAC053基因参与紫花苜蓿响应干旱、盐胁迫及脱落酸（ABA）处理，表明MsNAC053基因可能在调控紫花苜蓿响应干旱、盐等非生物胁迫中发挥重要作用。另外，组织特异性表达模式分析结果表明MsNAC053基因在紫花苜蓿幼叶中表达量最高，其次为顶芽和老叶，在子叶中表达量最低。

3 讨论

NAC作为陆生植物特有的转录因子，在调控植物生长发育、激素信号转导及胁迫响应中发挥重要作用。目前，已在大量植物中鉴定到NAC基因，如紫花苜蓿^［16］、拟南芥^［11］、小麦（Triticum aestivum）^［17］、辣椒（Capsicum annuum）^［18］等。前期在紫花苜蓿基因组中分析NAC转录因子家族，挖掘到对干旱、盐胁迫响应较强的MsNAC053等候选转录因子基因，因其在紫花苜蓿染色体上排在第53顺位，因此将其命名为MsNAC053^［16］。但在序列相似性比对过程中，发现它与大豆、蒺藜苜蓿等的NAC6相似性较高，这可能与基因在不同植物中的命名方式不同相关。

3.1 MsNAC053的生物信息学鉴定

本研究从紫花苜蓿中克隆出MsNAC053基因，其编码序列全长903 bp，共编码300个氨基酸，与蒺藜苜蓿、长柔毛野豌豆等豆科植物的NAC6序列相似性较高，都拥有NAM结构域，因此，推测MsNAC053基因属于NAC基因家族，发挥NAC基因的生物学功能^［19］。本研究发现，MsNAC053基因由3个外显子及2个内含子构成，Li等^［20］在向日葵（Helianthus annuus）中也发现了大多数HaNACs基因拥有3个外显子及2个内含子，说明NAC基因在不同物种中相对保守。同时，MsNAC053启动子区域存在低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE及赤霉素（gibberellins，GA）响应元件GARE-motif等激素及胁迫响应元件，暗示MsNAC053可能参与低温胁迫及这些激素的调控过程，利用qRT-PCR验证发现，紫花苜蓿MsNAC053响应脱落酸（ABA）处理，表达量显著高于对照。赤霉素及脱落酸（ABA）能够调控植物生长发育与胁迫响应，Zhou等^［21］发现紫花苜蓿MsNAC51基因启动子区域含有ABRE、GA元件，说明紫花苜蓿MsNAC51基因可能响应ABA、GA调控过程，干旱胁迫下MsNAC51基因相对表达量随处理时间上调，本研究结果与此一致，水稻OsNAC3基因启动子区域也含有ABRE元件，本研究结果与OsNAC3基因在ABA处理下表达模式一致^［9］。因此，推测MsNAC053基因也可能通过ABA信号转导途径在紫花苜蓿响应干旱及盐胁迫过程中发挥作用。现已鉴定到大豆GmNA-C6^［10］、棉花（Gossypium spp.）GhirNAC2^［22］蛋白定位于细胞核中，本研究结果与此一致，表明MsNAC053蛋白主要在细胞核中发挥相应功能。

3.2 MsNAC053基因响应干旱、盐等非生物胁迫

干旱、盐碱是限制我国草业发展的主要因素，紫花苜蓿作为我国最重要的豆科牧草之一，挖掘抗旱相关基因，并利用分子生物学手段选育抗旱耐盐的紫花苜蓿新品种对于促进草牧业发展具有重要作用。据报道，NAC基因对不同非生物胁迫有响应。本研究对紫花苜蓿进行干旱及盐胁迫处理，发现MsNAC053基因表达量随胁迫时间延长总体呈上升趋势，与甘蓝BoNAC019^［13］在盐胁迫下的表达模式相似。另外，工业大麻（Cannabis sativa）CsNAC062^［23］在干旱胁迫下相对表达量显著上调，本研究结果与此一致。在脱落酸（ABA）处理下，拟南芥ANAC103基因^［24］和油茶（Camellia sinensis）CsNAC9基因^［25］相对表达量随处理时间的延长而升高，与MsNAC053基因在脱落酸（ABA）处理下表达模式一致。黄花菜（Hemerocallis citrina）HcNAC35基因受干旱、盐胁迫调控，过表达HcNAC35转基因西瓜（Citrulluslanatus）耐盐性明显优于野生型西瓜^［26］。酵母杂交试验发现卷丹（Liliumlancifolium）LlNAC2基因与LlDREB1及LlZFHD4存在相互作用并对脱落酸（ABA）敏感，转基因拟南芥对寒冷、干旱、盐胁迫耐受性增强^［27］。水稻OsNAC15与OsNCED1、OsNCED2和OsNCED5的启动子相互作用，促进水稻九顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）合成从而催化脱落酸（ABA）合成，增强水稻的抗旱性及耐盐性^［28］。同时脱落酸（ABA）处理下MsNAC053基因表达模式与盐胁迫处理下的表达模式相似，推测紫花苜蓿MsNAC053可能结合下游脱落酸（ABA）合成关键基因的启动子，催化合成脱落酸（ABA），调控紫花苜蓿抗旱性及耐盐性。MsNAC053基因具有组织特异性，该基因在紫花苜蓿幼叶中表达量最高，其次为顶芽和老叶，在子叶中表达量最低，该结果与黄花苜蓿（Medicagofalcata）MfNAC63^［29］、山荆子（Malus baccata）MbNAC25^［6］的组织特异性表达情况基本一致，均在幼叶中表达量最高，在茎中表达量相对较低，说明紫花苜蓿MsNAC053基因可能在紫花苜蓿不同部位发挥不同的调控作用。本研究为后续深入研究MsNAC053基因功能提供了理论依据，为紫花苜蓿抗逆新种质创制奠定了基础。

4 结论

本研究克隆了紫花苜蓿MsNAC053基因，共编码300个氨基酸，是不稳定亲水碱性蛋白，含NAM保守结构域，不具备跨膜结构，属NAC基因家族。蛋白亚细胞定位于细胞核，具有响应脱落酸和茉莉酸甲酯等的顺式作用元件ABRE、CGTCA-motif。MsNAC053在幼叶中表达量最高，在子叶中表达量最低。MsNAC053基因与蒺藜苜蓿MtNAC6亲缘关系最近。MsNAC053基因对紫花苜蓿应对干旱、盐胁迫和脱落酸处理均有响应，表明MsNAC053基因可能是紫花苜蓿抗逆育种的关键候选基因。

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基金资助

国家自然科学基金(32071872)

国家自然科学基金(31402131)

山西省中央引导地方科技发展资金项目(YDZJSX2022B006)

山西重点研发计划课题(202102140601006-3)

山西农业大学博士科研启动专项(2021BQ01)