紫花苜蓿MsMYB86基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

Cloning of alfalfa MsMYB86 and analysis of its transcriptional response to abiotic stress

摘要

紫花苜蓿作为营养价值高、适应性强的优质饲草，在草业生产中占据重要地位。MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育、次生代谢以及对生物和非生物胁迫的响应中发挥关键作用。本试验以紫花苜蓿为研究对象，通过对MsMYB86基因进行克隆，利用ExPASy、Prabi以及SMART等在线网站和软件对MsMYB86基因编码蛋白的序列特性进行分析，包括相对分子质量、蛋白二级结构预测以及识别蛋白结合域等。采用RT-qPCR技术对MsMYB86基因的组织表达特异性及对不同非生物胁迫的响应情况进行分析。结果显示：MsMYB86基因全长为1104 bp，编码367个氨基酸。该蛋白质的相对分子质量为41.27 kDa，理论等电点（pI）为7.10，脂肪指数高达65.61，显示出明显的亲水性。MsMYB86蛋白质包含两个高度保守的SANT-MYB结构域，且主要定位于细胞核内。MsMYB86基因表达存在组织特异性，且在老茎中的表达水平显著高于其他组织。干旱、盐胁迫以及脱落酸处理下MsMYB86基因均表现出显著的响应性，推测其可能在调控紫花苜蓿对非生物胁迫的响应中发挥作用。研究结果可为阐释MsMYB86基因调控紫花苜蓿非生物胁迫响应机制提供理论基础。

Abstract

Alfalfa （Medicago sativa） occupies a prominent position in forage production as a high-quality forage with excellent nutritional value and wide adaptability. The MYB family is one of the largest families of transcription factors in plants， and its members play crucial roles in plant growth and development， secondary metabolism， and responses to biotic and abiotic stresses. In this study， MsMYB86 was cloned from alfalfa and its putative encoded protein was analyzed using online websites and software such as ExPASy， Prabi， and SMART. These analyses predicted the relative molecular mass， protein secondary structure， and protein-binding domains of the putative MYB86 protein. Tissue-specific transcript profiles of MsMYB86 and its transcriptional response to different abiotic stresses were analyzed by real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The results showed that the full-length MsMYB86 coding sequence was 1104 bp long， encoding a polypeptide of 367 amino acids. The protein was predicted to have a relative molecular mass of 41.27 kDa， an isoelectric point of 7.10， and a high lipid index of 65.61， indicating that it is a hydrophilic protein. The MsMYB86 protein was predicted to contain two highly conserved SANT-MYB structural domains and to localize in the nucleus. We detected tissue-specific transcript profiles of MsMYB86， and its transcript levels were significantly higher in mature stems than in other tissues. Transcription of the MsMYB86 gene was responsive to drought， salt stress， and abscisic acid treatment， suggesting that it plays a role in the alfalfa response to abiotic stresses. The results of this study provide a theoretical basis for further studies on the role of MsMYB86 in regulating the abiotic stress response of alfalfa.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / MsMYB86 / 非生物胁迫 / 表达模式

Key words

alfalfa / MsMYB86 / abiotic stress / expression pattern

转录因子是真核生物进化过程中形成的一类特有的蛋白，在调控基因表达中扮演着核心角色，主要结合在基因启动子区的特定位点调控转录过程^［1］。MYB家族是植物中最大的转录因子家族之一，其成员广泛参与到植物的生长发育、代谢调节以及对胁迫的响应。MYB蛋白通常含有数个重复的SANT保守结构域（R），通过R的数量可将MYB蛋白分为4个大类：1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB及非典型MYB（4或5个MYB结构域）^［2］。MYB转录因子家族因其独特的结构特征和多样化的生物学功能，成为植物分子生物学研究的热点。

胁迫条件下MYB转录因子与基因启动子区域的结合元件结合，激活或抑制应激反应基因的表达，从而调控植物对环境变化的适应性反应。例如，拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtMYB2转录因子能够激活脱落酸（abscisic acid， ABA）相关的干旱胁迫响应基因RD22，ADH1的表达^［3］。白桦（Betula platyphylla）BpMYB123转录因子能够结合BpLEA14基因的启动子区激活其表达，提高植株抗旱性^［4］。在番茄（Solanum lycopersicum）中沉默SlMYB86基因降低了植株对青枯病的抗性，表明SlMYB86正向调节番茄对青枯病的抵抗能力，在青枯病的抗性中发挥着关键作用^［5］。此外，MYB转录因子还可以通过调节植物次生代谢产物的合成，从而适应外界环境的变化。如：苹果（Malus domestica）MdMYB114促进花青素合成通路相关基因MdANS、MdUFGT和MdGST的表达，促进花青素的生物合成和运输^［6］，有利于苹果对环境的适应性。除调节植物次生代谢物的合成外，MYB转录因子还能够调节植物次生代谢物的转运和积累。例如，在茶树（Camellia sinensis）中，MYB转录因子可以调控茶多酚的积累和转运，从而影响茶树的环境适应性^［7］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）作为全球范围内广泛种植的豆科牧草，兼具高生物量、强适应性、优良适口性以及丰富的营养价值等特性，因而在草食畜牧业生产中占据重要地位^［8］。近年来，紫花苜蓿基因组测序和重测序工作为研究该物种提供了重要的分子基础。中国农业大学王涛团队破译了紫花苜蓿栽培种中苜1号的基因组，并进行了核心种质的重测序，为紫花苜蓿分子育种提供了宝贵的资源^［9］。尽管在植物生长调控以及提高植物抗性方面，MYB86基因已有相关研究报道，但在紫花苜蓿中对MYB86基因的功能研究尚未见报道。本研究在紫花苜蓿中克隆了MYB86基因，利用生物信息学方法对MYB86蛋白进行分析，并初步研究了紫花苜蓿MsMYB86基因在不同器官中的表达特异性及对非生物胁迫的响应，该研究可为进一步探明MsMYB86基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所使用的紫花苜蓿种子来源于山西农业大学草业学院种质资源库。2023年10月，挑选籽粒饱满的中苜1号紫花苜蓿种子，将其播种于蛭石与营养土（按1∶1比例混合）配制的基质中，置于温度（25±2） ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗下培养。生长30 d时，随机选取5株长势良好的紫花苜蓿植株，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，提取总RNA反转录，用于目的基因的克隆。同时分别使用20% PEG 6000溶液、250 mmol·L^-1的NaCl溶液和80 μmol·L^-1的脱落酸（abscisic acid， ABA）溶液对生长30 d的植株进行胁迫处理，在0、6、12、24、48 h取样检测目的基因表达量，重复5次。待植株生长至60 d时，收集植株的根、茎、叶、花各器官，检测MsMYB86基因在紫花苜蓿不同器官中的表达量，具体方法参考岑慧芳等^［10］的研究。根部用英文字母r表示；幼茎用英文字母ys表示；老茎用英文字母os表示；叶片用英文字母l表示；花用英文字母f表示。

1.2 总RNA的提取及反转录cDNA合成

采用北京华越洋生物科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒（0416-50gk），从紫花苜蓿植株叶片中提取总RNA。利用美国Nandrop One 2000超微量紫外分光光度计对提取的RNA浓度及质量进行检测，结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用北京金沙生物有限公司的反转录试剂盒（SR 511），将提取的总RNA反转录合成cDNA。

1.3 目的基因克隆

本研究将MYB86基因序列与已发表的拟南芥数据库、中苜1号数据库、中苜4号数据库等进行对比；采用Primer 5.0在线工具，针对提取出的该基因序列设计引物（表1）。使用北京宝日医生物技术有限公司的高保真酶（Code NO. R060A）进行PCR扩增，25 µL的PCR扩增体系，PCR扩增产物利用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测分析，将符合目的片段大小的条带进行切胶回收，其产物连接pTOPO001 Blunt Simple Cloing Kit载体（北京金沙生物科技有限公司），转化至大肠杆菌中，筛选阳性单克隆菌，菌液鉴定后送至上海生工生物有限公司进行测序。

1.4 生物信息学分析

为解析MsMYB86基因的特性，进行一系列生物信息学分析。首先从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公共数据库下载氨基酸序列，随后利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析其理化性质，包括分子量和等电点。通过SMART（https：//smart.embl.de/）预测蛋白质的结合域，使用NSP@（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_server.html）预测蛋白二级结构，并借助SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测蛋白三级结构。PSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）用于亚细胞定位预测，而Protscale Expasy（https：//web.expasy.org/protscale/）则用于分析蛋白质的亲疏水性。此外，通过DNAMAN 9.0软件进行多物种序列比对，MEGA 11.0软件用于构建系统进化树，还通过EMBOSS在线网页（http：//emboss.open-bio.org/）及Gene pioneer在线网页密码子工具（http：//cLoud.genepioneer.com：9929/#/home）分析密码子偏好性，同时使用NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）和NetNGlyc 1.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）分析蛋白翻译的磷酸化与糖基化位点。最后，利用STRING（https：//cn.string-db.org/）工具构建蛋白互作网络，以揭示MsMYB86潜在生物学功能和作用途径，为理解MsMYB86在细胞内的角色和调控网络提供数据支撑。

1.5 目的基因表达模式分析

将上述收集的植物样品提取总RNA，反转录cDNA，进行实时荧光定量PCR，重复5次，利用2^-∆∆Ct方法^［11］计算紫花苜蓿MsMYB86基因的相对表达量，所用MsMYB86定量引物及内参Actin引物序列参考表1。

1.6 数据分析

利用SPSS 18.0软件分析数据，采用GraphPad Prism 9.5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿MYB86基因的克隆及理化性质分析

以中苜1号的cDNA为模板，利用引物MsMYB86-Forward和MsMYB86-Reverse，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示1100 bp左右有特异性条带出现（图1），且条带的大小与目的片段的预期大小一致。菌液测序结果显示克隆得到的MsMYB86基因长度为1104 bp，包含完整的CDS序列，共编码367个氨基酸（图2）。使用ExPASy在线工具对MsMYB86蛋白理化性质进行分析，结果显示，MsMYB86蛋白相对分子量为41267.96 Da，理论等电点（isoelectric point，pI）为7.10，脂肪指数为65.61，带负电残基的总数（天冬氨酸+谷氨酸，aspartic acid+glutamic acid）为34，带正电残基的总数（精氨酸+赖氨酸，arginine+lysine）为34，半衰期为30 h，不稳定性指数为58.34，表明MsMYB86蛋白较为稳定。

2.2 生物信息学分析

蛋白结构域预测分析结果显示：紫花苜蓿MsMYB86蛋白具有两个典型的 SANT-MYB 结构域，分别位于 13~63氨基酸和 66~114氨基酸处，其属于MYB家族中亚家族之一的R2R3-MYB蛋白家族（图3A）；蛋白磷酸化预测位点结果显示，该蛋白共含有53个磷酸化位点，其中包含36个丝氨酸（serine）磷酸化位点、12个苏氨酸（threonine）磷酸化位点、5个酪氨酸（tyrosine）磷酸化位点（图3B）。同时，预测表明紫花苜蓿MsMYB86蛋白主要以丝氨酸的磷酸化为主。蛋白亲水性、疏水性预测结果显示，在第80个氨基酸处疏水性峰值最高（2.189），第340个氨基酸处亲水性峰值最高（-2.911），与疏水性氨基酸总数相比，亲水性氨基酸总数更多，亲水部分大于疏水部分，总平均疏水指数（grand average of hydropathicity，GRAVY）：-0.680<0，推测紫花苜蓿MsMYB86蛋白为亲水性蛋白（图3C）；紫花苜蓿MsMYB86蛋白的糖基化位点预测结果显示，存在5个潜在糖基化位点，分别是143位：NKTN（72%），182位：NNSS（50%），183位：NSSS（49%），222位：NAST（49%），286位：NNTN（51%）（图3D）。

利用PSORT在线工具进行亚细胞定位预测（图4A），结果显示，紫花苜蓿MsMYB86蛋白87%位于细胞核内，13%位于线粒体。利用EMBOSS在线分析平台及Gene Pioneer在线网页密码子分析工具，对MsMYB86基因的密码子使用偏好性进行系统性分析（图4B），结果显示高频密码子［相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）>1］有24个，分别为AGA、UAG、GUU、CCA、GCA、AGG、GGA、UCA、CAU、AUU、GCU、ACA、ACU、UCU、GAU、CUU、UUG、GAA、AAA、CAA、UUA、UAC、GGU、AAU。整体来看，MsMYB86基因偏好以A或U结尾的密码子。

2.3 多序列比对及系统进化树分析

对紫花苜蓿中苜1号（Zhongmu No.1）、紫花苜蓿中苜4号（Zhongmu No.4）、拟南芥、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max）、狭叶羽扇豆（Lupinus angustifolius）、桃树（Prunus persica）、梅树（Prunus mume）、可可树（Theobroma cacao）、枣树（Ziziphus jujuba）、芝麻（Sesamum indicum）、啤酒花（Humulus lupulus）、大麻（Cannabis sativa）、榛子（Corylus avellana）、水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）、林烟草（Nicotiana sylvestris）、渐狭叶烟草（Nicotiana attenuata），这18种植物的MYB86蛋白进行多序列比对分析，结果显示，中苜1号MYB86蛋白的氨基酸序列与其余17种植物MYB86氨基酸序列表现出高度保守性（图5）。

为深入探究MYB86基因的系统发育关系，将上述18个MYB86蛋白利用MEGA 11.0软件构建邻接法系统进化树。结果显示，中苜1号MYB86蛋白、中苜4号MYB86蛋白以及蒺藜苜蓿MYB86蛋白亲缘关系较近，说明这3个氨基酸序列差异较小，相似性较高；其次与大豆、狭叶羽扇豆氨基酸序列亲缘关系较近，推测其在功能上可能也具有相似性（图6）。

2.4 蛋白质二级、三级结构及蛋白互作分析

紫花苜蓿MYB86蛋白的二级结构通过NPS@蛋白二级结构在线工具进行预测，结果显示（图7A）：主要构成元件为α-螺旋和无规则卷曲，其中α-螺旋有71个，蛋白结构的占比为19.35%；无规则卷曲有294个，蛋白结构的占比为80.38%；单条延伸链为1个，蛋白结构的占比为0.27%。为进一步探究紫花苜蓿中MsMYB86蛋白的功能，利用STRING在线工具构建了蛋白互作网络（图7B），并通过蛋白互作关系综合得分鉴定出10种与MsMYB86互作的蛋白，其中与CYP73A5（0.894）的互作分值最高，其他互作蛋白按分值排序依次为：BHLH2（0.855）、GL3（0.853）、TTG1（0.828）、DFRA（0.795）、F3H（0.792）、NAC012（0.791）、FLS1（0.785）、TT8（0.785）、CYP75B1（0.785）。CYP450s（细胞色素P450单加氧酶）家族在植物的次生代谢、抗氧化剂和激素合成中起核心作用^［12］。碱性螺旋-环-螺旋结构域的BHLH（basic helix-loop-helix）转录因子^［13］和GL3（GLABRA3）蛋白^［14］则涉及植物生长发育和逆境响应。上述10种蛋白与MsMYB86蛋白形成的互作网络关系表明，MsMYB86蛋白可能通过影响这些蛋白的功能进而参与植物对非生物胁迫的适应性响应。使用SWISS-MODEL在线网页预测蛋白三级结构，MsMYB86蛋白三级结构与大豆中MYB/HD-like转录因子（gene： 778182）的三级结构模型相似度较高，模型质量相似度为75.49%（图7C，D）。

2.5 MsMYB86基因的表达模式分析

试验结果表明，MsMYB86基因在根、老茎、幼茎、叶和花中均有表达，但表达水平存在显著差异（P<0.05），其中老茎中的相对表达量最高，叶片中的表达量最低（图8A）。干旱胁迫下，MsMYB86基因的相对表达量显著上调（P<0.05），在12 h时达到峰值，之后表达量逐渐下降，48 h时降至最低（图8B）。盐胁迫下，MsMYB86基因的相对表达量呈升-降-升-降的趋势，6和24 h表达量较高，且显著高于其余各时间点（图8C）。ABA处理下，MsMYB86基因的相对表达量在6和12 h时显著下降（P<0.05），但在24 h时表达量显著上升，并在48 h时达到最高点（图8D）。上述结果表明，MsMYB86基因对干旱、盐胁迫及ABA处理具有响应性。

3 讨论

MYB转录因子家族在植物中广泛存在，对植物生命过程具有重要影响。尽管科研人员已经对MYB转录因子家族进行了广泛的研究，但在紫花苜蓿中MYB基因家族的研究还相对较少，尤其是MYB86基因，目前尚未见相关报道，这表明在紫花苜蓿MYB转录因子家族的研究领域，还有很大的探索空间。

3.1 紫花苜蓿MsMYB86蛋白的生物学特性

本研究成功克隆了紫花苜蓿MsMYB86基因，该基因全长1104 bp，编码367个氨基酸。序列分析显示，MsMYB86蛋白与蒺藜苜蓿、大豆和狭叶羽扇豆中的MYB86蛋白具有高度相似性，表明这些蛋白在进化上保守，可能在不同物种中发挥相似的生物学功能。亚细胞定位预测发现MsMYB86蛋白主要定位于细胞核，这与小麦（Triticum aestivum）^［15］、茄子（Solanum melongena）^［16］、水稻^［17］等物种亚细胞定位结果一致。这一发现支持了MYB86作为转录因子在细胞核内调控基因表达的角色，表明MsMYB86可能通过与特定的DNA序列相互作用，调节植物的生长发育和代谢过程，并且可能参与细胞分化和发育，从而影响植物的形态建成。这些结果为深入探究MsMYB86在紫花苜蓿中的分子功能及其调控机制提供了理论依据。蛋白结构域预测分析MsMYB86蛋白包含两个SANT-MYB结构域，与Chen等^［5］对番茄SlMYB86的研究结果一致，这些结构域在基因表达调控和染色质重塑中起关键作用，表明MsMYB86蛋白在基因调控和植物生长发育中发挥作用。植物的生长发育依赖于蛋白质间的相互作用^［18］，这些相互作用精细调控着基因表达和信号传导，从而影响植物对环境变化的适应性和生长发育过程。蛋白网络分析预测MsMYB86蛋白与多个关键蛋白家族成员存在互作关系，包括CYP450s、BHLH转录因子和R2R3-MYB家族成员之一的GL3等，表明MsMYB86蛋白可能通过与这些蛋白的相互作用，参与植物初级代谢和次生代谢，进而在逆境胁迫下调节植物生长。

3.2 紫花苜蓿MsMYB86基因表达的组织特异性

研究表明，高表达基因的密码子偏好性与自然选择相关^［19］。在蒺藜苜蓿叶绿体基因组中，A或U结尾的密码子表现出偏好性，可能与翻译效率有关^［20］。密码子分析表明MsMYB86基因倾向于使用以A或U结尾的密码子，这一偏好可能与其高效的基因表达能力相关。MYB家族转录因子在植物的组织特异性表达和非生物胁迫响应中扮演着关键角色。番茄SlMYB86基因在根和叶中的表达量显著增加^［5］，且茶树中MYB转录因子家族成员也表现出组织特异性^［21］。本研究中，MsMYB86基因在老茎中表达量最高，且显著高于其余各器官，表明该基因具有组织表达差异性。

3.3 紫花苜蓿MsMYB86基因对非生物胁迫的响应

MsMYB86基因的表达动态揭示了其在紫花苜蓿逆境响应中的潜在作用。干旱胁迫下，MsMYB86基因的表达量呈现出显著的动态变化，基因表达量在12 h时达到峰值，随着胁迫时间的延长逐渐降低。MsMYB86基因在紫花苜蓿中的表达模式揭示了其在干旱胁迫初期的快速响应，随后表达量下降，推测其在逆境初期可能发挥重要作用，随后可能被其他调节机制所替代。这与现有研究一致，表明植物在持续干旱胁迫下会激活复杂的信号传导途径和生理响应以维持水分平衡和细胞完整性^［22］。基因快速响应涉及激素信号转导，例如ABA调控花青素合成以应对氧化反应，以及吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）调控根系下扎以吸收更多土壤水分。这些信号转导途径的激活可能导致某些基因在干旱胁迫初期被迅速诱导表达，而随着胁迫的持续，这些基因的表达量可能会下降，反映了植物适应持续干旱条件的调节机制^［23］。当受到盐胁迫时，MsMYB86基因的表达模式呈现出双相变化。该基因的表达量在胁迫初期显著上升，随后在12 h时降至最低点。随后逐渐回升，到48 h时表达量下降。这些结果表明，MsMYB86可能在盐胁迫的早期阶段发挥关键作用，参与了植物的快速响应机制。脱落酸作用下，MsMYB86的表达模式与干旱胁迫和盐胁迫不同。在胁迫初期，MsMYB86的表达量下降，随着胁迫时间的延长，表达量逐渐上升，并在48 h达到峰值，推测MsMYB86可能参与ABA信号传导途径，从而有助于植物对水分胁迫的适应。综上，不同非生物胁迫下紫花苜蓿MsMYB86基因的表达模式反映出其参与了逆境响应，而不同胁迫条件下的响应趋势有差异又表明紫花苜蓿对逆境的应答机制复杂多样，需要进一步探究以揭示其作用机制。

4 结论

本研究成功克隆了紫花苜蓿MYB转录因子家族成员MsMYB86基因，该基因全长1104 bp，编码367个氨基酸，生物信息学分析揭示其氨基酸序列包含两个SANT-MYB DNA结合结构域，同源性比较和系统进化树分析表明，MsMYB86蛋白与豆科牧草具有高度同源性和进化亲缘性，其序列在多个物种中高度保守，且MsMYB86蛋白与多个关键蛋白家族成员存在互作关系。MsMYB86基因在紫花苜蓿老茎中表达量最高，且对干旱、盐胁迫以及ABA处理均有响应，表明其可能在植物逆境响应中扮演关键角色。研究结果为后续深入探究MsMYB86基因在紫花苜蓿中的功能提供了理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金(32071872)

山西省中央引导地方科技发展资金项目(YDZJSX2022B006)

山西重点研发计划课题(202102140601006-3)

山西省基础研究计划(202303021221101)

山西省来晋科研奖励(SXBYKY2022118)

优秀博士启动项目(2021BQ01)

优秀博士启动项目(2023BQ03)