白三叶几丁质酶基因家族鉴定及TrChit3功能分析

Identification of the chitinase gene family and functional analysis of TrChit3 from white clover

摘要

几丁质酶是一种糖苷水解酶，在植物生长发育过程中发挥着重要作用。目前几丁质酶在白三叶应答各种生物和非生物胁迫的相关研究报道相对较少。本研究对白三叶的几丁质酶基因家族进行了全基因组鉴定，得到了44个几丁质酶基因，不均匀分布于白三叶16条染色体上，通过系统进化分析将这些几丁质酶分为GH18和GH19分支，5个不同的小组：I~V。其中29个基因属于GH18亚家族，15个基因属于GH19亚家族，且同一亚族基因具有相似的结构和功能，启动子分析发现，这44个几丁质酶基因的启动子区域包含与生长发育、激素及逆境胁迫相关的多种顺式作用元件，此外，qRT-PCR分析显示，盐胁迫和干旱胁迫处理显著诱导了几丁质酶基因的表达，进一步验证了其在植物胁迫响应中的作用。选择TrChit3基因深入研究几丁质酶基因的抗旱能力。在拟南芥中过表达TrChit3基因并进行干旱胁迫处理，测定相对电导率、丙二醛等生理指标，结果显示在干旱条件下过表达TrChit3基因能够显著提高拟南芥的耐旱能力。研究结果为植物中几丁质酶基因的探索奠定了基础。

Abstract

Chitinases are glycoside hydrolases that play an important role in plant growth and development. Relatively few studies have focused on the responses of chitinases to various biotic and abiotic stresses in white clover （Trifolium repens）. Therefore， in this study， we searched the whole genome of white clover to identify and characterize its chitinase gene family. A total of 44 chitinase genes were identified in the whole genome of white clover， and they were unevenly distributed on 16 chromosomes. Phylogenetic analysis of these chitinase genes classified them into two mega-groups （GH18 and GH19）， with five separate clusters （I-V）. Twenty-nine chitinase genes belonged to the GH18 subfamily and 15 belonged to the GH19 subfamily. The genes within the same subfamily genes encoded proteins with similar structures and functions. Promoter analysis showed that the promoter regions of these 44 chitinase genes contained a variety of cis-acting elements related to growth and development， hormones， and stress. Furthermore， quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction analyses showed that salt stress and drought stress resulted in significant increases in the transcript levels of chitinase genes， which further verified their roles in the plant stress response. TrChit3 was selected for a detailed analysis of its role in drought resistance. Overexpression of TrChit3 in Arabidopsis thaliana enhanced its resistance to drought stress， as measured by changes in physiological indexes such as relative conductivity and malondialdehyde content. These results lay a foundation for further studies on the roles of chitinases in plants.

Graphical abstract

关键词

白三叶 / 几丁质酶 / 基因家族 / 表达分析

Key words

white clover / chitinase / gene family / expression analysis

植物在对病原体入侵和非生物胁迫的反应中表达了多种致病相关（pathogenesis-related， PR）蛋白。PR蛋白涉及直接攻击入侵病原体的裂解酶，如几丁质酶和β-1，3葡聚糖酶，或者合成各种小分子（木质素、单宁、黑色素、植物抗毒素、酚类），从而延缓病原体的攻击^［1-2］。

几丁质酶是一种糖苷水解酶，分布广泛并且具有多种功能。在植物中，几丁质酶的分泌主要是作为真菌病原体或含有几丁质的生物裂解酶，它催化甲壳素中β-1，4-糖苷键的水解裂解，并产生N-乙酰氨基葡萄糖^［3］。几丁质酶在自然界中无处不在，在不同的生命体中都有发现。根据特定催化结构域的存在，这些蛋白被分为几丁质酶家族18（GH18）和几丁质酶家族 19（GH19）两个糖苷水解酶家族。此外，考虑到几丁质酶在结构、催化反应、系统发育关系和对抑制剂的特异性等方面的不同特征，这些几丁质酶代表了5个不同的类（Ⅰ~Ⅴ类），其中Ⅲ类和Ⅴ类属于GH18，各有8个α螺旋和β链作为关键结构^［4-5］，广泛分布于多种生物体中，而Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类属于GH19^［6］，包含球状结构域^［6］，主要存在于高等植物中^［6］，负责促进大部分几丁质溶解活性^［7］。

植物几丁质酶分布在植物的根、茎、叶和花中，许多几丁质酶基因受发育调节，可能在特定的生理过程中发挥作用^［8］。有学者已经证明过表达几丁质酶基因可以抑制尖孢镰刀菌对萝卜（Raphanus sativus）植株的侵染^［9］；几丁质酶Cht20.2的转录，赋予小麦（Triticum aestivum）条锈病抗性^［10］；相关几丁质酶基因（RC7）的表达可以增强水稻（Oryza sativa）对纹枯病的抵抗力^［11］。此外，目前有研究表明几丁质酶也参与了植物对激素和非生物胁迫的应答反应^［12-14］。例如，茉莉酸甲酯可能是番茄（Solanum lycopersicum）种子萌发过程中几丁质酶基因Chi9表达的主要调节因子^［12］；几丁质酶基因Chi11能够增强番茄对盐、干旱的耐受性^［13］；HvChi22在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达能够通过增加氧化保护酶的活性来增强拟南芥耐旱性，从而减少丙二醛（malondialdehyde，MDA）的积累^［14］。总之，几丁质酶基因参与植物多种抗逆过程。潘晓雪等^［15］对水稻几丁质酶基因家族成员进行全基因组鉴定，共鉴定到49个几丁质酶基因；此外，张华等^［16］对野生大豆（Glycine max）与栽培大豆几丁质酶基因进行鉴定， 其中在野生大豆中鉴定到66个几丁质酶基因，在栽培大豆中鉴定到55个几丁质酶基因。然而，迄今为止，白三叶（Trifolium repens）几丁质酶基因家族尚未得到鉴定和系统分析，几丁质酶基因是否参与调控白三叶抗旱的生物学功能也未见报道。因此，本研究基于白三叶基因组数据，对白三叶几丁质酶基因家族进行了鉴定和分析，并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术观察几丁质酶基因在白三叶遭受逆境胁迫时的表达规律，分析筛选出可能参与调控白三叶抗旱的成员gene-P8452_10182（TrChit3）， 并在拟南芥上过表达该基因从而对其参与调控白三叶抗旱的生物学功能进行验证。希望为未来深入了解白三叶几丁质酶基因在抵御逆境胁迫时发挥的功能提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2023年在四川农业大学草业科技学院实验室进行，以‘拉丁诺’白三叶材料进行实时荧光定量PCR实验，使用Col-0型拟南芥进行花序侵染操作。

1.2 白三叶几丁质酶基因家族鉴定及其生物信息学分析

首先从NCBI数据库下载白三叶最新版本基因组序列，并在NCBI网站查找拟南芥基因组的所有几丁质酶家族成员蛋白序列。在NCBI上下载GH18和GH19的隐马尔可夫模型，利用TBtools软件筛选几丁质酶家族成员并命名。对候选几丁质酶家族成员的蛋白质分子量（molecular weight，MW）、等电点（isoelectric point，pI）和氨基酸长度等理化性质进行分析。利用TBtools软件对获取的几丁质酶基因进行染色体分布分析。

1.3 白三叶几丁质酶基因家族的系统进化树构建

以拟南芥几丁质酶基因作为参考，利用MEGA 7软件对白三叶几丁质酶基因家族成员构建系统进化树。

1.4 白三叶几丁质酶基因家族编码蛋白保守基序与基因结构分析

利用MEME网站识别白三叶几丁质酶蛋白序列中的保守基序。利用 TBtools 软件分析其进化关系并可视化。

1.5 白三叶几丁质酶基因家族的顺式作用元件预测

为了预测白三叶几丁质酶基因的顺势作用元件，本研究获得了启动子区的核苷酸序列（起始密码子上游2.0 kb）。PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行预测分析。

1.6 非生物胁迫下白三叶几丁质酶基因RT-qPCR分析

挑选籽粒饱满的‘拉丁诺’白三叶种子，均匀的播种于蛭石中，在温度为25 ℃，光照强度为600 lx，相对湿度为80%，光照持续时间为8 h，夜间光周期为16 h条件下培养7 d；然后进行水培，对培养30 d的白三叶幼苗分别进行干旱处理（15%聚乙二醇，polyethylene glycol，PEG）及盐胁迫（150 mmol·L^-1 NaCl），进行3次重复，取处理时间分别为0、1、3、6、12和24 h时的叶片组织。提取不同处理下的白三叶叶片总RNA，并进行反转录合成cDNA，将cDNA分装保存在-30 ℃。使用 Primer 5软件设计基因特异性引物（表1），以实验室筛选的At β-actin作为内参基因（F：TGCTTGATTCCGGTGATGGTGTG；R：TGCTTGATTCCGGTGATGGTGTG）；计算基因的相对表达量。

1.7 拟南芥转化及阳性植株鉴定

使用qRT-PCR分析筛选出可能参与调控白三叶抗旱的成员gene-P8452_10182（TrChit3），依据pBI21载体序列，设计5′端分别引入Xba I和Sac I酶切位点和同源臂碱基的引物，即pBI121-Trchit3-F：AGAACACGG GGGACTCTAGAATGGCATCCTTAAAACAAGTT和pBI121-Trchit3-R：GGGGAAATTCGAGCTCTTAAA CACTGCCCTTAATA。以白三叶cDNA为模板构建载体pBI21-Trchit3，先将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，验证后提取质粒再转入EHA105农杆菌感受态细胞中。

参照Yao等^［17］用花序侵染法将重组过表达载体转化至Col-0型拟南芥，待拟南芥结种后收取T₀代转基因种子。将其置于含有Kan的1/2 MS固体培养基（蔗糖30 g·L^-1，琼脂8 g·L^-1，MS培养基10 g·L^-1）上筛选。两周后选取长势正常、生长良好的阳性植株移植至装有营养土的盆钵中，拟南芥成熟后收种。将拟南芥植株筛选至T₃代，对T₃代拟南芥植株进行测序验证，从中挑选出阳性植株。

1.8 转基因拟南芥干旱胁迫处理及生理指标测定

1.8.1 转基因拟南芥干旱胁迫处理

分别选取长势正常且相近的转基因植株和野生型植株移栽至装有相同重量混合营养土的黑色正方形塑料盆钵中，幼苗在土壤中生长20 d后进行干旱胁迫。采用12% PEG溶液（配制方法：100 g PEG溶解于1 L 1/4 霍格兰完全营养液中）进行模拟干旱胁迫。每2 d将托盘中剩余液体完全倒出，并倒入新的处理液。PEG处理7 d后进行生理指标的测定。

1.8.2 叶片相对含水量

为了测定相对含水量 （relative water content，RWC），将叶子从植物上分离下来，并立即称重以测定鲜重（fresh weight，FW）。将这些叶子在4 °C的蒸馏水中浸泡24 h后，轻轻吸干叶组织并加重膨胀重量（turgid weight，TW）。烘干后获得干重（dry weight，DW）。公式为：RWC（%）=［（FW-DW）/（TW-DW）］×100^［18］。

1.8.3 相对电导率

称取相同部位、长势一致的叶片鲜样0.1 g，用ddH₂O冲洗4次，干净的吸水纸轻轻吸去多余水分后放入试管中，加入10 mL蒸馏水，置于室温16 h后，用DDS-11A型电导仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）测其初电导率。然后利用高压灭菌锅（121 ℃、20 min）处理叶片，待叶片冷却至室温后，测定终电导率，相对电导率=（初电导率/终电导率）×100%。

1.8.4 叶绿素含量

参照Xu等^［19］的方法使用分光光度计（uv-6100，上海）测量混合溶液在645和663 nm处的吸光度值来计算叶绿素含量。

1.8.5 叶绿素荧光参数

将叶子置于黑暗中30 min后，采用Pocket PEA连续激发式荧光仪（上海）测定叶片最大光化学效率（maximum photochemical efficiency，F_v/F_m）和叶片健康性能指数（performance index on absorption basis，PI_ABS）。每个处理重复 10~12 次。

1.8.6 活性氧含量

称取大约0.1 g左右的拟南芥叶片，置于液氮中充分冷冻后，参照Li等^［20］和Liu等^［21］的方法测定活性氧含量。

1.8.7 丙二醛（MDA）含量及总抗氧化保护酶活性

称取拟南芥叶片组织约0.1 g，放入含钢珠的2 mL离心管中，将含有样品的离心管于液氮中充分冷冻后，用2 mL 50 mmol·L^-1 PBS（pH 7.8）在冰上研磨，然后离心30 min（10360 r·min^-1，4 °C）。收集粗酶溶液，将粗酶溶液（0.5 mL）加入含有硫代巴比妥酸（0.5%，thiobarbituric acid，TBA，w/v）和三氯乙酸（20%，w/v）的1 mL反应溶液中。混合均匀后在95 °C水浴锅中加热25 min，然后在冰浴上快速冷却。最后，将混合物以9457 r·min^-1离心10 min。在532和600 nm处检测上清液的吸光度。MDA含量（mmol·g^-1）=（OD₅₃₂-OD₆₀₀）×V（提取液总体积，L）/（样品长度×消光系数×1000×样品鲜重）。

称取0.1 g左右的拟南芥叶片，置于液氮中充分冷冻后再使用Beyotime公司的总抗氧化能力检测试剂盒ml016826测定总抗氧化酶活性，操作详见说明书。

1.9 数据处理

利用SPSS 25进行差异显著性分析，并采用Origin 2016作图。

2 结果与分析

2.1 白三叶几丁质酶基因家族成员的理化性质和染色体分布

在白三叶基因组中共鉴定出44个几丁质酶家族成员（表2），编码氨基酸长度在132~621 aa，平均长度299 aa；分子量变化范围为14603.66~68415.97 Da，平均32700.88 Da；理论等电点为 4.37~9.26；不稳定指数为21.51~47.07；脂肪族氨基酸指数为56.40~96.54；平均疏水性为-0.322~0.111。

为了了解白三叶几丁质酶基因家族成员的染色体分布情况，利用TBtools软件对白三叶几丁质酶家族成员构建了染色体分布图（图1）。结果显示，白三叶几丁质酶基因家族不均匀分布在16条染色体上。

2.2 白三叶几丁质酶基因家族系统进化树

用MEGA 7对上述鉴定得到的44个白三叶几丁质酶基因进行系统进化树分析（图2），参考拟南芥几丁质酶基因分类将白三叶几丁质酶基因家族划分为5类，分别命名为Class I~Class V，每个类别中的成员数量也不相同。其中Class Ⅲ包含的几丁质酶基因数量最多（23个），而Class Ⅱ包含的几丁质酶基因数量最少（2个）。

2.3 白三叶几丁质酶基因家族保守结构域和基因结构分析

分析白三叶几丁质酶基因的保守基序（图3），将白三叶几丁质酶基因家族分为GH18和 GH19两个亚族， 其中GH18亚族有29个家族成员、GH19亚族有15个家族成员。在GH18与GH19亚家族鉴定到10个保守基序，将其命名为 motif 1~motif 10，其中GH18亚家族基因多数含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7和 motif 8，而GH19亚家族基因则多数含有motif 2、motif 5、motif 6和motif 10。表明同一亚族具有相似的蛋白保守基序排列。

基因结构分析结果显示，白三叶几丁质酶家族结构简单，绝大多数GH18亚家族成员只有一个内含子，而GH19亚家族成员大部分含有2个内含子。结合保守结构域结果分析，同一亚族的基因可能具有相似的功能。

2.4 白三叶几丁质酶基因家族成员启动子顺式作用元件分析

为了研究几丁质酶家族基因的功能，对白三叶几丁质酶基因起始密码子上游2 kb的序列进行分析，结果（图4）表明，白三叶几丁质酶基因的启动子区域存在多个生物和非生物胁迫响应的顺式元件，例如光响应、激素响应、胁迫应答等。其中，大部分成员均含有光响应元件，14个白三叶几丁质酶基因含有生长素响应元件；21个成员含有赤霉素响应元件；21个成员含有水杨酸响应元件；18个成员含有低温响应元件；18个成员含有干旱诱导的应答元件；19个成员含有防御和应激响应元件。另外，在9和12个成员中检测到分生组织表达响应元件，在12个成员中检测到胚乳表达响应元件，3个几丁质酶基因中检测到含有细胞周期调控响应元件。这些结果表明，白三叶几丁质酶基因可能参与白三叶生长发育并响应激素、胁迫等多种信号。

2.5 干旱及盐胁迫下白三叶几丁质酶基因表达量分析

为了探究白三叶几丁质酶基因在各种环境胁迫下的潜在作用， 本研究对启动子含有ABA响应、茉莉酸甲酯响应、MYB干旱诱导等元件的基因按照数量排序，然后分别在含有这些元件最多和最少的基因中挑选了5个元件最多的几丁质酶基因（gene-P8452_06296、gene-P8452_10182、gene-P8452_23770、gene-P8452_10179、gene-P8452_63358）和5个元件最少的几丁质酶基因（gene-P8452_33777、gene-P8452_28219、gene-P8452_53931、gene-P8452_54091、gene-P8452_70179），利用实时荧光定量PCR技术分析在干旱及盐胁迫下白三叶几丁质酶基因的表达模式。以PEG模拟干旱处理和盐胁迫0 h的白三叶幼苗作为对照，利用实时荧光定量PCR对基因干旱胁迫和盐胁迫下的表达动态进行检测。结果显示，与对照相比，干旱处理和盐胁迫下这10个几丁质酶基因表达量均上调，只是上调幅度及时间出现差异（图5和图6）。

2.6 过表达TrChit3拟南芥的获得

为了研究gene-P8452_10182基因的功能，将其重新命名为TrChit3并侵染拟南芥，对筛选得到的转基因T₃代拟南芥植株进行PCR检测，得到了3个转基因株系，分别命名为OE1、OE2、OE3（图7）。以At β-actin作为内参基因从而检测TrChit3的相对表达量。结果表明：转基因株系的TrChit3相对表达量明显提高，其中，OE1株系的表达量相对较高，OE2和OE3株系的表达量稍低，而野生型拟南芥（wild type，WT）中TrChit3不表达（图7）。后续将用这3个株系来分析TrChit3抗旱功能。

2.7 过表达拟南芥中TrChit3抗旱功能验证

2.7.1 干旱胁迫对过表达TrChit3拟南芥表型的影响

如图8所示，在12%PEG胁迫后，野生型拟南芥比3个转基因株系（OE1、OE2、OE3）叶片萎蔫更严重，而对照组并没有明显差异，接下来进一步测定了对照及PEG胁迫后植株的相对含水量，对照处理下，3个过表达株系与野生型拟南芥（WT）的相对含水量相差不大，PEG胁迫后，过表达与野生型拟南芥相对含水量均显著降低，但经过干旱处理后WT 的相对含水量要显著低于OE1、OE2和OE3。结果表明，TrChit3过表达可以增强拟南芥成苗在PEG模拟干旱胁迫下的抗性。

2.7.2 干旱胁迫对叶绿素含量的影响

干旱胁迫会通过影响叶绿素含量来降低植物光合水平。本研究观察到，在对照条件下，WT与过表达拟南芥的叶绿素水平相差不大，当WT与过表达拟南芥处于干旱胁迫条件下，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量都显著降低，但是在干旱处理下，转基因株系的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量损失较小，且显著高于野生型（图9）。说明TrChit3基因可能在干旱胁迫下发挥作用。

2.7.3 干旱胁迫对叶绿素荧光参数的影响

正常生长条件下，野生型与转基因拟南芥（transgenic A. thaliana，OE1、OE2、OE3）的PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）和叶片健康性能指数（PI_ABS）无显著性差异，但在干旱胁迫处理下，过表达拟南芥的叶绿素荧光参数均显著高于WT（图10）， 说明TrChit3基因可能降低了干旱胁迫对拟南芥光合能力的伤害程度。

2.7.4 干旱胁迫下野生型和转基因拟南芥相对电导率、MDA和活性氧（超氧阴离子和过氧化氢）含量及总抗氧化能力

在正常处理中，野生型和转基因拟南芥的相对电导率、MDA、活性氧含量及总抗氧化能力无显著差异（图11）。但干旱条件下，野生型拟南芥的相对电导率、MDA和活性氧含量均显著高于转基因株系，其中干旱胁迫下野生型拟南芥的相对电导率是转基因株系的1.2倍（图11B），超氧阴离子（O₂^·-）含量是转基因株系的2倍（图11D）；干旱条件下OE株系的总抗氧化能力显著高于WT（图11C）。结果表明，TrChit3可能通过调控活性氧（reactive oxygen species，ROS）系统提高拟南芥的抗旱性。

3 讨论

白三叶是一种多年生豆科植物，由于其根系发育强壮、匍匐生长和快速更新，广泛分布在温带和冷温带地区^［22］，它含有丰富的营养物质和矿物质元素，具有很高的营养、生态、遗传育种和药用价值^［23］，然而，各种非生物胁迫会严重影响白三叶的生长发育，从而影响其生产和推广^［24-25］。因此，研究白三叶抵御逆境胁迫的分子机制十分重要。几丁质酶基因在植物生长发育以及抵御外界逆境胁迫中发挥重要作用，但其在白三叶生长发育以及抗病耐逆等过程中的作用尚不明确^［24］。几丁质酶是一种糖苷水解酶，在自然界中分布广泛，几丁质酶因其在植物抗真菌防御反应中的重要作用而被广泛研究^［25］，此外有研究表明植物几丁质酶在许多生理和形态过程中也起着重要作用，并且还参与对生物和非生物胁迫的反应^［26-30］。但现在还没有白三叶几丁质酶基因家族的系统分析。在本研究中，对白三叶几丁质酶基因家族成员进行了系统分析，并探究了白三叶几丁质酶基因在干旱及盐胁迫下的表达模式。

不同物种中几丁质酶基因数量差异较大，在番茄、水稻、柑橘（Citrus reticulata）、栽培大豆、葡萄（Vitis vinifera）、小麦、黄瓜（Cucumis sativus）、苹果（Malus pumila）中分别鉴定出43、49、32、55、53、189、28、36个几丁质酶基因^［31-37］，本研究鉴定得到了44个白三叶几丁质酶基因，比较这44个几丁质酶基因的氨基酸序列后，可将其分为GH18和GH19两个亚族，5个不同的簇（I~V）。蛋白理化性质分析结果显示，这些白三叶几丁质酶基因家族成员编码蛋白的氨基酸数量变化范围为132~621 aa，与小麦、柑橘、苹果、栽培大豆等的氨基酸数量变化范围相似，均较大；理论等电点变化范围为4.37~9.26，且偏酸性蛋白质较多，结果与葡萄、苹果、黄瓜的基本一致。这些结果表明，不同物种的几丁质酶基因家族成员的理化性质具有相似性。染色体定位结果显示，44个成员不均匀分布在白三叶的16条染色体上，这与现有结果相似。

基因结构和保守基序分布可以为基因家族的进化关系提供进一步的证据^［38］。本研究结果发现GH18亚家族基因多数含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7和 motif 8，而GH19亚家族基因则多数含有motif 2、motif 5、motif 6和motif 10；大多数GH18亚家族成员只有一个内含子，而GH19亚家族成员大部分含有2个内含子，这些结果与番茄、水稻、小麦等的几丁质酶相似^［32-35］。表明同一亚族基因可能具有相似的功能，而5个类别之间的不同基序组成也意味着不同类别之间的功能多样化。

植物几丁质酶受多种顺式作用元件的转录调控，包括激素顺式作用元件和多种胁迫顺式作用元件^［39-40］。本研究在大部分白三叶几丁质酶基因的启动子区域发现了光响应元件，表明大多数几丁质酶基因的表达可能与光照有关。有研究发现植物激素在几丁质酶基因表达中发挥重要作用^{［14，41］}，本研究所得结果与其一致。同时在18个白三叶几丁质酶基因家族成员中发现含有干旱诱导的应答元件；19个成员含有防御和应激响应元件。为了验证这种可能性，本研究随机选择了10个白三叶几丁质酶基因家族成员，分析在干旱及盐胁迫下白三叶几丁质酶基因的表达模式。结果发现，在干旱及盐胁迫处理下这10个几丁质酶基因的表达量发生或多或少地变化，其中干旱胁迫下变化尤其明显，这与目前研究结果相似^{［13-14，29，42-43］}。推测白三叶几丁质酶基因家族可能在激素、干旱、低温等生物和非生物逆境胁迫应答中起重要作用，这需要进一步的研究。因此，本试验选取gene-P8452_10182基因并将其命名为TrChit3，通过花序侵染法获得了转基因拟南芥^［15］，对野生型及转基因拟南芥进行干旱胁迫试验从而初步验证TrChit3基因功能。

叶绿素是光合作用的主要成分之一，对干旱胁迫敏感^［44］。本研究中，在干旱胁迫处理下，WT的叶绿素含量显著低于过表达株系。叶绿素含量越高，植物光合作用越强，从而增加植物鲜重^［45］。有研究发现，在干旱处理下，过表达株系的相对含水量显著高于WT，本研究结果与其相似。植物遭受干旱胁迫时，由于气孔和代谢的限制，导致其光合作用下降^［46］。叶绿素荧光是衡量光合作用的探针^［47］，已有研究表明在干旱胁迫下几丁质酶基因可以有效保护PSⅡ活性，具有更高的叶绿素荧光^［13］。本试验也有相似结果，在干旱胁迫下，TrChit3转基因拟南芥的PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）和光化学性能指数（PI_ABS）均显著高于野生型拟南芥。这些结果表明TrChit3基因可能参与拟南芥光合作用从而提高耐旱性。

在植物中，脂质过氧化主要是由于 ROS过度积累引起的氧化应激导致的^［48］，特别是H₂O₂^［18］。MDA是一种用来评估植物在非生物胁迫下的膜脂质氧化损伤程度的物质^［49］。在干旱环境中，植株为了保护膜免受脂质过氧化损伤，进化出一系列抗氧化防御系统，通过提高总抗氧化能力从而应对干旱^［50］。在本研究中，干旱胁迫下，与野生型拟南芥相比，转基因植株丙二醛（MDA）含量、超氧阴离子（O₂^·-）产生速率和H₂O₂含量较低，说明转基因植株遭受的膜损伤程度较低，3个转基因株系的总抗氧化能力均高于野生型，表明转基因植株具有更有效的酶促抗氧化系统来清除过量的ROS。这些数据表明，ROS清除系统能力的提高是过表达的转TrChit3基因拟南芥抗旱性增强的原因之一。

4 结论

本研究在白三叶基因组中鉴定出44个几丁质酶基因，这些基因随机且不均匀地分布在白三叶染色体上。系统发育分析将这些几丁质酶基因分为GH18和GH19两个亚族，5个不同的簇，分别代表5类几丁质酶（I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V）。基因结构和保守结构域结果显示，同一亚族基因可能具有相似的功能，启动子分析显示，几丁质酶基因启动子区域存在多个与生物和非生物胁迫相关的顺式作用元件，表明其在植物对多种胁迫的防御反应中起作用。此外，基因表达分析显示，干旱和盐胁迫处理显著诱导了几丁质酶基因的表达，进一步证实了它们在白三叶胁迫响应中的作用。克隆得到TrChit3基因，并成功在拟南芥中过表达，拟南芥干旱胁迫试验表明，TrChit3基因可能参与光合作用及膜脂过氧化从而提高转基因拟南芥的耐旱能力，本研究结果为白三叶几丁质酶在植物防御中的潜在作用提供了新的见解。然而，需要进行大量的研究工作来阐明几丁质酶介导的不同植物胁迫调节的详细机制，以便将其用于白三叶改良中。

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基金资助

四川省饲草创新团队项目(SCCXTD-2024-16)