大豆GmPP2C28基因对百脉根结瘤固氮的功能研究

Functional identification of the role of soybean gene GmPP2C28 in the nitrogen-fixation process of Lotus japonicus

摘要

植物蛋白磷酸酶PP2C是植物至关重要的一类丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。该家族基因在植物发育及多种逆境响应中起着关键作用，关于其在豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程中的功能研究相对较少。本研究前期克隆了1个大豆PP2C家族基因GmPP2C28，并证实其受根瘤菌诱导表达。构建GmPP2C28基因的过表达载体p1302G-GmPP2C28，利用发根农杆菌LBA1334介导的百脉根毛根转化法获得带转基因毛状根的百脉根嵌合体植株。通过结瘤试验发现转GmPP2C28基因百脉根结瘤数目明显高于转空载体的对照植株，结瘤指示基因的转录水平显著上调。对根瘤切片进行甲苯胺蓝染色发现，过量表达GmPP2C28基因显著增加根瘤侵染区类菌体的数量。进一步对根瘤的固氮酶活性进行测定发现，过量表达GmPP2C28基因显著增加成熟期及衰老期根瘤的固氮酶活性。以上结果表明在百脉根中异源表达GmPP2C28基因，显著增加了嵌合体百脉根植株结瘤数目以及根瘤中类菌体的数量。此外，过表达GmPP2C28显著提高了成熟期以及衰亡期根瘤的固氮酶活性，从而大大延缓了根瘤的衰老。研究结果可为创制优良百脉根品种，充分发挥百脉根的生物固氮作用提供新的候选基因。

Abstract

Protein phosphatase 2C （PP2C） is a crucial serine/threonine protein phosphatase in plants. These enzymes are encoded by a large gene family， and they play key roles in plant development and various stress responses. However， there is relatively little research on the role of PP2Cs in the formation of nodules in the symbiotic relationship between leguminous plants and rhizobia. Previously， a soybean （Glycine max） PP2C family gene GmPP2C28 was cloned and its expression was confirmed to be induced by rhizobia. In this study， we constructed a plant overexpression vector p1302G-GmPP2C28 and obtained transgenic Lotus japonicus plants using Agrobacterium tumefaciens LBA1334-mediated transformation of hairy roots. The transgenic GmPP2C28-expressing plants formed significantly more nodules than did those transformed with the empty vector， and the transcript level of the nodule indicator gene also tended to be higher in the transgenic plants than in the empty vector control plants. Methylamine blue staining of nodule slices revealed that overexpression of GmPP2C28 significantly increased the number of bacteroids in the infected area of the nodules. Analyses of nodule nitrogenase activity revealed that overexpression of GmPP2C28 significantly increased nitrogenase activity in mature and senescent nodules. Together， these results show that heterologous expression of GmPP2C28 in L. japonicus significantly increased the numbers of nodules and filamentous bacteria in the root nodules. In addition， overexpression of GmPP2C28 significantly increased nitrogenase activity in mature and decaying nodules， thereby greatly delaying nodule aging. The findings of this study identify a new candidate gene for creating excellent varieties of L. japonicus and other legume species with strong biological nitrogen fixation.

Graphical abstract

关键词

大豆 / 蛋白磷酸酶2C / 百脉根 / 共生固氮 / 根瘤衰老

Key words

soybean / protein phosphatase 2C / Lotus japonicus / symbiotic nitrogen fixation / nodule senescence

豆科植物与根瘤菌的共生固氮是一种最经济、高效和环境友好型固氮方式^［1］。百脉根（Lotus japonicus）是一种优良的豆科牧草，由于其营养丰富、适口性好、含皂素低、耐牧性强，目前在世界各地得到了广泛的种植。同时，作为豆科植物，百脉根的生物固氮作用能够增加土壤肥力，促进植株的生长发育。而且，在豆科牧草中，百脉根的遗传转化体系成熟，已经成为重要的模式豆科植物^［2］。然而，如何延缓根瘤衰老，充分发挥其生物固氮作用，是科研与生产的重要课题。因此，利用生物技术对百脉根进行遗传改良，从而培育出延缓根瘤衰老且固氮能力强的新品种，对于牧草行业可持续发展具有重要意义。

蛋白磷酸激酶行使蛋白质的磷酸化功能，而蛋白磷酸酶可以使磷酸化的蛋白质分子去磷酸化，二者作为分子开关协同调控蛋白质的活性^［3］。蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C，PP2C）是一类可以催化丝/苏氨酸残基脱去磷酸基团的磷酸酶，在植物、动物和微生物中广泛存在。已有报道表明植物PP2C家族蛋白在细胞信号转导、植物生长发育以及胁迫响应等生物学过程中行使功能^［4-7］。前人从模式豆科植物百脉根中分离出2个编码2C型蛋白磷酸酶的基因LjNPP2C1和LjPP2C2。研究发现LjNPP2C1基因在根瘤中的表达水平较高，而LjPP2C2基因在根瘤和根中的表达水平相似。LjNPP2C1基因的转录水平在成熟根瘤中显著增加，其最高表达水平出现在豆血红蛋白基因诱导后。在百脉根不结瘤突变体中检测到LjNPP2C1基因的表达水平发生了显著变化，这表明LjNPPC1基因可能在根瘤发育的早期和晚期都发挥作用^［8］。2015年的研究表明LjPP2C能够和促分裂原活化蛋白激酶6（mitogen-activated protein kinase 6，MPK6）相互作用，体外试验也证实了LjPP2C能够使MPK6去磷酸化，从而负调控MPK6介导的共生结瘤信号转导途径^［9］。研究表明，豆科植物PP2C家族蛋白可能在共生固氮过程中发挥重要作用。

对野生大豆（Glycine soja）以及栽培大豆（Glycine max）PP2C家族成员的功能研究主要集中在大豆生长发育^［10］以及应对盐碱胁迫^［11-14］等方面，有关大豆PP2Cs在共生固氮中的作用研究较少。费氏中华根瘤菌（HH103）Ⅲ型效应器结瘤外蛋白NopL是HH103的T3SS效应子，已被证明在HH103侵染大豆期间抑制大豆PP2C家族蛋白成员Glyma.07g099700的表达^［15］。另一个效应子NopD可以影响根瘤菌侵染后Glyma.19g069200基因的表达，并且不同类型的Glyma.19g069200单倍型可以引起显著的根瘤表型差异^［16］。研究表明在根瘤菌与大豆共生关系建立的过程中，根瘤菌效应子Nops通过直接或间接作用于大豆PP2C家族蛋白来促进根瘤菌的侵染。前期克隆了另一个大豆蛋白磷酸酶基因GmPP2C28，发现其在大豆的根和根瘤中表达水平较高，且受根瘤菌诱导表达，推测其可能参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程^［17］。

本研究通过在豆科模式植物百脉根中异源表达GmPP2C28基因，明确其在百脉根共生固氮过程中发挥的作用，为该类基因参与调控结瘤固氮的研究提供分子生物学证据，也为高效固氮百脉根新品种的创制提供新的有效候选基因。

1 材料与方法

1.1 基因编码蛋白的结构分析

分别使用NCBI（CD-Search）、NetPhos-3.1、TMHMM-2.0以及SWISS-MODEL对蛋白质序列进行保守结构域、磷酸化位点、跨膜结构域分析以及3D结构预测构建。

1.2 植物材料和生长条件

氯气灭菌后的栽培大豆种子（W82），均匀包裹于报纸的上端，报纸下端插入蒸馏水中，保持报纸湿润，培养温度为26 ℃，待种子萌发。4~5 d后打开报纸，将大豆根部组织浸泡于大豆根瘤菌（BXYD3）悬液中。1~2 h后移栽入花盆中，28 ℃，光照/黑暗（16 h/8 h）继续培养。期间收集接种前的大豆根作为对照，接种后1、3、7、14、21、28 d的根以及14、21、28、35、42、49 d的根瘤，液氮速冻后保存于超低温冰箱。2023年3-6月完成收样工作，试验重复3次。试验地点位于信阳师范大学生命科学学院温室内。

1.3 植物过表达载体的构建

设计引物F-OX和R-OX（表1），引入EcoR I/Sma I酶切位点，将GmPP2C28基因（Glyma.06g050900）插入植物过表达载体p1302G中，构建重组质粒p1302G-GmPP2C28，测序正确后转入发根农杆菌LBA1334中备用。2023年7月完成。

1.4 百脉根的发状根转化

百脉根种子（MG20）在无菌锥形瓶中经次氯酸钠处理后，加入少许无菌蒸馏水，待其萌发。参照文献［18］方法制备百脉根外植体并进行毛状根转化。具体如下：通过冻融转化法将重组质粒p1302G-GmPP2C28以及空载体对照转入发根农杆菌LBA1334中。将准备好的外植体下胚轴浸入农杆菌菌悬液中，侵染30 min；无菌滤纸吸干外植体表面残液后，移入含2%蔗糖的MS平板上，暗培养3~5 d；将外植体移入含300 mg·L^-1头孢的MS培养基，母液配方：1.大量元素母液（10X，1 L） KNO₃，1 g，MgSO₄· 7H₂O，3.7 g，NH₄NO₃，16.5 g，KH₂PO₄，1.7 g，CaCl₂·2H₂O，4.4 g；2.微量元素母液（1000 X，100 mL），MnSO₄·4H₂O，2.23 g，H₃BO₃，0.62 g，ZnSO₄·7H₂O，0.86 g，KI，83 mg，CuSO₄·5H₂O，2.5 mg，Na₂MoO₄·2H₂O，25 mg（单独溶解后混合），CoCl₂·6H₂O，2.5 mg；3.铁盐（200 X，100 mL），Na₂·EDTA，746 mg，FeCl₃·6H₂O，54 mg，加热溶解；4.维生素及其他有机物（100 X，100 mL），甘氨酸（glycine），20 mg，烟酸（nicotinic acid），5 mg，盐酸硫胺素（VB1，thiamine·HCl），4 mg，盐酸吡哆辛（VB6，pyridoxin·HCl），5 mg，肌醇（M-inositol），1000 mg。待毛状根长至3~4 cm时，配制GUS染液鉴定阳性毛状根。随机挑选部分阳性毛状根，检测GUS及GmPP2C28基因的表达情况。2023年8-10月完成转化，试验重复3次。

1.5 发状根的结瘤表型观察

选择生长状态一致的阳性嵌合体百脉根植株，将根部组织浸泡于根瘤菌（MAFF303099）菌悬液中，1~2 h后移栽入含无菌蛭石的盆钵中，22 ℃，光照/黑暗（16 h/8 h），其间浇灌无氮营养液。接种28 d后，将植株根部蛭石洗净，统计结瘤数目并拍照，n=15。2023年11月-2024年5月完成表型统计，试验重复3次。

1.6 荧光定量PCR分析

基因表达水平使用天根公司荧光定量PCR试剂盒进行检测，并计算结果（2^-∆∆Ct）^［19］。以百脉根多聚泛素UBI（Polyubiquitin，XM_057568040）作为内参基因，引物见表1。试验结果分析使用Excel 2007软件。2024年6月完成，试验重复3次。

1.7 根瘤切片的观察及固氮酶活性的测定

按照文献［20］中的具体方法进行根瘤石蜡切片的制备和甲苯胺蓝染色。分别选取对照组及试验组毛状根基部相同位置的5个根瘤，每个样品随机选取4张染色后的切片，用于统计单位面积侵染细胞的数目（n=20）。采用乙炔还原法测定根瘤的固氮酶活性^［21］，并根据以下公式计算乙烯生成速率（µmol·g^-1·h^-1）。Rate为乙烯生成速率，X为样品测定的乙烯峰面积，FW为根瘤样品的鲜重。2024年5-8月完成，试验重复3次。

Rate=\frac{(\mathrm{0.0002}X+\mathrm{111.66})\times \mathrm{8}}{\mathrm{2}\times \mathrm{28.06}\times \mathrm{1000}\times FW}

1.8 数据处理

数据的平均值和SE是通过Microsoft Excel 2007软件计算的。使用Microsoft Excel 2007中的Student t检验确定试验组和对照组之间的显著差异。

2 结果与分析

2.1 GmPP2C28蛋白的生物信息学分析

GmPP2C28（Glyma.06g050900）是大豆PP2C最大亚家族E中的一个成员，对GmPP2C28蛋白质序列进行保守结构域分析，发现其具有典型的PP2C家族保守结构域（图1A）。采用同源建模的方法，对GmPP2C28蛋白质序列进行3D结构预测及构建，如图1B所示，在GmPP2C28蛋白的三维结构中，α螺旋肽段处于结构外围，而β片层组成的三明治结构（β-sandwich）作为催化部位处于结构中心，据此形成一个“Y”字母图形，以保证酶与底物结合的稳定性。对GmPP2C28蛋白质序列进行磷酸化位点分析，发现在GmPP2C28蛋白质中存在多个可能的磷酸化修饰位点，其中，丝氨酸（serine，Ser）可能发生磷酸化修饰的位点最多，有20个，苏氨酸（threonine，Thr）和酪氨酸（tyrosine，Tyr）分别有10和2个，说明该蛋白可能受到磷酸化修饰，并在信号转导过程中发挥调控作用（图1C）。

2.2 GmPP2C28基因的表达水平分析

分别收集接种根瘤菌后不同时期大豆根以及根瘤组织样品，用于检测GmPP2C28基因的表达水平。在接种根瘤菌的根组织中，GmPP2C28基因呈现缓慢上升的趋势，至接种28 d时，表达水平为对照的16倍。与此同时，在根瘤形成过程中，GmPP2C28基因的表达水平呈现先升高再降低的趋势，在接种后28 d时达到峰值，随后回落到接种早期水平（图2）。结果表明GmPP2C28基因在根瘤成熟期表达水平较高，推测其可能参与调控根瘤发育。

2.3 转GmPP2C28基因百脉根毛状根的鉴定

将植物过表达载体GmPP2C28-p1302G转入发根农杆菌LBA1334，用于百脉根的遗传转化。对毛状根进行GUS染色，结果如图3A所示，箭头所指为变蓝的阳性毛状根。随机挑选部分阳性毛状根进行PCR检测，在转GmPP2C28基因以及空载体毛状根中均检测到GUS基因的表达，而野生型对照中没有出现目的条带（图3B）。进一步对阳性毛状根进行RT-PCR检测，发现在转GmPP2C28基因毛状根中均能检测到GmPP2C28基因的表达，而野生型和空载体对照中都未出现目的基因条带（图3C）。以上结果表明GmPP2C28基因已经成功表达于嵌合体百脉根阳性毛状根中。

2.4 过表达GmPP2C28增加百脉根的结瘤数目

对接种根瘤菌28 d后的转基因植株进行结瘤表型统计发现，转GmPP2C28基因试验组的单株平均结瘤数为18.9个，显著高于空载体对照组的10.1个（图4A，B）。荧光定量PCR检测转基因毛状根中结瘤指示基因LjNIN、LjENOD40-1和LjENOD40-2的转录水平，发现其在转GmPP2C28基因毛状根中均上调表达（图4C）。结果表明GmPP2C28基因在百脉根中的异源表达能够显著上调结瘤指示基因的表达，从而增加嵌合体百脉根的结瘤数目。

2.5 过表达GmPP2C28增加根瘤中侵染细胞的数量

对接种根瘤菌28 d后的转基因植株根瘤切片进行染色观察发现，在侵染区的中心部位，GmPP2C28-OX试验组的侵染细胞排列更密集，而空载体对照组的侵染细胞排列较松散（图5A~D）。统计学分析发现，与对照相比，过表达GmPP2C28显著增加了单位面积内侵染细胞的数量（P<0.05，图5E）。

2.6 过表达GmPP2C28提高根瘤的固氮酶活性

分别收集嵌合体百脉根接种28和49 d的根瘤，通过乙炔还原法测定不同时期根瘤的固氮酶活性。图6结果显示，接种28 d时，GmPP2C28-OX组根瘤的固氮酶活性显著高于对照组（P<0.05）；接种49 d时，GmPP2C28-OX组和对照组根瘤的固氮酶活性都随接种时间的延长而降低，但GmPP2C28-OX组根瘤的固氮酶活性仍显著高于对照组（P<0.01），表明过表达GmPP2C28显著提高了成熟期以及衰亡期根瘤的固氮酶活性，从而大大延缓了嵌合体百脉根根瘤的衰老。

3 讨论

已在多个植物物种中鉴定出PP2C家族成员，该家族蛋白具有高度保守的结构特征^［22-25］。植物PP2C蛋白的C末端具有保守的催化结构域，N末端延伸区长度的不同赋予了PP2C不同的功能^［26］。PP2C家族蛋白多定位于细胞浆和细胞核，可以特异性的结合多种底物进行去磷酸化修饰作用^［27］。本研究使用TMHMM-2.0软件对GmPP2C28蛋白质序列进行跨膜结构域分析，未发现蛋白质序列中存在跨膜结构域，提示该蛋白可能存在于细胞质或细胞核中，这与文献［27］报道一致。

PP2C 通过催化蛋白质去磷酸化，负调控蛋白激酶级联信号系统，参与一系列细胞生命活动^［28-29］。在动物细胞中，PP2C 家族成员PPM1A可通过去磷酸化MKK4/7以及 MKK3/6b激酶，抑制由环境压力引起的p38 和 JNK /MAPK 激酶级联通路的激活^［30］。PPM1A 也能够与应激状态下的p38 互作，从而抑制炎症和凋亡反应^［31］。因此，PPM1A可以选择性地抑制不同的细胞应激信号通路^［32］。同样地，在植物中，PP2C蛋白也能够与许多信号通路相互作用，共同调节植物对内外部环境的响应。研究发现水稻（Oryza sativa）PP2C基因OsBIPP2C1在转基因烟草（Nicotiana tabacum）中的过表达可以抑制病原体感染并增强非生物耐受性^［33］。GmPP2C3a是大豆PP2C蛋白家族的成员，被鉴定为一种能够抑制病毒感染和传播的抗病毒蛋白^［34］。早期的研究表明，PP2Cs负调控酵母和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路^［35］，以及由细菌鞭毛蛋白触发的MAPK通路^［36］。MAPK途径可能参与建立根瘤菌共生关系，因为MAPK途径基因之一MtTDY1已被证明与根瘤形成有关，并调节根尖的发育^［37］。在白羽扇豆（Lupinus albus）中，根瘤菌可以激活MAPK基因SIMK和SAMK，SIMK和SAMK的突变体抑制了根瘤菌的感染^［38］。在大豆中，GMK1已被鉴定为MAPK同源物，其表达与日本慢生根瘤菌USDA110的感染有关^［39］。百脉根LjPP2C可以与MPK6激酶互作参与调控共生固氮^［9］。这些结果表明，PP2C可以参与调节根瘤共生固氮。然而，进一步的研究对于充分阐明其功能及相互作用机制至关重要。

本研究通过在百脉根中异源表达GmPP2C28基因，显著增加了嵌合体百脉根植株结瘤数目以及根瘤中类菌体的数量。此外，过表达GmPP2C28显著提高了成熟期以及衰亡期根瘤的固氮酶活性，从而大大延缓了根瘤的衰老。推测GmPP2C28可能通过去磷酸化抑制根瘤衰老相关蛋白的活性，从而抑制根瘤细胞的衰亡。因此，下一步可以通过酵母双杂交技术筛选GmPP2C28的互作蛋白，探索二者在结瘤信号传递过程中的蛋白互作机制。此外，可以通过百脉根稳定转化体系获得GmPP2C28基因的过表达材料，这将进一步明确该基因的生物学功能，也将为培育出延缓根瘤衰老且固氮能力强的百脉根新品种提供有效的候选材料。

4 结论

本研究以大豆蛋白磷酸酶基因GmPP2C28为对象，在百脉根中过表达该基因能够增加百脉根结瘤数目并延缓根瘤的衰老，表明GmPP2C28基因正调控百脉根的结瘤固氮过程。本研究为高效固氮百脉根新品种的创制提供了基因资源，对共生固氮分子机理的研究和育种都具有重要意义。

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基金资助

国家自然科学基金项目(U1904102)

信阳师范大学“南湖学者奖励计划”青年项目和信阳师范大学研究生科研基金项目资助