长穗偃麦草响应NaHCO₃胁迫的离子平衡机制及转录组分析

Ion balance mechanism and transcriptome analysis of Elytrigia elongata in response to NaHCO₃ stress

摘要

长穗偃麦草因其较强的耐盐碱能力常被广泛用于建植盐碱地牧场。为探究其响应盐碱胁迫的离子平衡机制，本研究以长穗偃麦草‘Orbit’为试验材料，设置150 mmol·L^-1的NaHCO₃溶液人工模拟碱胁迫，测定了幼苗生长指标及矿质离子（Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄^2-和NO₃^-）含量，并利用高通量Illumina Hiseq测序技术对正常处理（CK）和胁迫24 h NaHCO₃处理下的叶片和根系进行了转录组学分析。结果表明：NaHCO₃胁迫下，长穗偃麦草幼苗根系生物量显著增加，根冠比增大。转录组结果表明，NaHCO₃处理下叶片中有1833个差异基因（different expression genes， DEGs），根系中有1536个DEGs，140个基因在叶片和根系中均差异表达。GO和KEGG富集分析发现，叶片和根系中的DEGs均显著富集在与抗氧化相关、离子结合相关、苯丙氨酸和苯丙烷类生物合成等代谢通路；离子结合通路相关DEGs包括BAK1、CIPK10、STRK1、WAK8及多条laccase基因（laccase-11和laccase-3）等，可能参与了长穗偃麦草对NaHCO₃胁迫的响应过程。此外，生理试验结果进一步证明长穗偃麦草叶片和根系的离子转运与分配受到影响，表现为Na⁺大量积累，而对K⁺的吸收能力下降，K⁺/Na⁺下降，根系通过提高对其他阳离子（如Ca²⁺、Mg²⁺和Fe³⁺）的吸收及分配能力来保持体内营养均衡，以更好地适应盐碱环境。本研究结果可为牧草及其他作物耐盐分子育种提供优异基因资源，还可为长穗偃麦草推广及盐碱地改良利用提供理论依据。

Abstract

Elytrigia elongata， due to its strong salt-alkali tolerance， is widely used to establish salt alkali pastures. This research explored the ion balance mechanism of E. elongata in response to salt-alkali stress， using the cultivar ‘Orbit’ as the experimental material， and 150 mmol·L^-1 NaHCO₃ to simulate alkali stress. The growth indexes and mineral contents （Na⁺， K⁺， Ca²⁺， Mg²⁺， Cl^-， SO₄^2- and NO₃^-） of seedlings were determined， and high-throughput Illumina Hiseq sequencing technology was used to perform transcriptomic analysis on leaves and roots after exposure to contrasting normal （CK） growth conditions and NaHCO₃ treatment for 24 hours. It was found that the root biomass and root-shoot ratio of E. elongata increased significantly under NaHCO₃ stress. RNA-Seq results showed that there were 1833 differentially expressed genes （DEGs） in the leaves and 1536 DEGs in the roots under NaHCO₃ treatment， and 140 genes were differentially expressed in both leaves and roots. GO and KEGG enrichment analysis revealed that DEGs in leaves and roots were significantly enriched in metabolic pathways related to antioxidant synthesis， ion binding， and phenylalanine， and phenylpropanoid biosynthesis. DEGs related to ion binding pathways included BAK1， CIPK10， STRK1， WAK8， and multiple laccase genes （laccase-11 and laccase-3）， which may be involved in the response process of E. elongata to NaHCO₃ stress. In addition， physiological test results further demonstrate that the ion transport and distribution in the leaves and roots of E. elongata are affected. This was evidenced by a large accumulation of Na⁺ and a decrease in ability to absorb K⁺， resulting in a decrease in the ratio of Na⁺∶K⁺. The roots maintained tissue ion balance by improving the absorption and distribution capacity of other cations such as Ca²⁺， Mg²⁺ and Fe³⁺， so as to better adapt to the saline-alkali environment. The results of this study identify specific genes involved in salt-tolerance， and will be useful to inform molecular breeding of forage and other crops. These results also provide a theoretical underpinning for the promotion of E. elongata and the improvement and utilization of saline-alkali land.

Graphical abstract

关键词

碱胁迫 / 长穗偃麦草 / 差异表达基因 / 离子稳态

Key words

alkali stress / Elytrigia elongata / differentially expressed gene / ion homeostasis

土壤盐碱化是限制全球农业生产并造成环境危害的主要问题之一^［1］。土壤中高浓度的Na⁺是盐胁迫的主要诱因，植物细胞质中高浓度的Na⁺会扰乱质膜转运蛋白的正常功能，阻碍或破坏植物对水分及其他营养离子如K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺等的吸收，影响其正常生理代谢^［2］。其通过破坏植物细胞中的离子稳态和水势平衡进而诱导渗透胁迫和离子损伤，引起植物毒性，使植物生长减弱，最终导致死亡^［3］。而碱性土壤不仅会引起离子毒性或伤害，还会引起CO₃^2-/HCO₃^-胁迫和高pH胁迫^［4］。植物摄入大量的Cl^-、SO₄^2-、HCO₃^-、CO₃^2-等离子会降低对NO₃^-和H₂PO₄^-等离子的吸收，破坏体内离子平衡。

根系是吸收养分和水分的重要器官，也是最早感知胁迫信号并最直接受害的部位^［5］，根系吸收的盐分在蒸腾流中经过长距离运输到枝条，并最终在叶片中积累。此外，植物已进化出多种机制来缓解或抵御盐碱胁迫，如Na⁺区隔化、调控离子选择性吸收及分配等^［6-7］。维持细胞质中稳定的K⁺/Na⁺是耐盐植物的一个重要适应特征，其可以通过减少细胞质Na⁺和增加细胞质K⁺来获得，以防止细胞损伤和营养缺乏^［3］。Imen等^［8］对罗勒（Ocimum basilicum）进行NaCl和Na₂SO₄胁迫后发现，其叶片、茎秆和根系中的K⁺/Na⁺和Ca²⁺/Na⁺均相比对照显著增高。对平欧杂种榛（Corylus heterophylla×C. avellana）进行NaCl胁迫发现，叶片中Na⁺和Cl^-的绝对含量显著高于茎和根，且这两种离子在根系中的增幅最大，表明根系首先会吸收并截留一定数量的Na⁺和Cl^-，然后再将其运输至茎和叶中^［9］。目前对盐胁迫下离子吸收的研究大多主要集中在NaCl、Na₂SO₄等中性盐上，对碱性盐如Na₂CO₃、NaHCO₃等胁迫下植物矿质离子转运吸收的研究较少，徐曼^［10］研究发现长穗偃麦草（Elytrigia elongata）在NaCl和Na₂CO₃胁迫下，随着胁迫浓度的上升，Na⁺含量及Na⁺/K⁺均呈现上升趋势，进行单一NaHCO₃胁迫后发现，150 mmol·L^-1的浓度会显著降低其发芽率和发芽势，严重影响其正常生长发育，但对其无机离子含量的研究并未见报道。

植物对盐碱胁迫的感知是通过各种传感器进行的，进而启动一系列转录变化，以产生保护性蛋白质和代谢产物^［11］。随着二代高通量RNA-seq测序技术的发展，研究人员对盐胁迫下植物信号转导、次生代谢、氧化还原酶途径等各个层面都进行了广泛的研究^［12-13］，但利用转录组技术研究长穗偃麦草对盐碱胁迫的耐受机制仍缺乏相关信息。因此，本研究不仅对长穗偃麦草不同器官矿质离子的选择性吸收、运输、分配机制进行了详细探索，还利用转录组技术分析挖掘了抗逆性调控候选基因，以期为全面解析长穗偃麦草对盐碱胁迫的耐受机制提供数据支撑，为长穗偃麦草耐盐育种及其在我国沿海滩涂等地区的大面积种植推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

长穗偃麦草‘Orbit’品种购自北京百斯特草业有限公司。

1.2 试验处理

试验于2024年6月在中国林业科学研究院温室进行，将长穗偃麦草品种‘Orbit’的种子进行清选，去除干瘪的种子后种于育苗钵内（直径6 cm×高14 cm），采用沙培法育苗^［14］，温室温度保持在25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），相对湿度为50%，待95%的种子发芽后开始浇灌Hoagland营养液，每3 d更换一次。连续培养25 d（3~4叶期）后进行处理，对照组（CK）继续浇灌Hoagland营养液，胁迫组浇灌溶有150 mmol·L^-1 NaHCO₃ 的Hoagland营养液，分别于处理1 d时采集叶片和根系，液氮速冻后放入-80 ℃超低温冰箱保存用于后续转录组测定，每个处理3个重复，连续胁迫9 d后收集植株地上部和根系。

1.3 生长指标测定

分别采集CK和NaHCO₃处理第9天的长穗偃麦草幼苗，10株混合为一个重复，每个处理3次重复，测定后取平均值。吸干植株上的水分，将根系和地上部分开称取鲜重，然后将其放入105 ℃烘箱中杀青30 min，70 ℃烘干至恒重后测定干重，并计算根冠比。根冠比=（地下部分干重/地上部分干重）×100%^［15］。

1.4 离子含量测定

将烘干至恒重的植物材料（叶片和根）用小型粉碎机（BF-08，河北）磨碎，过0.28 mm筛，每个样品3次重复，各取0.5 g（精确至0.0001 g）用硝酸-高氯酸混合液消煮，分离二氧化硅定容后的同一待测液，利用火焰光度法^［16］测定Na⁺和K⁺含量，利用原子吸收分光光度计GGX-600（北京）测定其他阳离子（Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺）含量。阴离子Cl^-和SO₄^2-采用滴定法测定^［17-18］；NO₃^-含量采用硝基水杨酸比色法测定^［19］。计算不同器官对矿质离子的运输能力（S_{X， Na/Cl}），公式为 S_{X， Na/Cl}=库器官［X/Na⁺（Cl^-）］/源器官［X/Na⁺（Cl^-）］，式中，若计算阳离子运输能力，X为Ca²⁺含量或Mg²⁺含量或Fe³⁺含量或Cu²⁺含量，若计算阴离子运输能力，X为SO₄^2-含量或NO₃^-含量，S_{X， Na/Cl}数值越大，表明源器官控制Na⁺或Cl^-、促进营养元素向库器官的运输能力越强，即库器官的选择性运输能力越强^［20］。

1.5 RNA提取及转录组测定

采用RNA Easy Fast 植物组织 RNA 快速提取试剂盒（DP452）对处理1 d的CK和NaHCO₃叶片和根系进行RNA提取，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性及是否存在DNA污染，使用NanoPhotometer spectrophotometer检测RNA纯度，使用Agilent 2100 bioanalyzer精确检测RNA完整性。对符合要求的RNA进行高通量文库构建，测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成，参考基因组为二倍体长穗偃麦草（Thinopyrum elongatum）^［21］，对下机的 raw reads利用fastp进行质控，过滤低质量数据，得到clean reads。使用DESeq Bioconductor Package进行两个组的差异表达分析，基于负二项分布模型确定差异表达，使用Benjamini和Hochberg控制错误发现率，将|log₂ fold change|>1和P<0.05的基因指定为差异表达基因^［14］。

1.6 Gene Ontology （GO）富集分析及KEGG富集分析

GO富集分析是将差异表达基因（different expression genes， DEGs）映射到GO数据库中，对差异基因进行富集归类^［22］，并用超几何分布检验方法^［23］计算每个 GO 条目中差异基因富集的显著性。筛选3种分类中对应基因数目大于2的GO条目，按照每个条目对应的-log₁₀ （Q value）由大到小排序，绘制 GO 富集分析top 20气泡图。

KEGG 是有关 Pathway 的主要公共数据库，利用 KEGG 数据库对差异表达基因进行 Pathway分析，并用超几何分布检验的方法^［23］计算每个 Pathway 条目中差异基因富集的显著性。筛选对应基因数目大于 2 的 pathway 条目，按照每个条目对应的-log₁₀ （Q value）由大到小排序，绘制 KEGG 富集分析 top 20气泡图。

1.7 数据统计与分析

采用SPSS 24.0 Windows版（SPSS Inc.， USA）进行数据分析，用平均值±标准误表示测定结果，对照组和处理组各指标采用t检验，采用GraphPad Prism 8.0.2作图，采用TB tools绘制差异基因表达数目图、韦恩图和热图。

2 结果与分析

2.1 NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草幼苗生物量和含水量的影响

由表1可见，NaHCO₃处理降低了长穗偃麦草地上部干重及地上部、地下部含水量，且与对照处理差异显著（P<0.01），而根系干重和根冠比在NaHCO₃处理下均相比对照处理极显著增加（P<0.01）。

2.2 NaHCO₃胁迫下长穗偃麦草叶片和根系转录组测序结果分析

2.2.1 差异表达基因分析

如图1A所示，与对照组相比，NaHCO₃处理下叶片中共有1833个DEGs（CK_L vs NaHCO₃_L），其中上调表达的DEGs有1263个，下调表达的DEGs有570个，上调表达数量是下调数量的2.22倍；相比对照，NaHCO₃处理下根系DEGs共有1536个（CK_R vs NaHCO₃_R），其中上调表达的DEGs有860个，下调表达的DEGs有676个；叶片中表达的总DEGs数量高于根系。此外，利用韦恩图表示长穗偃麦草NaHCO₃胁迫后叶片和根系中差异表达的DEGs数量，由图1B可以看出，有140个基因在叶片和根系中均差异表达。

2.2.2 KEGG富集通路分析

与对照处理相比，NaHCO₃胁迫处理下叶片（CK_L vs NaHCO₃_L）和根系（CK_R vs NaHCO₃_R）中DEGs的KEGG富集通路如图2所示，叶片和根系均显著富集的通路有亚油酸代谢、抗坏血酸和醛固酮代谢通路、DNA复制、同源重组及错配修复通路，除此之外，叶片中的大量DEGs还富集在二萜生物合成、类固醇、甜菜碱、多种生物碱生物合成通路及苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸代谢通路（图2A）；根中差异基因富集分数最高的代谢通路是苯丙烷类生物合成，富集DEGs数量最多的是代谢途径，如氮代谢、谷胱甘肽代谢和氰基氨基酸代谢等，此外，与植物光合作用相关的光合-天线蛋白、类胡萝卜素生物合成及花青素生物合成等通路均被显著富集（图2B）。

2.2.3 GO富集通路分析

与对照处理相比，NaHCO₃胁迫处理下叶片（CK_L vs NaHCO₃_L）和根系（CK_R vs NaHCO₃_R）中DEGs的GO富集分析如图3所示，并对前20名显著富集的通路进行了可视化，叶片和根系中的DEGs富集通路明显不同，叶片中DEGs主要富集在ADP结合、核苷酸结合、蛋白激酶活性、碳水化合物衍生物结合相关通路，除此之外，还有大量DEGs显著富集于离子结合相关的通路上，主要是阴离子结合通路（图3A）；而根系中DEGs主要富集的通路包括：铜离子结合、铁离子结合等阳离子结合相关通路、四吡咯结合、血红素结合等，此外，差异基因还富集在一系列酶活性相关的通路，其中含有11条与氧化还原酶活性相关的通路，1条四膜醇环化酶活性相关通路，富集比例最高的是对苯二酚∶氧化还原酶活性，此外，DEGs富集数量最多的是催化活性相关通路（图3B）。

2.2.4 离子结合相关差异基因的表达分析

基于GO富集分析结果，对叶片中的阴离子结合通路和根系中的铜离子结合、铁离子结合相关通路的差异基因进一步分析，挑选出13条NaHCO₃胁迫处理下长穗偃麦草离子通道响应基因，如图4所示，叶片中共挑选出10条DEGs（图4A，C），上调表达的有6条，其中，Tel2E01G011400、Tel2E01G013300、Tel7E01G095200均编码NBS-LRR disease resistance protein，Tel2E01G963300编码BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1-like（BAK1），Tel4E01G307100编码CBL-interacting protein kinase 10-like （CIPK10），Tel5E01G125100编码light-inducible protein CPRF2-like，下调表达的有4条，分别是Tel1E01G317000、Tel2E01G984000、Tel7E01G839500和Tel3E01G506500，编码的基因分别是salt tolerance receptor-like cytoplasmic kinase 1（STRK1）、wall-associated receptor kinase-like 8 isoform X1（WAK8），GTP-binding protein OBGM， mitochondrial isoform X2和cytokinin dehydrogenase 5 （CKX5）；根系中挑选3条DEGs（图4B，C），均为漆酶laccase基因，且均表现为下调表达；这些基因在长穗偃麦草响应NaHCO₃胁迫的离子结合通路中发挥着重要作用。

2.3 NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草离子分配和阴阳离子平衡的影响

2.3.1 NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草体内阴阳离子含量的影响

NaHCO₃胁迫处理下，长穗偃麦草体内阳离子含量的变化如图5A~F所示。胁迫处理后叶片和根系的Na⁺含量相比对照均极显著增加（P<0.001），且根系中积累的Na⁺更多，是对照处理Na⁺含量的4.79倍（图5A），而K⁺含量呈现相反的变化趋势，均极显著低于对照处理（P<0.001）（图5B）。NaHCO₃胁迫处理对叶片和根系中Ca²⁺和Mg²⁺含量的影响一致，均表现为叶片中较对照处理含量显著降低，而根系中这两个离子的含量相比对照显著升高（图5C，D）。此外，与对照相比，长穗偃麦草受胁迫后表现为叶片和根系对Fe³⁺和Cu²⁺吸收的增加（图5E，F）。

NaHCO₃胁迫处理下，长穗偃麦草体内阴离子含量的变化如图6A~C所示。相比对照处理，NaHCO₃处理显著降低了叶片和根系中Cl^-和NO₃^-的含量（图6A，B），其中，叶片Cl^-和NO₃^-含量相比对照分别减少24.26%（P<0.01）和37.19%（P<0.001），根系Cl^-和NO₃^-含量相比对照分别减少24.41%（P<0.05）和53.18%（P<0.01），而叶片和根系对SO₄^2-含量的吸收未受到显著影响（图6C）。

2.3.2 NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草体内离子分配的影响

植物细胞离子平衡被破坏是盐胁迫下植物生长受抑制的主要原因之一，由表2可以看出，在NaHCO₃处理下，长穗偃麦草叶片和根系中的各阳离子/Na⁺与对照相比均显著降低，这些结果表明盐胁迫下长穗偃麦草对Na⁺的相对吸收大幅增加，而对营养元素的吸收相对减少。其中，相比对照而言，K⁺/Na⁺和Cu²⁺/Na⁺在叶片和根系中的降低比例基本一致，且差异极显著（P<0.001），而Mg²⁺/Na⁺和Fe³⁺/Na⁺在叶片与根系中降低水平差异较大，叶片中相比对照分别降低82.28%、66.67%，根系中这两个比值相比对照分别降低52.63%、38.20%，表明在胁迫处理下植物不同组织间对各离子的吸收也存在一定差异。

2.3.3 NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草体内离子运输的影响

由表3可以看出，NaHCO₃胁迫下，根系向叶片运输的S{}_{\mathrm{C}{\mathrm{a}}^{\mathrm{2}+},\mathrm{N}{\mathrm{a}}^{+}}、S{}_{\mathrm{M}{\mathrm{g}}^{\mathrm{2}+},\mathrm{N}{\mathrm{a}}^{+}}和S{}_{\mathrm{F}{\mathrm{e}}^{\mathrm{3}+},\mathrm{N}{\mathrm{a}}^{+}}值相比对照均显著升高（P<0.01），且由根向叶片选择性运输 Fe³⁺的能力高于对 Mg²⁺、Ca²⁺的运输，而根向叶片运输的S{}_{{\mathrm{K}}^{+},\mathrm{N}{\mathrm{a}}^{+}}和S{}_{\mathrm{C}{\mathrm{u}}^{\mathrm{2}+},\mathrm{N}{\mathrm{a}}^{+}}值相比对照显著降低（P<0.01），这些结果表明NaHCO₃胁迫对长穗偃麦草由地下部分向地上部分的阳离子选择性运输产生了一定的影响，尤其促进了对微量元素Fe³⁺的运输能力，相比对照提高了91.3%。此外，研究发现，胁迫处理根系向叶片运输的S{}_{\mathrm{N}{{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}}^{-},\mathrm{C}{\mathrm{l}}^{-}}值与对照处理差异不显著，而S{}_{\mathrm{S}{{\mathrm{O}}_{\mathrm{4}}}^{\mathrm{2}-},\mathrm{C}{\mathrm{l}}^{-}}值相比对照显著降低，表明根系向叶片运输SO₄^2-的能力显著下降（P<0.05）。

3 讨论

植物在遭受盐胁迫后，其正常的生长发育会受到抑制或影响，植物会通过主动调节相关生理代谢，以保护自身免受胁迫造成的损伤，这些调节方式包括但不限于平衡离子浓度调节渗透势，改变信号离子调控以及调整表观形态等^［24-25］。植物生长指标是反映其受盐害程度的重要指标，刘萱等^［26］的研究结果显示，盐胁迫显著抑制了甘草（Glycyrrhiza uralensis）幼苗的生物量积累，且根冠比随着盐胁迫程度的增大而呈现增高趋势，本研究结果与其类似，NaHCO₃胁迫下长穗偃麦草的地上部干重及含水量均显著低于对照处理，表明长穗偃麦草幼苗地上部生长受盐胁迫抑制程度较大，此外，长穗偃麦草根系干重显著高于对照处理，根冠比数值增大，表明长穗偃麦草通过增加根系生物量的分配，最大限度地保留盐离子，控制其向地上部的转移。

转录组技术的运用为了解植物在盐胁迫下的基因表达调控网络和抗逆性调控机制的研究提供了重要线索^［27-28］。杨闯等^［29］对盐胁迫下的甘蓝型油菜（Brassica napus）进行了基因表达谱分析，发现盐胁迫响应后期，根系中的差异基因GO富集主要在对过氧化氢的响应、有机羟基化合物合成、钙离子平衡信号通路及木质素代谢相关的过程，本研究结果与其有相似之处。本研究对胁迫下叶片和根系进行了转录组分析、KEGG富集分析发现，叶片和根系中的DEGs还显著富集在抗坏血酸、苯丙氨酸、苯丙烷类生物合成等相关的代谢通路，已有研究表明，苯丙烷代谢作为植物重要的次级代谢途径之一，其代谢产物如木质素以及有机酸等均在调控植物适应逆境生长中发挥着重要作用^［30］。本研究GO富集分析发现，叶片中大量基因富集在碳水化合物相关通路，表明地上部可能通过调节一系列渗透物质来抵抗盐胁迫，根系中检测到的差异基因大量富集在与氧化还原相关的通路，表明长穗偃麦草根系通过不断调控氧化还原稳态以适应盐胁迫。叶片和根系中的差异基因均富集在离子结合相关通路，表明长穗偃麦草在受到盐胁迫后，离子稳态失衡，叶片和根系不断调整离子通路相关基因的表达以适应盐胁迫。此外，Vijayata等^［31］利用RNA-Seq技术，对盐碱胁迫下的水稻（Oryza sativa）进行差异表达基因分析，注释并验证了水稻根中与渗透调节（DREB2A和LEA3）和离子平衡（HKT2；1和SOS1）相关的超表达基因与抗盐胁迫有关。本研究主要针对离子结合通路也进行了重要耐盐候选基因的筛选，其中，筛选到一条STRK1基因显著差异表达，Zhou等^［32］对水稻的研究发现，STRK1可通过磷酸化和激活CatC调节体内H₂O₂平衡来改善盐胁迫及氧化胁迫的耐受性。此外，本研究中筛选出来的激素和钙信号相关基因CKX5、CIPK10和BAK1均被报道在植物早期信号的起始和感知中发挥必不可少的作用，与植物的抗逆关系密切^［33］。除此之外，本研究在根系中检测到多条漆酶基因下调表达，漆酶基因主要参与木质素聚合物的自由基形成，同时也在植物抗逆中起重要作用^［34］。研究发现，非生物胁迫（如盐、干旱和重金属）下，水稻OsLAC10可通过催化单木酚氧化产生木质素，且OsLAC10的过表达增强了其对铜的耐受性，抑制了植物根中铜的积累^［35］。木质素作为植物细胞壁的主要成分，可强化细胞壁的防水性能，在植物抵抗极端环境方面发挥着重要功能。因此，本研究结果表明，长穗偃麦草根系受盐胁迫后，木质素合成和细胞壁发育可能受到影响，进而影响了根系发育。

植物生长发育离不开各类矿质元素，矿质离子的平衡是植物抵抗盐碱胁迫的重要生理调节机制之一^［36］。无机渗透调节离子如Na⁺、K⁺、Ca²⁺和C1^-等的积累能够有效提高细胞渗透，防止细胞脱水；但浓度高时会造成离子毒害，尤其是Na⁺和Cl^-。由于K⁺、Na⁺具有相似的物理化学性质（离子半径和离子水化能量）导致二者会竞争细胞膜上的结合位点，但Na⁺并不能代替K⁺行使其生理生化功能，植物体内 K⁺大幅度减少会影响细胞内正常的代谢活动^［37］。Na⁺和K⁺的吸收和转运是植物耐盐性的关键，具有高K⁺/Na⁺的植物耐盐性更强^［38］。本试验结果显示，正常情况下，长穗偃麦草叶片和根系对K⁺的吸收能力较Na⁺强，而NaHCO₃胁迫后，叶片和根系中的Na⁺含量显著增加，有明显的积累现象，而对K⁺的吸收则显著下降，这表明长穗偃麦草也像其他耐盐碱植物一样采取同样的策略来提高耐盐性，通过牺牲 K⁺的吸收来换取 Na⁺积累的减少。此外，Han等^［39］提出，盐碱胁迫下，植物还会通过提高对微量元素的吸收及分配能力来保持体内营养均衡，以更好地适应盐碱环境。在本研究中，长穗偃麦草根系还增加了对其他阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺的吸收，这一结果有力地支持了Han等^［39］的观点。除此之外，Ca²⁺作为第二信使与盐碱胁迫显著正相关，盐碱胁迫下Ca²⁺含量的增加有助于提高植物的抗盐碱能力。曹小强等^［40］对NaHCO₃胁迫下油菜幼苗的Ca²⁺含量测定发现，盐胁迫能够显著降低叶片中的Ca²⁺含量，增加根系Ca²⁺吸收，本研究结果与其完全一致，表明长穗偃麦草能够通过调控植物组织间的Ca²⁺稳态以响应盐胁迫。另外，由于植物对 NO₃^-、SO₄^2-以及Cl^-的吸收都是通过相同的非选择性阴离子通道，因此过量的Cl^-可能会导致氮素以及硫素的缺乏^［29］。在本研究中，NaHCO₃胁迫能够显著抑制叶片和根系对Cl^-和NO₃^-的吸收，SO₄^2-吸收则不受影响，这可能是由于过量的HCO₃^-和CO₃^2-引起。本研究中，胁迫处理下叶片和根系中所有的阳离子/Na⁺均降低，表明NaHCO₃胁迫后，长穗偃麦草体内的离子吸收和转运均受到影响，离子平衡被打破。离子转运系数是反映离子向上选择性运输的指标^［41］，植物不同部位离子选择性运输的能力能够反映植物将营养离子（K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Fe³⁺和Cu²⁺等）向地上部分输送和将盐离子（Na⁺和Cl^-）控制在根中的能力，也可反映植物的抗盐性。在本研究中，NaHCO₃胁迫下，长穗偃麦草促进了Ca²⁺、Mg²⁺和Fe³⁺从根系向地上部运输的能力，尤其促进了对微量元素Fe³⁺的运输能力，这可能是由于K⁺和Cu²⁺运输能力下降，根系为维持植物正常生长的一种补偿机制。在转录组结果中，根系GO条目也主要富集在Fe³⁺和Cu²⁺结合相关通路，这一结果与根系离子吸收和转运的研究结果相呼应。

4 结论

本研究从生长、生理和转录水平上对长穗偃麦草抵抗NaHCO₃胁迫的机理进行了深入探索，结果表明，长穗偃麦草可通过增加根系生物量，增大根冠比来适应盐胁迫，RNA-seq分析结果表明，叶片和根系中大量差异表达基因均富集在与抗氧化相关、离子结合相关、苯丙氨酸、苯丙烷类生物合成等代谢通路，同时筛选到13条与离子结合相关的耐盐候选基因。此外，长穗偃麦草一方面可以通过牺牲K⁺的吸收，提高对Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺等营养离子的吸收来换取 Na⁺积累的减少以抵抗盐胁迫，另一方面通过增强Ca²⁺、Mg²⁺ 和Fe³⁺从根系向地上部运输的能力来补偿对K⁺和Cu²⁺运输能力的下降。本研究结果可为牧草及重要农作物的耐盐分子育种提供优异基因资源，还可为长穗偃麦草的栽培、推广和盐碱地资源的改良利用提供参考依据。

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基金资助

中国林业科学研究院基本科研业务费专项资金项目(CAFYBB2022XA002)

2023年国家草业技术创新中心（筹）重大创新平台建设专项(CCPTZX2023B01)