不同水平紫玉米花青素提取物对肉牛体外产气和瘤胃发酵的影响

Effect of different levels of purple maize anthocyanin extract on in vitro gas production and rumen fermentation in beef cattle

摘要

为研究紫玉米花青素提取物对肉牛体外产气和瘤胃发酵的影响，采用完全随机试验设计，在底物中添加0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的紫玉米花青素提取物，测定总产气量、动力学参数、挥发性脂肪酸、甲烷产量、纤维素酶活性及营养物质降解率等瘤胃发酵参数。结果表明：1）发酵72 h后，对照组总产气量显著高于0.6%花青素组（P<0.05）。2）对快速发酵部分的产气量，0.4%花青素组显著高于对照组（P<0.05）；产气速率随花青素添加水平的增加呈线性和二次曲线降低（P<0.05），且对照组显著高于其他4个花青素组（P<0.05）。3）乙酸和丁酸含量随花青素添加水平的增加均呈线性和二次曲线下降（P<0.05），且对照组均显著高于0.4%、0.6%和0.8%花青素组（P<0.05）；丙酸含量随花青素添加水平的增加呈线性和二次曲线上升（P<0.05），且对照组均显著低于花青素组（P<0.05）；乙酸/丙酸和甲烷产量均随花青素添加水平的增加呈线性或二次曲线降低（P<0.05），且花青素组均显著低于对照组（P<0.05）。4）羧甲基纤维素酶和纤维二糖酶在12 h随花青素添加水平的增加均呈线性和二次曲线升高（P<0.05），且0.8%花青素组显著高于其他4组（P<0.05）；同时，0.2%、0.4%、0.6%花青素组木聚糖酶在24 h显著高于对照组（P<0.05）。5）蛋白质降解率和酸性洗涤纤维降解率随花青素添加水平的增加均呈线性和二次曲线升高（P<0.05），且花青素组蛋白质降解率显著高于对照组（P<0.05）。综上可知，紫玉米花青素提取物可改善肉牛瘤胃发酵模式，提高丙酸含量、纤维素酶活性及营养物质降解率，降低瘤胃甲烷产量。本试验条件下，在肉牛饲粮中添加紫玉米花青素提取物适宜水平是0.4%。

Abstract

The object of this study was to investigate the effect of purple maize anthocyanin extract on in vitro gas production and rumen fermentation in beef cattle. A completely randomized design was used. Levels of 0， 0.2%， 0.4%， 0.6%， and 0.8% purple maize anthocyanin extract were added to the substrate， and total gas production， gas production kinetic parameters， volatile fatty acid， methane production， cellulase activity， and nutrient degradation rate were measured. It was found that： 1） Total gas production after fermentation for 72 h tended to be reduced where anthocyanin was added， and gas production at 72 h for the 0.6% anthocyanin group was significantly lower （P<0.05） than that of the control group. 2） By contrast， gas production from the immediately soluble fraction tended to be higher with anthocyanin present and was significantly higher （P<0.05） in the 0.4% anthocyanin group than in the control group. The gas production rate constant decreased with increase in the purple maize anthocyanin extract supplemental level， and the control group was significantly higher （P<0.05） than the other four anthocyanin groups， and the curve defining the trend across anthocyanin levels had both linear and quadratic significant （P<0.05） terms. 3） The contents of acetic and butyric acid at 24 h decreased with increase in added anthocyanin， with significant （P<0.05） linear and quadratic terms for the fitted curve. Accordingly， the contents of acetic and butyric acids in the control group were significantly higher （P<0.05） than those of the 0.4%， 0.6%， and 0.8% anthocyanin groups. In contrast， the content of propionic acid increased with increase in supplemental purple maize anthocyanin extract， with both linear and quadratic terms of the fitted curve being significant （P<0.05）， and accordingly， the content of propionic acid in the control group was significantly lower （P<0.05） than other anthocyanin groups. The acetic：propionic acid ratio and methane production both decreased with increase in the level of anthocyanin extract and in both cases the fitted curve had significant （P<0.05） linear and quadratic terms. Accordingly， acetic：propionic acid ratio and methane production in the anthocyanin groups were significantly lower （P<0.05） than that of the control group. 4） At 12 h fermentation time， carboxymethyl cellulose and cellobiase were increased with increase in the supplemental anthocyanin extract level and both linear and quadratic terms were significant （P<0.05）. Accordingly carboxymethyl cellulose and cellobiase levels in the 0.8% anthocyanin group were significantly higher （P<0.05） than in the other four groups. Meanwhile， the values of xylanase in the 0.2%， 0.4%， and 0.6% anthocyanin groups were significantly higher （P<0.05） than those in the control group at 24 h fermentation time. 5） Both crude protein degradation rate and acid detergent fiber degradation rate increased with increase in supplemental anthocyanin extract level， and linear and quadratic terms of the fitted curves were significant （P<0.05） increasing. Accordingly， the crude protein degradation rate in the anthocyanin groups was significantly higher （P<0.05） than that of the control group. Taken together， purple maize anthocyanin extract had the ability to improve rumen fermentation mode， increase propionic acid， cellulase activity， and nutrient degradation rate， and decrease methane production of beef cattle. Under the conditions of this experiment， the optimal purple maize anthocyanin extract level was 0.4%.

关键词

花青素 / 体外产气 / 瘤胃发酵 / 肉牛

Key words

anthocyanins / in vitro gas production / rumen fermentation / beef cattle

植物提取物以其天然、无抗药性、多功能等优点，成为反刍动物新型饲料添加剂研究的热点^［1］。Alexander等^［2］报道，植物提取物可提高反刍动物饲粮中能量与氮的利用效率，具有作为饲料添加剂的潜力。此外，植物提取物可降低奶牛瘤胃中乙酸/丙酸，提升丙酸浓度，抑制甲烷（methane， CH₄）产生^［3］。

花青素是植物体内重要的次级代谢产物，具有重要的生理功能和开发应用前景。研究表明，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗应激、促生长、免疫调节等生物学作用，是反刍动物优良的天然抗氧化剂^［4］。田亚原等^［5］研究指出，富含花青素紫玉米（Zea mays）秸秆青贮饲料可提升奶山羊的营养物质消化能利用率，增强血浆抗氧化参数，改善机体健康。Tian等^［6］报道，在饲粮中添加紫玉米花青素提取物可显著提升丙酸与总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acid， TVFA）含量，降低乙酸/丙酸，改善瘤胃发酵参数。Suong等^［7］发现，肉羊饲喂富含花青素的黑甘蔗（Saccharum sinense），可显著降低瘤胃产甲烷菌，提高血液抗氧化能力，缓解机体的氧化应激状态。由此可见，花青素作为反刍动物优良的天然饲料添加剂，可改善机体的健康^［8］。

紫玉米是禾本科玉蜀黍属一年生植物，含有丰富的花青素，具有较高的开发利用价值^［9］。关岭牛作为贵州典型的喀斯特山区黄牛品种，是全国农产品地理标志，有肉质鲜美、耐粗饲、风味独特等优点，具有较高的研究价值^［10］。然而，目前鲜见花青素对肉牛瘤胃发酵影响的研究报道。因此，本试验通过体外发酵试验探究不同紫玉米花青素提取物添加水平对关岭黄牛累积产气量、动力学参数、瘤胃发酵参数、CH₄产量、纤维素酶及营养物质降解率的影响，为花青素作为天然抗氧化剂饲料添加剂在肉牛饲粮中的合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

体外产气试验于2024年7-11月在贵州大学动物科学学院动物营养与饲料研究所进行。

1.2 试验材料

试验方案通过贵州大学实验动物伦理分委员会（编号：EAE-GZU-2024-E027）审核，严格按照相关规则制度进行。紫玉米花青素提取物购于西安锐禾生物工程技术有限公司，经检测，其总花青素含量为2619 µg·g^-1［11］。

1.3 瘤胃液供体动物及饲养管理

在关岭自治县关岭牛投资发展有限责任公司，选择3只体况良好、体重相近［（425.0±12.15） kg］的关岭黄牛公牛作为瘤胃液供体。试验牛单栏栓系饲养，试验饲粮为全混合日粮，精粗比为40∶60，精料以玉米、豆粕、菜籽饼、麦麸为主，粗料为稻草（Oryza sativa）与皇竹草（Pennisetum sinese）（表1）。每天08：00和17：00各饲喂1次，牛只自由采食，自由饮水。于晨饲前通过负压真空泵（VP30，北京莱伯科泰有限公司）连接胃管式采样器从供体牛口腔抽取瘤胃液，丢弃前100 mL瘤胃液。每头牛采集400 mL瘤胃液，经4层纱布过滤后迅速装入预热的39 ℃保温瓶中，盖严瓶口，迅速带回实验室进行体外发酵试验。

1.4 底物与发酵残渣营养成分的测定

采用GB/T 6435-2014^［12］的方法测定底物（与基础饲粮相同）及其发酵残余物干物质（dry matter， DM）含量，采用GB/T 6432-2018^［13］的方法使用全自动凯氏定氮仪（KF1100，济南海能仪器股份有限公司，济南，中国）测定粗蛋白质（crude protein， CP）含量，采用Van Soest等^［14］的方法使用全自动纤维分析仪（FT12，格哈特，德国）测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber， NDF）与酸性洗涤纤维（acid detergent fiber， ADF）含量。采用GB/T 6438-2007^［15］的方法测定底物粗灰分（Ash），采用GB/T 6436-2018^［16］的方法测定钙含量，采用GB/T 6437-2018^［17］的方法测定总磷含量。

1.5 体外发酵试验设计

采用单因素完全随机试验设计，设置0（对照组）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%共5个紫玉米花青素提取物添加水平，每个添加水平6个重复，设置2、4、6、8、12、24、48、72 h共8个发酵时间点。人工唾液根据Menke等^［18］的方法制备，按1∶2向瘤胃液中加入人工唾液均匀混合，并持续通入CO₂。称取0.5 g发酵底物（与基础饲粮相同），吸取30 mL人工瘤胃液注入至每个产气管中，排净产气管中的空气，在39 ℃水浴摇床中培养，分别在8个设置的发酵时间点读取产气量。同时设置空白管（未加底物），将各发酵时间点的数值减去空白管数值，从而计算出相应发酵时间点的产气量（gas production， GP）。

1.6 产气动力学参数

产气试验结束后，将各底物不同发酵时间点产气量代入GP=a+b（1-e^-ct）模型^［19］，根据非线性最小二乘法原理，求出a、b、c值，式中：a为饲料快速发酵部分的产气量，b为慢速发酵部分的产气量，c为b的速度常数（产气速率），a+b为潜在产气量，t为底物发酵时间，GP为t时的产气量。

1.7 体外瘤胃发酵参数

在发酵培养12和24 h时，立即取出产气管放入冰水浴中，终止发酵。发酵液pH立即采用便携式酸度计（pH818，希玛仪表，东莞，中国）测定。氨态氮（ammonia nitrogen， NH₃-N）含量参考冯宗慈等^［20］的比色法测定。4种瘤胃液纤维素酶，包括羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、滤纸纤维素酶活性测定方法参照王加启^［21］的方法。

利用气相色谱（安捷伦科技有限公司，加利福尼亚，美国）测定瘤胃液挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），气相色谱参数：HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×250 µm×0.25 µm；安捷伦科技有限公司，加利福尼亚，美国），进样口温度为220 ℃，火焰离子化检测器温度为250 ℃，柱温以8 ℃·min^-1速度从80 ℃升高至200 ℃，进样体积为2 μL，载气为氦气，流速为4.0 mL·min^-1。VFA包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸；6种酸的总和为TVFA。此外，根据乙酸、丙酸、丁酸浓度，参照Moss等^［22］方法计算CH₄产量：CH₄产量（mmol·L^-1）=乙酸含量（mmol·L^-1）×0.45-丙酸含量（mmol·L^-1）×0.275+丁酸含量（mmol·L^-1）×0.4。

1.8 体外发酵营养物质降解试验

营养物质降解试验参考吴万成等^［23］的方法。称取0.5 g底物装入已知重量无纺布滤袋中（53 mm×53 mm，孔径18~25 μm，四川众想未来科技有限公司，绵阳，中国），用封口机（F-300，许昌市绿蜻蜓电器有限公司，许昌，中国）进行封口，将所有滤袋按不同处理转入到产气管中，并加入30 mL人工瘤胃液，在厌氧环境中发酵培养24 h。待发酵完毕，迅速将产气管放入冰水浴中终止发酵，统一取出滤袋，将滤袋放入清水中轻揉漂洗至水澄清，不同处理的滤袋漂洗次数保持一致。将滤袋转入烘箱，在65 ℃中烘48 h至恒重，测定干物质降解率（DM degradation rate， DMD），进一步检测底物及发酵残余物中粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，计算营养物质降解率。每个添加水平设6个重复。底物样品干物质降解率（DMD）、粗蛋白质降解率（CP degradation rate， CPD）、中性洗涤纤维降解率（NDF degradation rate， NDFD）、酸性洗涤纤维降解率（ADF degradation rate， ADFD）计算公式如下：底物样品某营养物质降解率（%）=［（底物样品某营养物质含量-底物残渣某营养物质含量）/底物样品某营养物质含量］×100。

1.9 数据统计分析

使用社会科学统计软件包（statistical package for the social sciences， SPSS）18.0软件分别通过levene检验与Kolmogorov-smirnov检验测试所有参数的方差齐性和正态性。此外，所有数据用SPSS 18.0进行统计分析，采用广义线性模型（generalized linear model， GLM）程序对不同紫玉米花青素提取物添加水平处理进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。进一步用曲线估计程序进行线性（linear）和二次函数（quadratic）显著性检验。差异显著性标准为P<0.05，结果用平均值±均值标准误（standard error of mean， SEM）表示。

2 结果与分析

2.1 不同紫玉米花青素提取物添加水平对体外发酵72 h累积产气量的影响

由表2可知，在2 h发酵时间点，各组间累积产气量差异均不显著（P>0.05）。然而，在其他7个发酵时间点（4、6、8、12、24、48、72 h），随紫玉米花青素提取物添加水平提高，累积产气量均呈线性和二次曲线降低（P<0.05）。此外，在4、6、8、12、24 h这5个发酵时间点，对照组产气量显著高于其他4个花青素组（P<0.05）。在48 h发酵时间点，对照组产气量显著高于0.4%、0.6%和0.8%花青素组（P<0.05）。在72 h发酵时间点，对照组与0.2%、0.4%和0.8%花青素组产气量差异不显著（P>0.05），但显著高于0.6%花青素组（P<0.05）。

2.2 不同紫玉米花青素提取物添加水平对体外发酵产气动力学参数的影响

与对照组相比，底物添加0.4%紫玉米花青素提取物可显著提高快速发酵部分的产气量（P<0.05，表3）。0.4%花青素组慢速发酵部分的产气量和潜在产气量显著高于（P<0.05）0.6%和0.8%花青素组。产气速率随花青素添加水平的增加呈线性和二次曲线降低（P<0.05），且对照组显著高于其他4个花青素组（P<0.05）。

2.3 不同紫玉米花青素提取物添加水平对瘤胃发酵参数及甲烷产量的影响

底物添加不同水平花青素对12、24 h发酵液pH无显著影响（P>0.05，表4）。然而，NH₃-N含量随添加水平提高在12 h呈二次曲线上升（P<0.05），在24 h呈线性和二次曲线上升（P<0.05）；0.4%花青素组在12、24 h均显著高于对照组（P<0.05）。对于VFA含量，乙酸和丁酸含量随花青素添加水平提高均呈线性和二次曲线下降（P<0.05），且对照组乙酸和丁酸含量显著高于0.4%、0.6%和0.8%花青素组（P<0.05）。丙酸含量随花青素添加水平提高均呈线性和二次曲线上升（P<0.05），且对照组丙酸含量显著低于花青素组（P<0.05）。4组间异丁酸、戊酸与异戊酸含量差异均不显著（P>0.05）。此外，各组间TVFA含量在24 h差异不显著（P>0.05）；但在12 h呈线性和二次曲线提高（P<0.05），且花青素组TVFA含量显著高于对照组（P<0.05）。乙酸/丙酸随紫玉米花青素水平提高呈线性和二次曲线降低（P<0.05），且花青素组显著低于对照组（P<0.05）。CH₄产量随花青素水平添加呈线性和二次曲线降低（P<0.05），且对照组的CH₄产量显著高于花青素组（P<0.05）。

2.4 不同紫玉米花青素提取物添加水平对体外发酵纤维素酶活性的影响

各组间24 h羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，12 h木糖酶，以及12和24 h滤纸纤维素酶活性差异均不显著（P>0.05，表5）。然而，在12 h发酵时间点，羧甲基纤维素酶和纤维二糖酶活性随花青素添加水平增加呈线性和二次曲线升高（P<0.05），且0.8%花青素组显著高于其他4组（P<0.05）。在24 h发酵时间点，木聚糖酶活性随花青素添加水平增加呈二次曲线升高（P<0.05），且0.2%、0.4%、0.6%花青素组显著高于对照组和0.8%花青素组（P<0.05）。

2.5 不同紫玉米花青素提取物添加水平对营养物质降解率的影响

底物添加紫玉米花青素提取物对DMD和NDFD均无显著影响（P>0.05，表6）。然而，CPD随花青素添加水平增加呈线性和二次曲线升高（P<0.05），且花青素组显著高于对照组（P<0.05）。ADFD随花青素添加水平增加呈线性和二次曲线升高（P<0.05），且0.6%、0.8%花青素组显著高于对照组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 不同紫玉米花青素提取物添加水平对累积产气量及动力学参数的影响

体外累积产气量可反映反刍动物饲粮可发酵程度与瘤胃微生物活性。饲粮在反刍动物瘤胃微生物发酵过程中，可产生一部分CO₂、CH₄等气体^［24］。本研究发现，紫玉米花青素提取物在48 h内可降低瘤胃体外累积产气量，这可能与紫玉米花青素提取物抑制肉牛CH₄产量有关（表4）。Tian等^［25］报道，与黏玉米秸秆青贮饲料相比，紫玉米秸秆青贮饲料在2 h显示较低水平的累积产气量，本研究结果与之相似。产气量是评价反刍动物瘤胃健康状态的重要指标之一，可反映瘤胃微生物对底物的利用效率。一般来说，累积产气量越高，说明底物的可发酵碳水化合物含量越高，瘤胃微生物发酵活性越强^［26］。本研究中，在72 h时，0.2%、0.4%花青素组累积产气量与对照组差异不显著，说明添加0.4%以内的紫玉米花青素提取物对关岭牛的微生物发酵活性无副作用。

瘤胃动力学参数是用来描述饲料原料在瘤胃内营养物质降解过程的数学模型参数。瘤胃体外发酵的快速降解部分产气量是由微生物降解淀粉等产生，慢速降解部分产气量是由微生物降解纤维素等产生^［27］。本研究表明，0.4%花青素组具有较高水平的a、b和a+b，表明0.4%花青素添加水平可能提高饲粮中蛋白质和碳水化合物在肉牛中的降解效率，这在后续进一步营养物质降解率中也得以论证。

3.2 不同紫玉米花青素提取物添加水平对瘤胃发酵参数及甲烷产量的影响

反刍动物对饲粮碳水化合物的吸收主要以VFA进行，VFA是反刍动物主要能量来源，约占机体吸收总能的70%^［28］。Gao等^［29］报道，饲粮添加紫甘蓝（Brassica oleracea var. capitata rubra）花青素提取物可显著提高肉牛瘤胃TVFA浓度，降低乙酸与丙酸的比例。相似地，Taethaisong等^［30］试验发现，在肉羊饲粮中添加富含花青素的紫印楝叶（Azadirachta indica），可显著提升瘤胃液TVFA含量。本研究发现，紫玉米花青素提取物可显著提高发酵液TVFA与丙酸含量。这可能是由于花青素以糖苷形式存在，其结构含有不同的碳水化合物，这些碳水化合物可能参与了瘤胃碳水化合物代谢，从而提升VFA含量^［31］。然而，其机制还需进一步研究。

反刍动物瘤胃排放的CH₄约占农业生产的28%，既导致饲粮能量浪费，又造成环境污染^［32］。研究表明，花青素可通过抑制产甲烷菌生长与活性，降低瘤胃CH₄产生，提升反刍动物的能量利用效率^［33］。Lu等^［34］通过体外产气试验发现，花青素具有降低山羊CH₄产量的作用。本研究发现，紫玉米花青素提取物可显著降低肉牛CH₄产量，这可能是因为花青素可促进微生物蛋白质流动，改善饲料质量，从而降低瘤胃CH₄的产生；此外，花青素可与其他营养物质（如蛋白质）结合形成复合物，可提高饲料利用效率，减少CH₄排放^［35］。Sinz等^［36］通过体外发酵试验发现，饲粮添加植物提取物可显著降低反刍动物7%~9%的CH₄排放量，本研究结果与之相似。

3.3 不同紫玉米花青素提取物添加水平对纤维素酶活性的影响

通过测定瘤胃纤维素酶活性，可间接说明瘤胃微生物对特定饲粮纤维素的分解能力。瘤胃作为强大的纤维分解发酵系统，瘤胃微生物可分泌和合成纤维分解酶^［37］。研究表明，饲粮添加提取物可显著提高奶山羊瘤胃纤维素分解菌的丰度^［38］。相似地，Suong等^［39］研究发现，饲粮添加花青素提取物可显著上调反刍动物瘤胃内纤维降解菌的丰度。本试验发现，紫玉米花青素提取物可显著提高瘤胃液纤维素酶活性，这可能是由于多酚化合物增加了反刍动物瘤胃纤维素分解细菌的数量^［40］。然而，本研究未检测微生物的变化，有待于进一步研究验证。此外，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶变化与木聚糖酶活性有所差异，这可能与三者的结构、空间构象变化及酸碱度等有关^［41］。

3.4 不同紫玉米花青素提取物添加水平对营养物质降解率的影响

营养物质瘤胃降解率反映了反刍动物对饲粮的消化利用程度。研究发现，花青素可通过调节瘤胃微生物群改善营养物质的消化率^［29］。Hosoda等^［42］报道，在绵羊饲粮中添加富含花青素的紫米（Oryza sativa）饲料可显著提高营养物质的表观消化率。本试验中，底物添加花青素可提高CPD，说明其可促进微生物对底物蛋白的利用。这可能是由于花青素与蛋白质结合形成复合物，改善了底物中CP的利用效率^［35］。在纤维素表面有一层结构域、糖苷键等复杂结构的纤维素晶体，需纤维素分解菌产生的纤维素酶降解才能被动物利用^［43］。本研究发现，花青素可显著提高ADFD，这可能是因为花青素通过上调瘤胃纤维降解菌的丰度^［39］，增强了底物对碳水化合物的发酵。

4 结论

紫玉米花青素提取物可改善瘤胃发酵模式，提高TVFA、丙酸含量及纤维素酶活性，上调营养物质降解率，下调CH₄产量，是关岭黄牛优质的饲料添加剂。在本试验条件下，肉牛饲粮添加0.4%紫玉米花青素提取物效果最佳。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32260849)

国家自然科学基金项目(32302779)

贵州省农业农村厅项目（关岭牛优异种质资源的发掘与利用

黔财农［2024］号），贵州省科技厅科技支撑计划项目（黔科合支撑［2022］重点033），贵州省基础研究计划（自然科学）青年引导项目（黔科合基础-［2024］青年106），贵州省教育厅高等学校自然科学研究项目青年科技人才成长项目(黔教技［2024］33号)

贵州大学基础研究项目(贵大基础［2023］16号)