不同共生效应根瘤菌株对紫花苜蓿光合特性和呼吸代谢的影响

Effects of rhizobial strains with different symbiotic effects on the photosynthetic characteristics and respiratory metabolism of alfalfa

摘要

为探究紫花苜蓿-根瘤菌共生系统结瘤固氮对紫花苜蓿的光合特性、呼吸代谢以及植株生物量积累的影响，以根瘤菌株LL2和QL5分别侵染‘甘农9号’紫花苜蓿，比较接种根瘤菌后紫花苜蓿的结瘤固氮能力、植株表型、光合特性和呼吸代谢等指标的差异。结果表明：1）接种根瘤菌株LL2后植株单株有效根瘤数（7个）、固氮酶活性（0.29 μmol·g^-1·h^-1）、豆血红蛋白含量（0.76 mg·g^-1）显著高于接种根瘤菌株QL5处理，前者紫花苜蓿的地上干重、株高、叶面积均显著提升，说明根瘤菌株LL2是‘甘农9号’紫花苜蓿的高效匹配菌株，QL5是低效匹配菌株。2）接种高效根瘤菌株LL2后植株的气体交换参数、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合产物显著高于接种低效根瘤菌株QL5处理。3）接种根瘤菌株LL2后植株的ATP含量、ATP合成酶、己糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性显著高于接种根瘤菌株QL5处理，呼吸速率显著小于QL5处理。4）地上干重与蒸腾速率（相关系数为0.72）、淀粉含量（0.83）、ATP合成酶活性（0.72）呈显著正相关（P<0.05），与呼吸速率呈负相关（0.66）；结瘤固氮能力与净光合速率（0.83）、可溶性糖含量（0.79）呈极显著正相关（P<0.01），与叶绿素（a+b）含量（0.76）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性（0.85）呈显著正相关（P<0.05），与呼吸速率呈负相关。5）接种高效匹配根瘤菌株LL2的植株单位光照时间下产生的单位干重（0.06 g·h^-1）显著高于接种根瘤菌株QL5的处理（0.03 g·h^-1）。综上，高效匹配根瘤菌株LL2可通过提高结瘤和固氮能力促进植株对氮素的固定，为植株光合和呼吸提供更多的氮素能源，进而增加光合产物，降低呼吸速率，促进植株代谢循环，最终积累更高的生物量。

Abstract

In order to explore the effects of nodulation and nitrogen fixation on the photosynthetic characteristics， respiratory metabolism， and plant biomass accumulation of alfalfa （Medicago sativa） plants in alfalfa-rhizobium symbiotic system， two Sinorhizobium meliloti strains， LL2 and QL5， were used to infect the M. sativa cultivar‘Gannong No. 9’， and the differences in nodulation and nitrogen-fixation ability， the phenotype， photosynthetic characteristics， and respiratory metabolism of alfalfa plants after inoculation with LL2 and QL5 were compared. The results showed that： 1） Compared with plants inoculated with S. meliloti QL5， those inoculated with S. meliloti LL2 formed significantly more effective nodules per plant （7）， and the nodules showed significantly higher nitrogenase activity （0.29 μmol·g^-1·h^-1） and leghemoglobin content （0.76 mg·g^-1）. The aboveground dry weight， plant height， and leaf area of alfalfa plants were greater in those inoculated with S. meliloti LL2 than in those inoculated with QL5， indicating that S. meliloti LL2 was a well-matched strain for M. sativa ‘Gannong No. 9’ and S. meliloti QL5 was a poorly matched strain. 2） The values of gas exchange and the contents of chlorophyll and chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic products were significantly higher in plants inoculated with the high-efficiency strain LL2 than in those inoculated with the low-efficiency strain QL5. 3） The adenosine triphosphate （ATP） content and the activities of ATP synthase， hexokinase， isocitrate dehydrogenase， 6-phosphogluconate dehydrogenase， and glucose-6-phosphate dehydrogenase were significantly higher， and the respiration rate was significantly lower， in plants inoculated with strain LL2 than in those inoculated with strain QL5. 4） There was a significant positive correlation between aboveground dry weight and transpiration rate （correlation coefficient， 0.72）， starch content （0.83）， and ATP synthase activity （0.72） （P<0.05）； and a negative correlation between the aboveground dry weight and respiration rate （0.66）. The nodule nitrogen-fixation ability was extremelly significantly positively correlated with net photosynthetic rate （0.83） and soluble sugar content （0.79） （P<0.01）； significantly positively correlated with chlorophyll （a+b） content （0.76） and glucose 6-phosphate dehydrogenase activity （0.85） （P<0.05）； and negatively correlated with the respiratory rate. 5） The dry weight per unit light time was significantly higher in plants inoculated with the highly efficient rhizobium strain LL2 （0.06 g·h^-1） than in plants inoculated with QL5 （0.03 g·h^-1）. In summary， the well-matched， efficient rhizobial strain promoted nodulation and nitrogen fixation， providing a nitrogen source for enhanced photosynthesis capacity and respiration. This increases the production of photosynthetic products， reduces the respiration rate， and promotes plant metabolism， leading to increased biomass accumulation.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / 根瘤菌 / 共生固氮 / 光合特性 / 能量 / 呼吸代谢

Key words

alfalfa / rhizobium / symbiotic nitrogen fixation / photosynthetic characteristics / energy / respiratory metabolism

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科（Leguminosae）苜蓿属多年生牧草，在我国广泛栽培^［1］，是畜牧业发展不可或缺的优质饲料来源^［2］。氮是植物生存的必需元素，豆科植物在农业系统中的一个优势是能够通过与固氮微生物的共生关系，满足自身大部分的氮素需求^［3］。根瘤菌能够侵染豆科植物（如紫花苜蓿）的根部并形成根瘤，固定植物不能直接利用的大气氮，为豆科植物提供氮营养^［4］。同样，植物为根瘤的生长和固氮作用提供能量，共生固氮过程中固定1分子氮需要消耗16分子三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP），这一过程耗能非常大^［5］。根瘤菌能促进苜蓿植株生长，增加苜蓿产量，改善品质^［6］，减少化学氮肥的使用，提高土壤肥力，实现节能环保^［7］，充分挖掘其固氮潜力对农业的可持续发展至关重要。

光合作用是固氮强度的决定因素之一，豆科牧草的光合作用可为根瘤菌共生固氮提供养分和能量，光合作用控制植株的形态建成、根瘤形成发育和共生固氮作用^［8］。在紫花苜蓿与根瘤菌的共生固氮过程中，根瘤可以固定大气中植物不能直接利用的氮，为豆科植物提供氮素营养，而植物的生长、根瘤的生长和固氮均需消耗光合作用的产物-碳水化合物和呼吸作用产生的能量，植物呼吸也消耗光合作用的产物^［9-10］。光合作用是作物生产的主要驱动力，而光合作用和呼吸作用之间的平衡是植物生物量积累的原因^［11］。那么接种根瘤菌后紫花苜蓿的光合特性和呼吸代谢有何变化，根瘤生长和固氮所引起的光合特性和呼吸代谢有何特征，值得研究。目前，我国苜蓿生产中接种根瘤菌的研究主要集中在苜蓿和根瘤生长特性和固氮能力上，而对接种根瘤菌后光合特性和呼吸代谢对苜蓿生长发育的影响研究鲜有报道。

前人研究发现根瘤菌株LL2与‘甘农9号’紫花苜蓿呈高效匹配性，QL5与甘农9号紫花苜蓿呈低效匹配性^［12］，但是研究主要集中在苜蓿和根瘤生长特性和结瘤固氮方面。因此，本试验以甘农9号紫花苜蓿为材料，比较接种不同共生效应根瘤菌株后紫花苜蓿植株的光合性能、呼吸代谢以及结瘤固氮能力，分析中华根瘤菌株LL2和QL5与紫花苜蓿共生过程中根瘤的生长和固氮对共生组合光合特性和呼吸代谢的影响差异，以及共生状态下光合和呼吸之间的耦合对植株生物量积累的影响，以期为促进共生状态下紫花苜蓿的光合利用率，进而为提高苜蓿产量提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿品种为甘农9号（M. sativa ‘Gannong No.9’），根瘤菌株为中华根瘤菌株LL2（Sinorhizobium meliloti LL2，分离自陇中苜蓿根瘤）和中华根瘤菌株QL5（S. meliloti QL5，分离自清水苜蓿根瘤），均由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供。

1.2 试验方法

试验采用营养液沙培法。挑选颗粒饱满且大小均一的紫花苜蓿种子，用碘伏溶液灭菌3 min，并用无菌水清洗多次，再用氯化钠-吐温溶液（sodium chloride-tween solution， ST）（0.9%无菌氯化钠溶液、0.5%吐温80）浸泡1 min后用无菌水冲洗，用滤纸吸干水分，将细沙洗干净并灭菌烘干（120 ℃高温灭菌30 min）。于2024年3月将灭菌后的种子均匀播种至装有灭菌沙和珍珠岩（比例1∶3）的等量网眼培养杯（直径9 cm、高12 cm）中，并摆放在长、宽、高分别为25、15和10 cm的水培盒中，每盒6杯，每杯播种20粒种子，置于甘肃农业大学草业学院人工气候室内（参数设置为光照强度360 mol·m^-2·s^-1，相对湿度60%左右，16 h光照，8 h黑暗，光照和黑暗条件下温度分别为25和20 ℃）培养幼苗。

菌悬液的制备及接菌：将保存于-80 ℃下的中华根瘤菌株LL2和QL5通过平板划线法分别接入酪蛋白胰酶琼脂（tryptone yeast， TY）固体培养基（胰蛋白胨5 g·L^-1；酵母粉3 g·L^-1；CaCl₂·6H₂O 1.3 g·L^-1；琼脂16 g·L^-1；蒸馏水1000 mL；pH 7.0）中活化培养，挑单菌落转入酵母麦芽（yeast malt agar， YMA）液体培养基（MgSO₄·7H₂O 0.2 g·L^-1；K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g·L^-1；NaCl 0.1 g·L^-1；甘露醇10 g·L^-1；酵母粉1 g·L^-1；蒸馏水1000 mL；pH 7.0），于摇床28 ℃、180 r·min^-1培养18 h后，在4 ℃，10000 r·min^-1下离心10 min，弃上清液后加入等量无菌水冲洗下菌体，振荡摇匀配置成等体积且OD₆₀₀为0.5（浓度为10⁹ CFU·mL^-1）的菌悬液。

在幼苗生长至第14天时，用移液枪向每株幼苗根处浇灌5 mL菌悬液，单独接种等量无菌水作为对照（CK）。所有处理均设置4个水培盒作为重复。接种后每盆浇灌300 mL Hoagland无氮营养液，3 d更换一次。

待紫花苜蓿生长至45 d左右采样，测定结瘤固氮、表型、光合、呼吸等指标。

1.3 测定内容及方法

1.3.1 结瘤固氮指标的测定

单株有效根瘤数：随机取10株苜蓿，冲洗干净杂质后计算单株有效根瘤数［显微镜（三锵泰达TD-4KHU，中国）下呈淡粉色的为有效根瘤］，各处理重复3次。

单颗根瘤重：随机选出10株紫花苜蓿植株，洗净根部后摘下根瘤并用滤纸吸干上面的水珠，并快速放在电子天平上称量单株苜蓿根瘤鲜重，各处理3次重复。

固氮酶活性：采用乙炔还原法^［13］。快速切下根瘤，称取鲜重，放置于8 mL青霉素瓶中，盖紧瓶塞并密封，使用微量注射器（高鸽1000 μL，中国）抽取0.8 mL空气，并注入0.8 mL乙炔气体，反应2 h。然后使用100 μL微量注射器吸取50 μL瓶内气体注入气相色谱仪（Agilent 7890B，美国）测量，各处理重复3次。

豆血红蛋白含量：参考前人的测量方法^［14］。取新鲜根瘤，在4 ℃的磷酸缓冲溶液（0.1 mol·L^-1，pH 6.8）中研磨成匀浆，磷酸缓冲溶液的量为根瘤体积的4倍左右，4 ℃离心15 min，取上层清液离心20 min，再取上清液，在波长540 nm条件下用分光光度计（TU-1901，北京）比色测定吸光值，各处理3次重复。

1.3.2 表型指标的测定

地上生物量：随机取10株植株的地上部分，装入信封105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒重，称干重，各处理重复3次。

株高：用卷尺测量，各处理重复10次。

叶面积：随机取紫花苜蓿植株从上往下数第3片叶片，通过数码相机（Canon EOS R50，日本）获取已知面积的叶片图像，用ImageJ软件计算叶面积，各处理10次重复。

茎叶比：茎叶分离，烘干后测定干重并计算茎叶比，茎叶比＝叶干重/茎干重，各处理重复3次。

1.3.3 光合相关指标的测定

光合参数：使用德国GFS-3000便携式光合-荧光测量系统测定净光合速率（net photosynthetic rate， P_n）、蒸腾速率（transpiration rate， T_r）、气孔导度（stomatal conductivity， G_s）和胞间CO₂浓度（intercellular CO₂ concentration， C_i）。各处理重复3次。

叶绿素含量：参照邹琦^［15］的方法，采用丙酮乙醇混合液提取法，取苜蓿新鲜叶片，测定苜蓿叶绿素a（chlorophyll a， Chl a）含量、叶绿素b（chlorophyll b， Chl b）含量及叶绿素（a+b）［chlorophyll （a+b）， Chl （a+b）］含量，并计算叶绿素a/b。各处理3次重复。

光合产物：使用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒测定可溶性糖（soluble sugar， SS）、淀粉（starch， Sta）、蔗糖（sucrose， Suc）含量。各处理3次重复。

叶片叶绿素荧光参数：待紫花苜蓿叶片暗适应60 min后，利用德国叶绿素荧光成像系统-IMAGING-PAM测定PSⅡ潜在光化学效率（PSⅡ potential photochemical efficiency， F_v/F_o），PSⅡ最大光化学效率（PSⅡ maximum photochemical efficiency， F_v/F_m），光化学淬灭系数（photochemical quenching coefficient， q_P），非光化学淬灭系数（non-photochemical quenching coefficient， q_N），光化学量子产量（photochemical quantum yield， Φ_PSⅡ），表观电子传递效率（apparent electron transfer efficiency， ETR）。各处理重复3次。

1.3.4 呼吸相关指标的测定

呼吸速率：在黑暗条件下，使用德国GFS-3000便携式光合-荧光测量系统测量紫花苜蓿叶片呼吸速率（respiration rate， R_d）。各处理重复3次。

使用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒测定ATP含量和三磷酸腺苷合成酶（adenosine triphosphate syntherase， ATPase）活性。各处理3次重复。

呼吸途径关键酶活性：使用苏州格锐思生物科技有限公司试剂盒测定己糖激酶（hexokinase， HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase， PK）、异柠檬酸脱氢酶（isocitric dehydrogenase， IDH）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase， SDH）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase， G6PDH）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase， 6PGDH）活性。各处理3次重复。

1.4 数据处理

采用Excel 2019软件对数据进行整理，使用SPSS 26.0对数据进行单因素方差分析和独立样本T检验，使用R语言进行Mantel相关性分析，通过Origin 2024作图。

2 结果与分析

2.1 根瘤结瘤固氮能力及其植株表型

2.1.1 结瘤固氮能力

由图1可以看出，接种根瘤菌LL2后甘农9号紫花苜蓿的单株有效根瘤数（7个）、固氮酶活性（0.29 μmol·g^-1·h^-1）和豆血红蛋白含量（0.76 mg·g^-1）均显著高于接种根瘤菌QL5处理（4个、0.21 μmol·g^-1·h^-1、0.66 mg·g^-1，P<0.05），分别是接种QL5处理的1.75、1.38和1.15倍。接种根瘤菌LL2和QL5后植株单颗根瘤重无显著差异。

2.1.2 植株表型

甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌后显著增加了地上干重、株高、叶面积和茎叶比（P<0.05，图2）。接种LL2的紫花苜蓿植株地上干重、株高、叶面积分别为0.59 g·10 plants^-1、25.90 cm、1.88 cm²，较CK（0.40 g·10 plants^-1、15.90 cm、1.04 cm²）分别增加了47.50%、62.89%、80.77%，接种QL5的地上干重、株高、叶面积分别为0.49 g·10 plants^-1、20.86 cm、1.55 cm²，较CK分别增加了22.50%、31.19%、49.04%。接种处理之间，接种菌株LL2后植株的地上干重、株高和叶面积均显著高于接种QL5，前者这3项指标分别是后者的1.20、1.24、1.21倍。

综上，通过结瘤固氮指标和植株表型说明LL2是甘农9号紫花苜蓿的高效匹配菌株，QL5是低效匹配的菌株。

2.2 光合能力

2.2.1 气体交换参数

如图3所示，接种根瘤菌后甘农9号紫花苜蓿叶片P_n、T_r、G_s较CK显著增加（P<0.05），C_i显著降低（P<0.05）。接种LL2菌株的P_n（19.63 μmol·m^-2·s^-1）、T_r（14.72 mmol·m^-2·s^-1）和G_s（211.70 mmol·m^-2·s^-1）较CK（7.79 μmol·m^-2·s^-1、6.01 mmol·m^-2·s^-1、121.24 mmol·m^-2·s^-1）分别提高了151.99%、144.93%和74.61%；接种QL5菌株的P_n（11.71 μmol·m^-2·s^-1）、T_r（10.65 mmol·m^-2·s^-1）和G_s（151.71 mmol·m^-2·s^-1）较CK分别提高了50.32%、77.20%和25.13%。C_i在接种LL2和QL5后分别较CK降低了21.86%和44.48%。接种LL2菌株的植株叶片P_n、T_r、G_s是接种QL5菌株的1.68、1.38、1.40倍，说明接种LL2菌株后植株光合能力强于接种QL5菌株的处理。

2.2.2 叶绿素含量

如图4所示，甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌后光合色素含量发生了显著变化，接种后叶片Chl a、Chl b和Chl （a+b）含量均显著增加（P<0.05），Chl （a/b）较CK显著降低（P<0.05）。接种LL2和QL5后，Chl a含量较CK分别提高了16.43%和11.12%；Chl b含量较CK分别提高了82.17%和62.21%；Chl （a+b）含量（2.40和2.23 mg·g^-1）分别是CK（1.76 mg·g^-1）的1.36和1.26倍。LL2接种处理的叶绿素含量均显著高于QL5。

2.2.3 叶绿素荧光参数

由图5可得，甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌后叶绿素荧光参数发生了明显变化，接种后F_v/F_o、F_v/F_m、Φ_PSⅡ、ETR显著增加（P<0.05），q_N显著降低（P<0.05）。接种LL2和QL5后，F_v/F_o分别是CK的1.40和1.21倍；表观电子传递效率分别是CK的1.45和1.12倍。接种LL2菌株处理植株叶片的F_v/F_o、F_v/F_m、Φ_PSⅡ和ETR均显著高于QL5处理，尤其是F_v/F_o和ETR分别高出QL5处理15.69%和29.64%。

2.2.4 光合产物

如图6所示，接种根瘤菌后甘农9号紫花苜蓿的光合产物发生了明显变化。接种根瘤菌增加了植株SS、Suc、Sta含量，接种LL2后的SS（11.13 mg·g^-1）、Suc（9.33 mg·g^-1）和Sta含量（11.73 mg·g^-1）较CK（8.96、5.79、6.67 mg·g^-1）分别显著提高了24.17%、61.27%、75.84%；接种QL5后的SS（9.68 mg·g^-1）、Suc（6.46 mg·g^-1）和Sta含量（7.99 mg·g^-1）较CK分别提高了8.01%（P<0.05）、11.72%、19.71%。接种菌株LL2后植株叶片的SS、Suc、Sta含量显著高于接种QL5处理，前者分别是后者的1.15、1.44和1.47倍。接种LL2菌株处理植株积累的光合产物高于QL5菌株处理。

2.3 呼吸能力

2.3.1 能量代谢和呼吸速率

三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量转换最基本的载体，是生物体内最直接的能量来源，ATPase又称线粒体呼吸链复合体V，是线粒体氧化磷酸化的终极反应。甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌后能量代谢发生了明显变化（图7），接种LL2和QL5后ATP含量和ATPase活性显著增加（P<0.05），ATP含量分别是14.18和13.07 μmol·g^-1，较CK（10.01 μmol·g^-1）分别增加了41.67%和30.56%；ATPase活性分别为13.07和10.80 μmol·h^-1·g^-1，较CK（8.49 μmol·h^-1·g^-1）分别增加了53.90%和27.23%。LL2处理的ATPase活性显著高于QL5处理，是其1.21倍。接种根瘤菌后甘农9号紫花苜蓿的呼吸速率显著低于CK（P<0.05），接种LL2和QL5后植株的呼吸速率分别为3.86和7.44 μmol·m^-2·s^-1，较CK（10.38 μmol·m^-2·s^-1）分别下降了62.80%和28.33%。

2.3.2 呼吸代谢途径关键酶

由图8可知，甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌后呼吸代谢途径关键酶发生了显著变化，接种后PK、IDH、SDH、6PGDH活性显著增加（P<0.05），HK、G6PDH活性显著降低（P<0.05）。接种LL2后的PK、IDH、SDH、6PGDH活性分别是186.21 nmol·min^-1·g^-1、1.42 nmol·min^-1·g^-1、135.70 U·g^-1、19.36 nmol·min^-1·g^-1，较CK（118.71 nmol·min^-1·g^-1、0.29 nmol·min^-1·g^-1、67.67 U·g^-1、10.82 nmol·min^-1·g^-1）分别提高了56.87%、384.47%、100.54%、78.97%；接种QL5后的PK、IDH、SDH、6PGDH活性分别是177.44 nmol·min^-1·g^-1、0.67 nmol·min^-1·g^-1、129.62 U·g^-1、16.09 nmol·min^-1·g^-1，较CK分别提高了49.47%、128.88%、91.54%、48.80%。接种LL2后植株的HK和G6PDH活性分别是152.22 nmol·min^-1·g^-1和3.77 nmol·min^-1·g^-1，较CK（196.44 nmol·min^-1·g^-1和6.41 nmol·min^-1·g^-1）分别降低22.51%和41.20%；接种QL5后植株的HK和G6PDH活性分别是114.40 nmol·min^-1·g^-1和2.66 nmol·min^-1·g^-1，较CK分别降低了41.75%和58.49%。LL2菌株接种处理的HK、IDH、G6PDH、6PGDH活性均显著高于QL5菌株，前者酶活性分别是后者的1.33、2.12、1.42、1.20倍。

2.4 光合呼吸指标与生物量的综合分析

2.4.1 相关性分析

对供试甘农9号紫花苜蓿的生物量、结瘤固氮能力、光合特性及呼吸代谢进行Mantel分析，用地上干重（aboveground dry weight， GDW）来代表植株生物量，用单株有效根瘤数、固氮酶活性、豆血红蛋白含量代表植株的结瘤固氮能力（N），如图9所示。地上干重与T_r、Suc含量、Sta含量、ATPase活性呈显著正相关，相关系数分别为0.72、0.78、0.83、0.72（P<0.05），与呼吸速率呈负相关，相关系数为0.66；结瘤固氮能力与P_n、SS含量呈极显著正相关，相关系数分别为0.83、0.79（P<0.01），与Chl （a+b）含量、G6PDH活性呈显著正相关，相关系数分别为0.76、0.85（P<0.05），与呼吸速率呈负相关。

2.4.2 变异系数

对接种不同共生效应根瘤菌株LL2、QL5处理组合的生物量、光合、呼吸等指标进行变异系数计算。由表1可知，LL2处理下变异系数为1.04%~65.78%，IDH活性变异系数（65.78%）最大，其次是呼吸速率（45.77%）、P_n（43.18%）；QL5处理下变异系数为0.52%~41.33%，G6PDH活性变异系数（41.33%）最大，其次是IDH活性（39.19%）、SDH活性（31.40%），说明接种根瘤菌对呼吸代谢途径关键酶活性影响最大。两个处理之间，除G6PDH活性、C_i、HK活性之外的其余27个指标的变异系数均是LL2处理大于QL5处理。说明LL2菌株对甘农9号紫花苜蓿的生物量、光合和呼吸代谢途径及其关键酶活性的影响大于QL5菌株。

2.4.3 植物生产简单模型

为了分析接种根瘤菌对紫花苜蓿生物量的影响，建立了紫花苜蓿地上干重（dry weight， DW）增加的数学模型。该模型是基于光合作用产生的干重与呼吸作用消耗干重的差异，这个模型的描述使用了公式（1）^［16］，如下：

\frac{d_{\mathrm{D}\mathrm{W}}}{d_{\mathrm{t}}}=A_{\mathrm{h}\mathrm{v}}\left(PAR\right)\times \mathrm{3.6}\times {\mathrm{10}}^{-\mathrm{7}}\times M_{\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}}\times S\left(DW\right)\times t_{\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{g}\mathrm{h}\mathrm{t}}-R_{\mathrm{d}}\times \mathrm{3.6}\times {\mathrm{10}}^{-\mathrm{7}}\times M_{\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}}\times \frac{\mathrm{1}}{h_{\mathrm{l}\mathrm{e}\mathrm{a}\mathrm{f}}}\times \frac{\mathrm{1}}{{\rho }_{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}}}\times FW\left(DW\right)\times t_{\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{g}\mathrm{h}\mathrm{t}+\mathrm{d}\mathrm{a}\mathrm{r}\mathrm{k}}（1）

A_{\mathrm{h}\mathrm{v}}(PAR)={A_{\mathrm{h}\mathrm{v}}}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}\frac{PAR}{PAR+K_{\mathrm{A}}}（2）

S(DW)=S_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}\frac{DW}{DW+K_{\mathrm{s}}}（3）

FW(DW)=K_{FW}DW（4）

式中：A_hv（PAR）是光合CO₂同化速率与光强的关系；3.6×10^-7是单位从“µmol·m^-2·s^-1”到“mol·cm^-2·h^-1”的转换系数；M_{\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}}是CO₂的摩尔质量（44 g·mol^-1）；S（DW）是受光照射下的总叶面积与干重的关系，t_light是栽培的光照持续时间（16 h）；R_d为平均暗呼吸速率，取常数；1/h_leaf为叶片厚度，根据文献［17］苜蓿叶片厚度约为0.0183 cm，{\rho }_{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}}为水分密度，约1 g·cm^-3，FW（DW）是鲜重与干重的关系，t_light+dark是栽培的光照和黑暗总持续时间（24 h）；A_{hv max}是最大光合CO₂同化速率，K_A为对应于0.5 A_{hv max}时的光强，S_max为最大面积，K_s是0.5S_max时的干重，K_FW 是FW与DW的比例系数。

从表2可以看出，接种根瘤菌后，植株单位光照时间下产生的单位干重显著大于CK，且LL2处理植株单位光照时间下产生的单位干重显著大于QL5处理（P<0.05）。

3 讨论

3.1 不同共生效应根瘤菌株接种后植株光合作用的变化

光合作用是植物干物质积累和产量形成的基础，能够反映植株生产性能的高低^［18］。根瘤菌侵染豆科植物根系可固定大气中游离的N₂，将其转化为植物可直接吸收利用的铵态N，保证了N素的可持续供应，使得植株叶面积增大，叶绿素含量升高，从而提升光合能力，促进了紫花苜蓿的生长，增加株高^［19］。孟捷等^［20］研究发现紫花苜蓿接种根瘤菌后其P_n、T_r、G_s和叶绿素含量增加，C_i降低。本研究中发现接种高效根瘤菌株LL2后植株的P_n、T_r、G_s较接种低效QL5处理显著增加，T_r、G_s与地上干重呈显著正相关。周相娟等^［21］研究发现在正常光照条件下，接种根瘤菌能显著提高紫花苜蓿叶片的叶绿素含量和叶绿素荧光参数。李馨园等^［22］发现氮素供应充足的植株Chl （a/b）要比氮素供应不充足的植株低。本试验中接种根瘤菌株LL2苜蓿叶片Chl a、Chl b和Chl （a+b）含量显著高于接种菌株QL5处理，Chl a与地上干重呈显著正相关，这与前人研究结果一致；接种高效根瘤菌株LL2的植株Chl （a/b）最小，这可能是由于接种了根瘤菌株LL2的植株光合系统Ⅱ的捕光色素蛋白复合物中富含更多的叶绿素b成分，而捕光色素蛋白复合物的高含量增强了生物体捕获光能的能力，从而促进了光合作用。接种根瘤菌株LL2（S. meliloti LL2）后F_v/F_o、F_v/F_m、Φ_PSⅡ、ETR显著高于接种QL5处理，这与光合特性和叶绿素含量的变化表现一致。马家斌等^［23］研究发现，大豆（Glycine max）接种根瘤菌后，随着植株地上部光合作用能力的提高，更多的光合产物被转运至根瘤，Suc和SS含量增加。本试验中，紫花苜蓿植株中的SS、Suc、Sta含量在接种根瘤菌株LL2后增加最显著，Sta、Suc含量与地上干重呈显著正相关，这与前人研究结果一致。

大量研究表明，在相同的环境条件下，不同豆科植物可与同一根瘤菌共生固氮，同一豆科植物也可以与多种根瘤菌进行共生固氮^［24］。不同根瘤菌与苜蓿品种的共生表型匹配性存在差异。接种匹配性好的根瘤菌可以增进紫花苜蓿的产量和品质。本研究接种高效匹配根瘤菌株LL2处理的气体交换参数、叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合产物显著高于接种低效匹配根瘤菌株QL5处理，分析其原因可能是前者处理可以生成更多的有效根瘤，且其固氮酶活性和豆血红蛋白含量显著高于后者，能够固定大气中更多的氮利用到植株的叶绿素和光合作用中，使得光合作用增强、光合产物增加。

3.2 不同共生效应根瘤菌株接种后植株呼吸作用的变化

呼吸作用释放能量，是植物进行各种生理代谢的基础，对植物的生长发育有重要意义^［25］，植物体内的能量主要以ATP的形式储存^［26］。ATPase大量分布在线粒体内膜、叶绿体类囊体、质膜上，在光合作用和呼吸作用过程中催化能量物质ATP的合成^［27-28］。吴艳芬等^［29］发现，在接种中华根瘤菌后大豆植株叶片的ATPase活性增加，且变化趋势与P_n变化趋势一致。本试验中，接种根瘤菌株LL2后，植株ATPase活性和ATP含量显著高于接种菌株QL5处理，ATPase与地上干重呈显著正相关。这可能是接种高效匹配根瘤菌后，紫花苜蓿光合作用增强，生产更多的光合产物运入植株和根瘤，作为呼吸的底物进入呼吸代谢循环中，氧化释放大量电子和能量，释放的能量贮存在生成的ATP中。在呼吸代谢循环中转化为植物呼吸底物，氧化释放大量电子和能量，能量释放到高能成键成分中储存，形成ATP。

呼吸速率的大小可反映植物的新陈代谢活动，较强的呼吸速率可以产生更多的能量，使植物有足够能量来维持生长^［30］，但是过高的呼吸速率会加快植物消耗有机物质，如果光合积累的有机物质不能满足呼吸的消耗，就会影响植物的生长发育。本试验中，呼吸速率与地上干重呈负相关，接种根瘤菌处理的呼吸速率显著小于对照，这可能是因为对照既缺乏根瘤菌接种又未施加氮肥，植株生长迟滞，叶片小，光合效率减弱，植株体内的能量少，所以需要加大呼吸来产生更多的能量供植株生长发育，而接种根瘤菌株LL2后，氮供应充足，呼吸速率正常进行，无需消耗更多的光合底物来进行呼吸作用。呼吸代谢途径中的一些酶是调控代谢重要的限速酶，在植物体内主要有糖酵解（glycolysis， EMP）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle， TCA）和磷酸戊糖途径（pentoso phosphate pathway， PPP）这3条呼吸代谢途径，光合作用产生的有机物最终会进入这3种途径中进行代谢循环。吴艳芬等^［29］研究发现，大豆在单接种根瘤菌后，植株叶片SDH活性增加，这可能是因为在根瘤体内根瘤菌发育成类菌体，为呼吸作用提供能源。本研究在每条呼吸途径中选用2个呼吸关键酶，对其在接种根瘤菌后甘农9号紫花苜蓿生长发育过程中叶片的酶活性进行分析，接种根瘤菌后EMP-TCA和PPP途径中酶活性前期低于对照，中后期显著高于对照，这可能是接菌后植株光合作用增强，生成的糖类等光合产物含量升高，逐渐进入呼吸代谢并积累，使得酶活性缓慢提高，增加了共生植物的呼吸代谢^［31］。从图9可以看出， 接种根瘤菌株LL2后紫花苜蓿叶片EMP中的HK活性、TCA中的IDH活性和PPP中的G6PDH、6PGDH活性显著高于接种QL5菌株处理，说明3条呼吸代谢途径均是接种菌株LL2处理大于接种QL5处理，且EMP和TCA中的关键酶活性远大于PPP关键酶活性，说明本试验中紫花苜蓿发育过程中呼吸代谢途径以EMP-TCA途径为主。

3.3 不同共生效应根瘤菌株接种后植株结瘤固氮能力、生物量与光合和呼吸的关系

植物借助光合作用，将太阳能转化为化学能并储存在光合作用的产物-碳水化合物内，在豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程中，这些光合产物充当了能源的角色^［32］。当光合产物以蔗糖形态被输送到根瘤并成为类菌体的有效代谢基质后，为根瘤的固氮活动提供了必要的能量^［33］。共生体系中的植物光合作用对根瘤固氮具有直接影响，光合作用强度越大，产生的光合产物就越多，进而为固氮过程提供的能源也就越充足。反之，根瘤的固氮作用也影响植株的光合作用和呼吸代谢。

研究发现，根瘤的数量、单个根瘤的重量和大小是影响单株根瘤总重量增加的主要因素，根瘤性状特别是根瘤生物量与固氮能力有关^［34］。接种根瘤菌后紫花苜蓿植株根瘤的固氮酶活性和豆血红蛋白含量会显著增加^［35］。根瘤固氮酶活性是其固氮能力和固氮潜力大小的体现^［36］，而豆血红蛋白作为根瘤内一种关键成分，能够有效地调控类菌体周边氧气的浓度，从而增强根瘤的固氮效率，根瘤固氮酶活性与豆血红蛋白含量之间存在显著的正相关性^［37］。本试验中，接种高效匹配根瘤菌株LL2处理的单株有效根瘤数、固氮酶活性、豆血红蛋白含量显著高于接种低效匹配菌株QL5处理，前者的固氮作用高于后者，气体交换参数、叶绿素含量、光合产物、ATPase、呼吸途径关键酶活性也强于后者。光合作用影响植物的物质代谢和能量转化，葡萄糖作为呼吸的底物，主要由光合产物水解产生，比如Sta和Suc，接种根瘤菌后光合能力增强，使得能向植物体输送的光合产物也增多，Suc和Sta含量的增加为呼吸代谢循环提供了更多的能源。地上部生物量比对照显著增加，这说明光合产物的增量大于植株及其根瘤呼吸所消耗的部分，使接菌后紫花苜蓿生物量增加。此外，接种根瘤菌株LL2的变异系数大于菌株QL5，说明高效菌株LL2对植株的生长发育增益更明显。通过建立生物量与光合和呼吸的生产模型发现接种根瘤菌处理的植株单位光照时间下产生的单位干重显著高于不接菌处理，其中接种高效匹配性根瘤菌株LL2对紫花苜蓿单位干重的增加效果更显著，该生产模型可以供收割茎秆和叶片的牧草计算产量作参考。甘农9号紫花苜蓿接种根瘤菌株LL2共生组合可作为高产组合在栽培育种工作中加以利用。

4 结论

与低效匹配根瘤菌株相比，紫花苜蓿品种接种高效匹配根瘤菌株LL2后，可通过增加有效根瘤数、固氮酶活性和豆血红蛋白含量提高植株氮素的固定量，为植株光合和呼吸提供更多的氮素能源，从而产生更多的光合产物，降低呼吸速率，促进植株代谢循环，最终积累更高的生物量。

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基金资助

苜蓿燕麦高产种质创新和品种选育子课题(03324007)

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系(CARS-34)