紫花苜蓿CKX基因家族鉴定及其对非生物胁迫的响应

Identification of the CKX gene family in alfalfa and its responses to abiotic stress

摘要

紫花苜蓿是世界上种植最广泛的豆科牧草，具有产量高、抗逆性强以及适口性好等特点。低温和干旱是影响苜蓿产量、品质及大面积推广的重要非生物胁迫因子。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（cytokinin oxidase/dehydrogenase， CKX）能够不可逆地降解细胞分裂素，调节植物的生长发育，帮助植物应对环境胁迫。本研究采用生物信息学方法在全基因组水平对紫花苜蓿CKX基因家族进行鉴定和生物信息学分析。结果表明，紫花苜蓿基因组中鉴定出31个CKX基因，分布于1、2、3、4、7和8号染色体上。紫花苜蓿CKX基因家族成员编码氨基酸数为273~545个，除MsCKX30其余均为亲水性蛋白；CKX基因家族分为3个亚族，且具有较高的保守性；紫花苜蓿CKX基因家族与蒺藜苜蓿的同源性较高。qPT-PCR结果表明，MsCKX2、MsCKX3、MsCKX7、MsCKX8、MsCKX15、MsCKX16和MsCKX18的表达量受低温胁迫诱导；干旱胁迫诱导MsCKX2、MsCKX15的表达；低温和干旱胁迫均能诱导MsCKX15表达。研究结果为紫花苜蓿MsCKX基因功能鉴定提供了参考。

Abstract

Alfalfa （Medicago sativa） is the most widely planted legume forage in the world， with a high yield， strong stress resistance， and good palatability. Low temperature and drought are important abiotic stress factors affecting the yield， quality， and distribution of alfalfa. Cytokinin oxidase/dehydrogenase （CKX） irreversibly degrades cytokinin， thereby regulating plant growth and development， and it also contributes to the plant response to environmental stress. In this study， the CKX gene family of alfalfa was identified and analyzed by bioinformatics methods at the whole-genome level. In total， 31 CKX genes were identified in the alfalfa genome， distributed on chromosomes 1， 2， 3， 4， 7， and 8. Members of the CKX gene family members encoded polypeptides of 273-545 amino acids， all of which were hydrophilic proteins except for MsCKX30. In a phylogenetic analysis， the CKX gene family grouped into three subfamilies with highly conserved domains， and alfalfa CKX genes showed high homology with those of Medicago truncatula. Analyses of gene transcript levels by quantitative real-time polymerase chain reaction showed that MsCKX2， MsCKX3， MsCKX7， MsCKX8， MsCKX15， MsCKX16， and MsCKX18 were induced under low-temperature stress， MsCKX2 and MsCKX15 were induced under drought stress， and MsCKX15 was induced by both low temperature stress and drought stress. These results provide a reference for further research on the functions of CKX genes in alfalfa.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / CKX基因家族 / 生物信息学分析 / 表达分析

Key words

alfalfa / CKX gene family / bioinformatics analysis / expression analysis

植物激素是植物体内的一类内源性信号分子，主要包括细胞分裂素（cytokinin， CTK）、生长素（indole-3-acetic acid， IAA）、赤霉素（gibberellin， GA）、脱落酸（abscisic acid， ABA）和乙烯（ethylene）^［1］。尽管其浓度极低，却在植物的整个生命周期中发挥着至关重要的作用。从种子萌发到开花结果，植物激素通过影响基因表达、蛋白质活性和细胞代谢，调节各种生理过程^［2-3］。CTK最早由Miller等^［4］在20世纪50年代从玉米（Zea mays）胚中发现，是植物生长发育过程中不可或缺的激素，调控植物的许多生长发育过程^［4］。CTK主要分布在植物茎、根尖的分裂细胞、未成熟和发芽的种子以及生长中的果实中。有研究表明，CTK在根系发育、叶片衰老及逆境表达中扮演着重要角色，特别是在顶端优势的维持和侧芽萌发的过程中，CTK通过与生长素的相互作用，协调植物的生长发育^［5-6］。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（cytokinin oxidase/dehydrogenase， CKX）作为降解内源性CTK的关键酶，在维持细胞内CTK稳态和适应环境胁迫方面发挥着重要作用^［7-8］。

CKX基因家族在植物体内广泛存在，其成员在结构上高度保守，但在功能上却呈现多样性。近年来，CKX基因家族成员已经在多种植物中被鉴定出来，主要集中于拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［9］、水稻（Oryza sativa）^［10-11］、玉米^［12］和大豆（Glycine max）^［13］等植物中。其中，在拟南芥中鉴定出7个AtCKX基因，水稻中鉴定出11个OsCKX基因，玉米中鉴定出13个ZmCKX基因，大豆中鉴定出18个GmCKX基因。研究表明，CKX基因在调控植物生长发育及胁迫响应等方面具有重要作用^［14-16］。拟南芥是研究CKX基因家族功能的模式植物，Tomás等^［9］研究发现，CKX基因通过调控细胞分裂素水平，影响根尖分生组织活性、侧芽发育以及叶片衰老。Ashikari等^［10］研究发现，CKX基因的过表达导致水稻穗部生长受到抑制，籽粒产量下降，而抑制CKX基因的表达可显著增加籽粒产量和粒重，从而能够有效地提高水稻产量。在大豆的研究中发现，GmCKXs在苗期盐和干旱胁迫的响应中发挥重要作用。在6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine， 6-BA）和IAA处理下，GmCKX1、GmCKX6和GmCKX9的表达量减少，而GmCKX10和GmCKX18的表达量增加^［13］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种优质的豆科牧草，具有产量高、品质好和抗逆性强等特点^［17］。在我国，紫花苜蓿主要种植于东北、华北和西北等寒冷干旱地区，其生长发育常受逆境胁迫的影响，因此挖掘提高植物抗逆性的基因具有重要意义。迄今为止，在全基因组水平对紫花苜蓿WRKY、ERF、NAC等转录因子基因家族已进行了较为系统的鉴定及功能分析^［18-20］，但关于紫花苜蓿CKX基因家族的系统研究未见报道。因此，本研究利用生物信息学手段，从基因组水平对紫花苜蓿CKX基因家族成员进行系统分析和鉴定，并对其蛋白理化性质、基因结构、染色体定位、系统进化以及对干旱胁迫和冷胁迫的响应进行分析，以期为紫花苜蓿CKX基因家族在冷胁迫、干旱胁迫中的功能研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验材料为‘草原4号’紫花苜蓿，由内蒙古农业大学草育种课题组保存。将种子消毒后放入铺有蒸馏水浸润双层滤纸的培养皿中，置于25 ℃光照培养箱内萌发，于2024年4月将苜蓿种子种植于盛有营养土和蛭石（2∶1）的花盆中，栽培时间为长日照条件（16 h光照/8 h黑暗），定期浇水。

将紫花苜蓿幼苗置于4 ℃低温培养箱中，分别于0、2、6、12、24、48 h采集样品；进行空气干旱处理^［21］，分别于0、2、4、8、12和24 h取样。所有处理设置3次重复。取样后，立即将样品快速冷冻在液氮中，并在-80 ℃保存以供后续分析。

1.2 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族成员的鉴定

从Figshare数据库中下载紫花苜蓿^［22］全基因组的序列、基因注释以及蛋白序列文件（https：//figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assembly_of_Medicago_sativa）等，从PFAM数据库中获取CKX基因家族的隐马氏模型序列谱（PF09265），利用TBtools软件进行CKX基因家族鉴定与筛选，获得潜在的CKX蛋白质序列，使用SMART（http：//smart.embl.de）和NCBI在线工具BatchCD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行蛋白保守结构分析，以确定其含有CKX基因家族特有的保守结构域。

1.3 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族蛋白理化性质及结构预测分析

使用ExPASy（https：//www.expasy.org/）在线网站对紫花苜蓿CKX基因家族氨基酸序列进行氨基酸数目、总平均亲水性、等电点、分子质量、不稳定系数等相关的蛋白理化性质分析^［23］，利用在线软件WOLF PSORT［WoLF PSORT： Protein Subcellular Localization Prediction （hgc.jp）］对蛋白质亚细胞定位进行预测，利用NCBI Blast［BLAST： Basic Local Alignment Search Tool （nih.gov）］在线网站进行序列比对，通过SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在线网站预测蛋白质二级结构；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在线软件预测蛋白质三级结构。从紫花苜蓿基因组gff.文件中提取MsCKX的基因结构信息，从软件上获取基因的上下游序列、外显子以及内含子等信息。利用在线工具MEME（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html？man_type=web）获得保守结构域氨基酸位点的XML文件，保守基序（Motif）的数目定义为10。使用TBtools工具结合所获取的信息对紫花苜蓿CKX家族的基因结构组成及保守结构域氨基酸位点的XML文件进行绘制。

1.4 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族系统进化分析和共线性分析

使用MEGA 7.0软件对紫花苜蓿CKX基因家族氨基酸序列以及拟南芥2个物种的氨基酸序列进行多序列比对，再通过MEGA 7.0软件，采用邻接法（neighbor-joining algorithm）构建系统进化树^［24］，并使用在线软件Evolview（https：//evolgenius.info/evolview-v2/#login）进行美化。利用TBtools软件对紫花苜蓿、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、大豆进行共线性分析并分别可视化处理。

1.5 RNA提取和实时荧光定量PCR分析

使用TRIzon Rragent（康为）试剂从采集的紫花苜蓿叶片样品中提取总RNA，将所提取的RNA放置于-80 ℃保存，利用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis试剂盒（江苏）获得相应的cDNA，将其置于-20 ℃储存，便于后续试验。利用软件Primer 5.0设计引物（表1），β-actin为内参引物。荧光定量PCR的反应体系为20 μL，包含TB Green Premix Ex Taq II（TliR NaseH Plus）（2×） 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA模板4 μL（80 ng·μL^-1）、ROX Reference Dye（50×） 0.2 μL、ddH₂O 5 μL。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s；40个循环。每个样品3个重复，使用2 ^-∆∆Ct 方法^［25］计算基因的相对表达量。

1.6 数据处理

利用Excel 2019统计相关试验数据，利用SPSS 21.0进行方差分析，使用t检验比较5%显著性水平下的平均值，使用Origin绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族成员鉴定与基本信息分析

通过对紫花苜蓿基因家族成员进行筛选和鉴定，最终在紫花苜蓿中鉴定出31个CKX基因家族成员，并将其命名为MsCKX1~MsCKX31。理化性质预测结果显示（表2），紫花苜蓿MsCKX基因家族编码的氨基酸为273~545个，分子量为29908.98~62258.97 Da；9个蛋白的等电点小于6，其余蛋白等电点均在6以上；除MsCKX6、MsCKX15、MsCKX16、MsCKX17、MsCKX19和MsCKX24以外，其余蛋白的不稳定系数均在40以下，具有较好的稳定性； MsCKX30总平均亲水性为正值，其余均为负值，说明大部分蛋白属于亲水性蛋白；亚细胞定位预测分析结果显示，MsCKX基因家族大部分成员位于叶绿体和细胞质中，MsCKX11~MsCKX13位于内质网中，MsCKX17、MsCKX19位于细胞核中，MsCKX30位于细胞膜中，而MsCKX25位于胞外。

2.2 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族蛋白的二级结构和三级结构预测分析

通过SOPMA在线网站预测蛋白二级结构，结果显示（表3），CKX蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲组成。其中无规则卷曲占比最高，为44.40%，α-螺旋次之，为39.39%，β转角最低，为7.31%。蛋白三级结构预测由SWISS-MODEL完成，结果显示（图1），MsCKX1、MsCKX2、MsCKX3、MsCKX4结构相似，MsCKX12、MsCKX13、MsCKX14结构相似，MsCKX21、MsCKX22、MsCKX23、MsCKX29、MsCKX31结构相似，MsCKX15、MsCKX16结构相似，MsCKX26、MsCKX27结构相似，剩下家族成员结构均不相似。

2.3 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族保守基序和基因结构分析

通过MEME分析，CKX基因家族共分为3个亚家族（图2A），在CKX家族成员中共发现了10个保守基序，命名为motif 1~motif 10。这10个保守基序的序列长度最小为21个氨基酸，最大为50个氨基酸。其中，CKX基因家族的每个成员均包含motif 1~motif 9；MsCKX15缺少motif 7；MsCKX8、MsCKX9、MsCKX10缺少motif 10，但具有相似的基序且排序相同，这种基序分布可能导致CKX基因家族具有相同或相似的生物学功能（图2B）。对紫花苜蓿CKX基因结构分析，MsCKX家族成员由3~7个外显子组成，其中只有MsCKX27有3个外显子，MsCKX20有6个外显子，MsCKX17有7个外显子，MsCKX17、MsCKX18、MsCKX19、MsCKX21、MsCKX22、MsCKX26、MsCKX28、MsCKX30、MsCKX31有4个外显子，其余均具有5个外显子（图2C）。

2.4 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族系统进化分析

为进一步了解紫花苜蓿CKX基因家族的系统发育，从NCBI数据库中选取紫花苜蓿和拟南芥的CKX基因家族成员进行聚类分析。31个MsCKX、7个AtCKX被划分为3个亚组（group1、group2、group3）。MsCKX基因家族集中于3个亚组中，在MsCKX蛋白中，group1包含13个蛋白，分别为MsCKX1、MsCKX2、MsCKX3、MsCKX4、MsCKX5、MsCKX6、MsCKX7、MsCKX8、MsCKX9、MsCKX14、MsCKX17、MsCKX19、MsCKX24；group2包含MsCKX25、MsCKX30和MsCKX31；group3包含15个蛋白，分别为MsCKX10、MsCKX11、MsCKX12、MsCKX13、MsCKX15、MsCKX16、MsCKX18、MsCKX20、MsCKX21、MsCKX22、MsCKX23、MsCKX26、MsCKX27、MsCKX28、MsCKX29（图3）。

2.5 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族共线性分析

在31个MsCKX基因家族成员中，发现一些MsCKX基因在苜蓿基因组中存在片段、串联重复。在chr3、chr4和chr7中为染色体的内部基因复制事件，chr1和chr8之间存在串联基因，剩余染色体不存在内部基因复制和串联事件。为进一步了解CKX基因家族在不同物种之间可能发生的进化事件，构建了紫花苜蓿与拟南芥、蒺藜苜蓿的种间共线性图谱。结果显示，紫花苜蓿与拟南芥共线的CKX基因对有12对，与蒺藜苜蓿共线的CKX基因对有25对（图4）。紫花苜蓿与蒺藜苜蓿的同源基因对数量比紫花苜蓿与拟南芥的同源基因对高，这可能是因为蒺藜苜蓿和紫花苜蓿都是豆科植物。

2.6 紫花苜蓿<italic>CKX</italic>基因家族在非生物胁迫下的表达分析

为进一步确认紫花苜蓿CKX基因在非生物胁迫下的表达模式，选取8个紫花苜蓿CKX基因进行qRT-PCR验证。结果表明，紫花苜蓿CKX基因在低温胁迫处理下，除MsCKX10表达量下调，其余均上调。与对照相比MsCKX3、MsCKX7、MsCKX15和MsCKX16表达量均上调，MsCKX2在2、6、12、24 h表达量上调，在48 h表达量下调；MsCKX8、MsCKX18在24 h表达量下调，在其余时间表达量上调。与对照相比，MsCKX3在2、24 h表达量显著上调，但是2、24 h间的表达量没有显著差异；MsCKX7、MsCKX15、MsCKX16在48 h较对照有显著差异（P<0.05）。在干旱胁迫处理下，与对照相比，MsCKX2表达量在各个时间均显著上调，分别上调了48.71%、278.65%、48.74%、63.09%和243.71%（P<0.05），MsCKX18表达量在2、4、8、12、24 h分别显著下调了90.85%、96.11%、98.12%、88.13%、96.64%（P<0.05），MsCKX10在2 h表达量最高，比对照高了81.19%。与0 h相比，MsCKX7、MsCKX15、MsCKX16在12 h表达量最高，MsCKX2、MsCKX3在4 h表达量最高，MsCKX8在8 h表达量最高。通过紫花苜蓿CKX基因家族在两种非生物胁迫处理下的分析，在低温、干旱胁迫处理下均可诱导紫花苜蓿MsCKX15基因表达（图5）。

3 讨论

苜蓿在生长过程中常常受到寒冷、干旱以及盐等非生物胁迫的影响，造成产量和品质受损。因此，挖掘紫花苜蓿抗逆性基因对紫花苜蓿的遗传改良具有重要意义。CKX基因家族在植物生长发育和非生物胁迫的影响中发挥着重要作用。本研究利用紫花苜蓿全基因组数据完成了MsCKX基因家族鉴定和分析工作。在紫花苜蓿全基因组中鉴定出31个CKX家族成员，并命名为MsCKX1~MsCKX31，基于包含拟南芥和紫花苜蓿CKX蛋白序列的系统发育树，进一步将紫花苜蓿MsCKX分为3个亚族。MsCKX基因的分子表征表明，CKX蛋白成员具有不同的理化性质，对鉴定出的31个MsCKX蛋白进行蛋白理化性质分析和亚细胞定位预测发现（表2），该基因家族的蛋白除MsCKX30外，其余均属于亲水性蛋白且稳定性较好；MsCKX基因家族的亚细胞定位于不同位置，大部分成员定位于细胞质内，其次为叶绿体和内质网，MsCKX25定位于胞外，MsCKX30定位于细胞膜上，这与其他物种的研究结果^［26-27］不同，可能是因为紫花苜蓿CKX基因家族蛋白在进化过程中结构发生了变化。预测结果与物种鉴定结果相似，推测CKX基因在细胞质内发挥调控基因表达的功能可能性较大。外显子-内含子结构为探索基因的进化关系提供了重要信息^［28］。一般来说，外显子的数量在基因进化中起着重要的作用^［29］，内含子的数量决定了基因的表达率^［30-31］。具有相似外显子-内含子结构的基因具有相似的基因功能。因此，通过分析可以预测基因的功能及结构，在本研究中发现，相同亚家族中的大多数MsCKX基因具有相似数量的外显子，这表明它们可能具有相似的功能。MsCKX外显子数为4~7，这与油菜（Brassica napus）^［32］和卷心菜（Brassica oleracea var. capitata）^［33］研究结果相似，推断同类基因可能具有相似功能。

CKX家族基因对冷胁迫和干旱胁迫具有重要调控作用^［34］，可作为植物耐寒、抗旱分子育种的候选基因。为了探讨紫花苜蓿CKX家族基因对低温和干旱胁迫的响应，本研究随机选取了8个CKX基因家族成员进行qRT-PCR分析。结果显示，在干旱胁迫下MsCKX2、MsCKX15表达量上调，MsCKX18表达量下调；而在低温胁迫条件下，MsCKX3、MsCKX7、MsCKX15和MsCKX16表达量上调，只有MsCKX10的表达量下调。MsCKX15在低温胁迫下表达量在各个处理时间均上调，MsCKX15在干旱胁迫下表达量在2、8、12、24 h上调。在大豆^［13］中发现干旱胁迫下，GmCKX13的表达量上调，而GmCKX3、GmCKX9和GmCKX8的表达量下调。GmCKX14在叶片中表达量上调，而在根系中下调。与对照相比，干旱胁迫处理使大豆胚根中的CKX酶活性提高了39.35%，而6-BA和IAA处理使CKX酶活性分别降低了38.33%和26.90%。在鹅掌楸（Liriodendron chinense）^［35］中，LcCKX5在低温胁迫处理下表达量下调；在干旱胁迫下，LcCKX5在根中的表达量先下调后上调，茎中的表达无显著变化，而在叶片中则表现为下调。因此，基于本研究结果，从全基因组水平研究紫花苜蓿CKX基因家族，将为挖掘其抗寒、抗旱的优异基因以及通过基因工程技术创制高效抗寒、抗旱的新型紫花苜蓿种质奠定基础。

4 结论

本研究从紫花苜蓿基因组中共鉴定获得31个CKX基因家族成员，定位到6条染色体上。CKX基因家族成员的外显子为4~7个；MsCKX基因家族成员除MsCKX30外其余均为亲水性蛋白；亚细胞定位预测分布在细胞质、叶绿体、内质网、细胞核、胞外和细胞膜中。通过qRT-PCR分析了8个CKX基因在低温和干旱条件下的表达情况，在低温胁迫处理中，与对照相比，MsCKX3、MsCKX7、MsCKX15和MsCKX16表达量上调，MsCKX10表达量则下调；在干旱胁迫处理下，MsCKX2、MsCKX15表达量上调，MsCKX18表达量下调。此外，紫花苜蓿MsCKX15基因在低温和干旱胁迫下的表达量均高于对照。

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基金资助

内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持项目”(NJYT23009)

内蒙古一流学科专项项目(YLXKZX-NND-033)

国家自然科学基金(32060388)

苜蓿分子育种体系构建及种质创制(BR22-11-12)