结缕草ZjWRKY63基因的克隆及转基因拟南芥的耐盐性分析

Cloning of the gene ZjWRKY63 from Zoysia japonica and its salt resistance analysis in transgenic Arabidopsis

摘要

WRKY转录因子在植物生长发育、病原菌防御和非生物胁迫应答过程中发挥重要调控作用。根据前期结缕草中WRKY转录因子的基因家族鉴定以及耐盐和敏盐结缕草品系在盐胁迫下的转录组分析，筛选得到1个盐胁迫响应WRKY转录因子基因ZjWRKY63。为进一步研究该基因的耐盐性功能，设计引物进行PCR扩增，克隆得到开放阅读框为921 bp的基因编码区（CDS）序列。ZjWRKY63基因编码1个含有306个氨基酸的蛋白质，具有1个WRKY功能保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序，属于WRKY IIa亚族。生物信息学分析表明，ZjWRKY63氨基酸残基平均信号肽最大得分值为0.267，提示该蛋白不具备信号肽；疏水性预测分析显示编码蛋白总平均疏水指数（GRAVY）为-0.395，提示该蛋白质为亲水性蛋白质，且ZjWRKY63不存在跨膜区；亚细胞定位预测分析显示该转录因子定位于细胞核内。系统发育分析显示，结缕草ZjWRKY63与芦苇 PaWRKY65亲缘关系最近。对过表达ZjWRKY63的转基因拟南芥种子和植株分别进行盐胁迫处理发现，过表达植株的种子萌发率、存活率和侧根数均显著高于野生型。同时，在ZjWRKY63转基因拟南芥中，盐胁迫响应相关基因的表达量均显著高于野生型，推测ZjWRKY63基因通过调节胁迫响应基因的表达来提高转基因拟南芥的耐盐性。以上研究结果初步揭示了结缕草ZjWRKY63基因的耐盐性功能，为深入研究ZjWRKY63基因的耐盐分子机制奠定了理论基础。

Abstract

WRKY transcription factors play crucial regulatory roles in plant growth and development， pathogen defense， and responses to abiotic stress. Based on the previous gene family identification of WRKY transcription factor genes in Zoysia japonica， as well as the transcriptome analysis of the salt-tolerant and salt-sensitive Z. japonica species under salt stress， a salt stress-responsive WRKY transcription factor gene named ZjWRKY63 was screened out. To further investigate the salt-tolerance function of this gene， primers were designed for PCR amplification， and the coding sequence （CDS） with an open reading frame of 921 bp was cloned. The ZjWRKY63 encodes a protein containing 306 amino acids， which possesses one WRKY functional conserved domain and one C₂H₂ zinc finger structural motif， and belongs to theWRKY IIa subfamily. Bioinformatics analysis revealed that the maximum score value of the average signal peptide for the amino acid residues of ZjWRKY63 was 0.267， indicating that this protein does not possess a signal peptide. Hydrophobicity prediction analysis showed that the grand average of hydrophobicity （GRAVY） value was -0.395， indicating that this protein is a hydrophilic protein. Transmembrane region prediction found no transmembrane region in ZjWRKY63. Prediction of subcellular localization showed that ZjWRKY63 would be localized in the nucleus. Phylogenetic analysis demonstrated that ZjWRKY63 of Z. japonica has the closest genetic relationship with the Persea americana， PaWRKY65. Salt stress treatment was conducted using the seeds and plants of transgenic Arabidopsis thaliana with overexpressed ZjWRKY63. It was found that the seed germination rate， survival rate and number of lateral roots of the overexpressing plants were significantly higher than those of the wild type. Meanwhile， in the transgenic A. thaliana with ZjWRKY63， the expression of genes related to salt stress response was significantly higher than that in the wild type in all cases. We speculate that the ZjWRKY63 gene enhances the salt tolerance of transgenic A. thaliana by regulating the expression of stress response genes. The above research results provide preliminary confirmation of the salt-tolerance function of the ZjWRKY63 gene， and lay a scientific foundation for further investigation of the molecular mechanism of the salt-tolerance conferred by the ZjWRKY63 gene.

Graphical abstract

关键词

结缕草 / ZjWRKY63基因 / 基因克隆 / 耐盐性 / 分子机制

Key words

Zoysia japonica / ZjWRKY63 gene / gene cloning / salt tolerance / molecular mechanism

土壤盐渍化作为植物典型的非生物胁迫因素之一，破坏土壤生态环境，对植物的生长和发育造成了显著的负面影响，严重威胁到农业生产和粮食安全^［1］。草坪作为园林绿化中的重要组成部分，近年来发展迅速，在城乡美化、环境保护、河堤防护等方面，体现了巨大的生态效益和景观价值。盐胁迫能够对草坪草的生长发育、外观形态和生理生化等多方面产生诸多不良影响，导致其质量和生态功能下降，增大草坪养护成本和管理难度^［2-3］。草坪草中有多种盐生植物，能够通过调节离子转运蛋白的表达、合成渗透调节物质激活抗氧化系统以及其他生理生化途径降低盐胁迫对自身造成的损伤^［4］。另外，已证实多个转录因子家族如bHLHs、DREBs和WRKYs，也可以通过调控相关耐盐基因的表达参与植物对盐胁迫的响应^［5-7］。因此，研究草坪草的耐盐分子机制，对培育耐盐草坪草新品种，推进盐碱地修复治理具有重大意义。

WRKY转录因子作为植物特有的一类转录因子家族，广泛参与植物的生长发育及逆境胁迫应答过程^［8-9］。WRKY转录因子在蛋白结构上都具有一段约60个氨基酸组成的高度保守结构域，N端包含一个保守的WRKYGQK结构域核心序列，C端含有一个C₂H₂或C₂HC型（CX_4-7-CX_23-28-HX_1-2-H/C）的锌指结构^［10］。根据WRKY结构域数目和锌指结构特征将WRKY转录因子分为3个亚族Group I、Group Ⅱ和Group Ⅲ，其中Ⅱ类只包含1个WRKY结构域和1个C₂H₂型锌指结构，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中进一步又被分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe五个亚类^［11］。几乎所有的WRKY转录因子都能特异性结合靶基因启动子区域的W-box（T/TGACC/T）顺式作用元件来调节目标基因的表达，其中包括许多防御相关的基因^［9］。

目前在多个物种中发现了WRKY转录因子基因在盐处理下被强烈而快速地诱导表达，且能够通过调控渗透胁迫、活性氧系统等途径参与胁迫响应^［12-13］。在拟南芥中，被鉴定出74个WRKY基因家族成员，其中AtWRKY25、AtWRKY33和AtWRKY45正向调节植株对盐胁迫的耐受性^［14-15］。盐胁迫下，在水稻（Oryza sativa）中过表达小麦（Triticum aestivum）TaWRKY13基因能够增强转基因植株的渗透调节能力，进而表现出耐盐性^［16］。葡萄（Vitis vinifera）VvWRKY30基因在拟南芥中能够通过增强活性氧清除能力和渗透物质的积累来提高植物对盐胁迫的耐受性^［17］。WRKY转录因子也可以通过调节下游与植物抗逆性相关的功能基因，从而正向参与植物的耐盐性过程，如在拟南芥中过表达玉米（Zea mays）ZmWRKY33基因，能够上调胁迫应激基因RD29A的表达，进而提高转基因植株的耐盐性^［18］。此外，WRKY也可以负调控植物的盐胁迫响应过程，如在拟南芥中过表达虎茎蓼（Polygonum cuspidatum）PcWRKY33基因，能够下调盐胁迫应激基因的表达，且细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）的积累量增加，植物的耐盐能力减弱^［19］。玉米ZmWRKY17基因受干旱、高盐和脱落酸（abscisic acid， ABA）诱导上调表达，拟南芥中过表达该基因在种子萌发和幼苗期表现出对盐胁迫的敏感性降低，同时相应基因的表达也显著低于野生型，说明ZmWRKY17基因可通过调节盐胁迫响应基因的表达来增加对盐胁迫的敏感性^［20］。杨树（Populus alba×P. glandulosa）中，PagWRKY75基因在高盐胁迫早期下调表达，相较于野生型，过表达转基因杨树植株对盐胁迫更敏感，植物体内活性氧的清除能力以及脯氨酸的积累也降低，表明PagWRKY75基因通过调节各种生理过程来负向调节耐盐性^［21］。但在结缕草（Zoysia japonica）中，只有少数WRKY基因的功能被报道，如ZjWRKY10能够促进开花基因FLOWERING LOCUS T的表达，加快转基因拟南芥的开花和叶片衰老过程，且ZjWRKY10在高盐（150 mmol·L^-1 NaCl）、低温（4 ℃）和干旱（20% 聚乙二醇）胁迫后，表现出不同的表达模式，表明ZjWRKY10也可能在非生物胁迫中发挥重要调控作用^［22］。因此，发掘和研究结缕草中耐盐相关WRKY转录因子的功能，对通过现代生物学技术提高结缕草耐盐性具有重要意义。

结缕草是我国优良的暖季型草坪草，具有良好的抗旱、耐盐和耐践踏等特性，是建植低养护和环境友好型的草种，在绿化草坪、运动场草坪和水土保持草坪等方面应用广泛^［23］。结缕草是典型的盐生植物，野生种质资源及品种的耐盐性评价研究一直备受关注，但由于结缕草遗传转化效率较低，分子育种研究进展缓慢，对结缕草中优质耐盐基因的挖掘以及分子机理的研究目前还较少。因此，本研究通过生物信息学和转录组分析，筛选到1个盐胁迫响应的WRKY转录因子基因ZjWRKY63，属于WRKY IIa亚族。在拟南芥中过表达ZjWRKY63基因能显著增强转基因植株种子的萌发率、存活率和侧根数。同时，下游盐胁迫响应相关基因的表达也显著高于野生型，因此，推测ZjWRKY63基因通过调节胁迫响应基因的表达来提高转基因拟南芥的耐盐性。以上研究结果为进一步深入探究ZjWRKY63基因的耐盐分子机制以及创制结缕草抗逆新种质奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及培养条件

试验用植物材料为结缕草品种Zenith（Z. japonica Zenith），于2023年种植于青岛农业大学东门温室，培养基质配比为营养土∶珍珠岩=1∶1，温度（23±5） ℃，光照强度7000~8000 lx，光照16 h/黑暗8 h。试验用野生型拟南芥为Columbia-0型，培养条件如下：温度白天22 ℃/夜晚20 ℃，光照强度12000 lx，光照16 h/黑暗8 h，相对湿度50%~60%。

1.2 结缕草<italic>ZjWRKY63</italic>基因的克隆及表达载体的构建

利用植物总RNA提取试剂盒FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）提取结缕草叶片总RNA，并用Nanodrop 2000（IMPLEN，德国）检测RNA纯度和浓度，利用逆转录试剂盒（RR092A）（TaKaRa， 中国大连）进行反转录反应合成cDNA，反转录体系包括2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、2 μg Total RNA、1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1.0 μL RT Primer Mix、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2、RNase Free dH₂O补足20 μL；反应条件为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 10 min。根据结缕草ZjWRKY63基因序列（Zoysia genome database ID： Zjn_sc00011.1.g02350.1.sm.mkhc），设计同源重组引物（表1），并进行PCR扩增。PCR反应体系包括20 ng cDNA、0.5 μL 10 μmol·L^-1 ZjWRKY63-F、0.5 μL 10 μmol·L^-1 ZjWRKY63-R、10 μL 2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（P525）（南京诺唯赞生物科技有限公司），RNase Free dH₂O补足20 μL；PCR扩增的反应程序为95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、（60 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s）30个循环；72 ℃ 3 min， 4 ℃终止反应。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，之后用DNA回收试剂盒（天根生化科技北京有限公司）纯化回收PCR产物，然后用同源重组酶（C117）（南京诺唯赞生物科技有限公司）将回收片段连接到BamHI和HindIII双酶切之后的过表达双元载体pCAMBIA3301-Pubi上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（DL1001S）（上海唯地生物技术有限公司），在含有50 mg·mL^-1 Kana的LB（胰蛋白胨10 g·L^-1、酵母提取物5 g·L^-1、NaCl 10 g·L^-1）平板上，37 ℃培养12 h左右，挑选单克隆菌落，经PCR鉴定为阳性后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。经测序分析选择ZjWRKY63基因编码区（coding sequence， CDS）序列完全正确的单克隆菌株，提取质粒DNA转入农杆菌GV3101，并转化拟南芥^［24］。

1.3 <italic>ZjWRKY63</italic>基因的生物信息学分析

用NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）blastx功能对ZjWRKY63基因序列进行BLAST分析，并对该基因所编码氨基酸序列的保守结构域进行分析。在ProtParam（https：//web.expasy.org/protscale/）在线网站推测ZjWRKY63蛋白的分子量、等电点及氨基酸组成。用SignalP 4.1 Server在线网站（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测ZjWRKY63蛋白的信号肽。用ProtScale在线网站（https：//web.expasy.org/protscale/）预测ZjWRKY63蛋白的亲疏水性。用TMHMM v.Server 2.0在线网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测ZjWRKY63蛋白的跨膜结构。用SWISS-MODEL在线网站（https：//www.swissmodel.expasy.org/）预测ZjWRKY63蛋白的三级结构。用WoLF PSORT在线网站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）预测ZjWRKY63转录因子的亚细胞定位。ZjWRKY63的蛋白序列以及其同源序列通过MEGA 7.0软件构建进化树，进行遗传进化分析。

1.4 <italic>ZjWRKY63</italic>转基因拟南芥种子萌发率及幼苗耐盐性分析

用10%的次氯酸钠对T₀代转基因拟南芥种子消毒5 min，然后用蒸馏水洗涤3~5次。用移液枪将消毒后的种子点种在含有5 mg·L^-1草铵膦（北京索莱宝科技有限公司）的1/2 MS培养基（phytotechnology，M519。成分如下：硝酸铵1650 g·L^-1；硼酸6.2 g·L^-1；无水氯化钙332.2 g·L^-1；六水氯化钴0.025 g·L^-1；五水硫酸铜0.025 g·L^-1；乙二胺四乙酸二钠二水合物37.26 g·L^-1；七水硫酸亚铁27.8 g·L^-1；硫酸镁180.7 g·L^-1；硫酸锰16.9 g·L^-1；钼酸钠二水合物0.25 g·L^-1；碘化钾0.83 g·L^-1；硝酸钾1900 g·L^-1；磷酸二氢钾170 g·L^-1；七水硫酸锌8.6 g·L^-1；甘氨酸2 g·L^-1；肌醇100 g·L^-1；烟酸0.5 g·L^-1；盐酸吡哆醇0.5 g·L^-1；盐酸硫胺素0.1 g·L^-1）上，对转基因种子进行抗性筛选。将阳性的绿色转基因幼苗移栽到灭菌的营养土中培养，单株收获阳性植株的T₁代种子。自交扩繁，筛选T₂代单株收获种子中没有发生分离的植株，即为纯合植株T₃。将纯合的ZjWRKY63基因表达量高的代表性转基因拟南芥种子（OE-#2， OE-#7和OE-#14）和野生型（wild type， WT）拟南芥种子消毒后分别播种于含有150和175 mmol·L^-1 NaCl的1/2 MS培养基上，每个浓度设置3次重复，并在播种的第0、2、3、4和5天统计种子的萌发率，每个处理组3次重复。

将上述纯合转基因和野生型种子消毒后点种于1/2 MS培养基上，生长7 d后将长势一致的转基因和野生型拟南芥幼苗移至含150和175 mmol·L^-1 NaCl的1/2 MS培养基方皿中竖直培养。7 d后统计各拟南芥株系的侧根数^［25］。

将纯合转基因和野生型种子点种在灭菌的营养土中，光照培养室中培养21 d，将长势一致的转基因和野生型拟南芥幼苗设置对照组和盐胁迫处理组，每个株系、每个处理至少3盆。对盆栽植株进行浇水，处理组植株先用200 mmol·L^-1的NaCl溶液浇3 d，之后用250 mmol·L^-1的NaCl溶液浇3 d，再用300 mmol·L^-1的NaCl溶液浇3 d，最后用350 mmol·L^-1的NaCl溶液浇3 d，并复水14 d。对照组植株分别浇以等量水，胁迫处理结束后统计存活率并拍照^［26］。

1.5 <italic>ZjWRKY63</italic>转基因拟南芥盐胁迫处理下胁迫响应基因的表达模式分析

将21 d的盆栽纯合转基因和野生型拟南芥幼苗分别转移到含有50 mmol·L^-1 NaCl的1/2 MS液体培养基中处理6 h，分别在处理前和处理后收集各株系的叶片组织，并用液氮充分研磨。提取总RNA，取2 μg进行反转录合成cDNA。下游胁迫响应基因AtABI5（Accession：NM_001336591）、AtCOR15A（Accession：NM_129815）、AtDREB1A（Accession：AB007787）、AtMYC2（Accession：NM_102998）、AtSOS1（Accession：NM_126259）和AtSOS2（Accession：NM_001344103）根据Yu等^［27］的方法设计荧光定量qRT-PCR引物（表1）。反应总体系10 μL如下：5 μL 2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）、0.5 μL 10 μmol·L^-1的正、反向引物（表1）、2 μL 50 ng·μL^-1 cDNA模板、2 μL RNase-free ddH₂O。qRT-PCR仪型号为CFX96 real-time PCR system（Bio-Rad，北京），反应程序如下：95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）40个循环。基因的相对表达量使用2^-ΔΔCT公式^［15］计算，AtACT（Accession：NM_001336665）为内参基因，每个样品进行3次重复。

1.6 数据处理与统计分析

使用GraphPad Prism 9对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 结果与分析

2.1 结缕草<italic>ZjWRKY63</italic>基因的表达与克隆

参考Wang等^［28］对结缕草耐盐材料Z011和敏盐材料Z004在高盐胁迫下的转录组分析结果，共鉴定到22个ZjWRKY差异表达基因（图1A），其中，ZjWRKY63基因（Zjn_sc00011.1.g02350.1.sm.mkhc）在结缕草ZjWRKY差异表达基因中表达量较高，且盐胁迫处理后在敏盐型结缕草材料Z004中表达量表现出下降趋势，而在耐盐型结缕草材料Z011中表达量呈先升高后降低趋势（图1B），表明该基因在结缕草盐胁迫响应过程中可能发挥重要调控作用。为进一步验证初步的假设，以结缕草品种“Zenith”为材料，提取叶片RNA，反转录合成cDNA。以该cDNA为模板，通过PCR扩增，获得921 bp的ZjWRKY63基因全长CDS序列，扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1C所示。对该PCR产物进行胶回收，并连接到改造后的由泛素启动子启动的过表达载体pCAMBIA3301上，构成终载体pCAMBIA3301-Pubi：：ZjWRKY63。经测序，将构建成功的表达载体转入农杆菌GV3101菌株中，菌落PCR鉴定为阳性菌株（图1C），利用农杆菌介导的拟南芥转化法浸染拟南芥^［24］，并筛选阳性转基因植株。

2.2 结缕草<italic>ZjWRKY63</italic>基因的生物信息学分析

将克隆得到的921 bp的ZjWRKY63全长CDS序列在NCBI中进行BLAST分析，发现该蛋白含有1个WRKY功能结构域（图2A）。经NCBI ORF Finder在线预测，该基因编码一个由306个氨基酸组成的蛋白，其中WRKY功能域中含有一个高度保守的WRKY结构域（WRKYGQK）和一个C₂H₂型（C-X₅-C-X₂₃-H-X-H）锌指结构域（图2B），表明ZjWRKY63转录因子属于WRKY IIa亚族。

ProtParam分析表明，ZjWRKY63基因编码的蛋白分子式为C₁₃₅₁H₂₀₉₅N₃₉₃O₄₄₆S₁₅，分子量为31.46 kDa，理论等电点为5.56。利用SignalP 4.1 Server在线分析软件预测ZjWRKY63蛋白的信号肽，该蛋白的氨基酸残基平均信号肽最大得分值为0.267（图3A），表明ZjWRKY63不存在信号肽。利用ProtScale Sever在线分析软件中的Hydropath./Kyte & Doolittle法预测该蛋白的亲、疏水性，预测结果如图3B所示，该蛋白疏水性预测分析编码蛋白总平均疏水指数（GRAVY）值为-0.395，表明该蛋白是亲水性蛋白。利用TMHMM v.Server 2.0在线网站分析表明，ZjWRKY63蛋白不存在跨膜区（图3C）。通过SWISS-MODEL网站同源建模发现，模板蛋白的可信度及其与目标蛋白的匹配程度均较高（图3D）。此外，本研究还预测了ZjWRKY63蛋白的亚细胞定位，显示其定位在细胞核中。

2.3 结缕草<italic>ZjWRKY63</italic>基因的遗传进化分析

通过NCBI蛋白数据库搜索到与结缕草ZjWRKY63蛋白序列相似的同源序列，分别为芦苇PaWRKY65（Phragmites australis， XP_062206754）、黍PmWRKY65（Panicum miliaceum， RLN25407）、五节芒MfWRKY65（Miscanthus floridulus， XP_066309589）、狗尾草PhWRKY65（Panicum hallii， XP_025814691）、柳枝稷PvWRKY65（Panicum virgatum， XP_039813594）、谷子SiWRKY65（Setaria italica， XP_004969837）、高粱SbWRKY65（Sorghum bicolor， XP_002458443）、玉米ZmWRKY14（Zea mays， ACG45823）、光稃稻OgWRKY65（Oryza glaberrima， XP_052136223）、节节麦AtWRKY65（Aegilops tauschii， XP_020149507）、水稻OsWRKY65（XP_015624912）、大麦HvWRKY65（Hordeum vulgare， XP_044972707）、二粒小麦TdWRKY65（Triticum dicoccoides， XP_037406553）、二穗短柄草BdWRKY65（Brachypodium distachyon， XP_010232262）、小麦TaWRKY65（XP_044344816）、多年生黑麦草LpWRKY65（Lolium perenne， XP_051226874）、拟南芥AtWRKY69（NP_567073）。多序列比对结果显示结缕草ZjWRKY63与芦苇PaWRKY65的亲缘关系最近（图4）。

2.4 结缕草<italic>ZjWRKY63</italic>转基因拟南芥的耐盐性分析

将具有代表性的T₃代过表达株系OE-#2、OE-#7、OE-#14和野生型种子分别点种于含有0、150和175 mmol·L^-1 NaCl的1/2 MS培养基上，统计不同浓度NaCl处理培养基中拟南芥种子发芽情况。结果显示，在含有0 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，各过表达株系和野生型拟南芥种子发芽率没有显著性差异（图5A）。在第2天时，WT的萌发率为91.8%，OE-#2为95.2%，OE-#7为95.9%，OE-#14为95.2%，在第5天时，各株系种子萌发率均接近100%，其中WT为98.0%，OE-#2的萌发率为 99.3%，OE-#7为97.3%，OE-#14为98.0%（图5A， B）。在含有150 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，处理第2天时，WT的萌发率为49.0%，过表达株系OE-#2为77.6%，OE-#7为74.8%，OE-#14的萌发率为78.9%，过表达株系种子萌发率均显著高于野生型（P<0.001）（图5C， D）。在处理第5天时，各株系种子萌发率均有所增加，但过表达株系种子萌发率仍显著高于野生型，其中WT为81.0%，OE-#2为97.3%（P<0.001），OE-#7为92.5%（P<0.05），OE-#14为93.9%（P<0.001）（图5D）。在含有175 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，各株系种子萌发速率迟缓于0和150 mmol·L^-1 NaCl处理（图5E， F）。在处理第2到5天时，过表达株系种子萌发率均显著高于野生型，其中第2天WT的萌发率为14.3%，过表达株系OE-#2为21.1%（P<0.05），OE-#7为23.1%（P<0.01），OE-#14为25.1%（P<0.001）；第5天WT萌发率为78.9%，OE-#2为89.1%（P<0.01），OE-#7为87.7%（P<0.01），OE-#14为86.4%（P<0.05）（图5F）。

将上述点种于1/2 MS培养基上7 d的幼苗分别移至含0、150和175 mmol·L^-1 NaCl的1/2 MS培养基方皿中竖直培养，7 d后统计各株系的侧根数发现，在0 mmol·L^-1的培养基中，各株系侧根数没有显著性差异，而在不同浓度的NaCl培养基中，过表达株系的侧根数显著高于野生型（图6A，B）。其中含有150 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，WT侧根数的平均值为5.3，OE-#2、OE-#7和OE-#14侧根数的平均值分别为10.0（P<0.05）、12.6（P<0.001）和11.3（P<0.01），均显著高于野生型；含有175 mmol·L^-1 NaCl的培养基中，过表达株系OE-#2（10.6）、OE-#7（11.3）和OE-#14（10.3）的平均侧根数均显著高于WT（5.6）（图6B）。将WT、OE-#2、OE-#7和OE-#14种子点种在灭菌的营养土中，光照培养21 d后，依次进行盐胁迫处理并统计各株系植株的存活率。结果显示，正常培养状态下各株系的存活率均为100%，而盐胁迫处理后WT的存活率为27.8%，过表达各株系存活率分别为83.3%（P<0.001），77.8%（P<0.01）和72.2%（P<0.01），均显著高于野生型（图6C，D）。

2.5 盐胁迫下过表达拟南芥中胁迫响应基因的表达模式分析

为了研究ZjWRKY63基因影响转基因拟南芥耐盐性的潜在分子机制，对拟南芥中6个下游胁迫响应基因AtSOS1、AtSOS2、AtABI5、AtMYC2、AtDREB1A和 AtCOR15A的表达模式进行分析（图7）。结果显示，正常培养状态下ZjWRKY63转基因各株系和野生型拟南芥中盐胁迫响应基因的表达量差异不显著，而盐胁迫处理后所有株系中胁迫响应基因的表达均表现出上调趋势，且过表达株系OE-#2、OE-#7和OE-#14中AtSOS1、AtSOS2、AtABI5、AtMYC2、AtDREB1A和AtCOR15A基因的表达量均显著高于WT。其中，AtDREB1A和AtCOR15A上调幅度较大，分别为31.5、64.9、47.7和19.3、13.7、21.5倍，表明过表达ZjWRKY63基因可能通过调控胁迫响应基因的表达来提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性（图7）。

3 讨论

植物转录因子通过调控下游基因的表达参与各种环境胁迫应答过程，其中WRKY转录因子是植物体内最大的转录因子家族之一，且在多个物种中被发现并鉴定^［29］。WRKY转录因子根据WRKY结构域数目和锌指结构特征可分为Group I、Group Ⅱ和Group Ⅲ三个亚族^［10］。本研究中ZjWRKY63基因编码的蛋白质包含1个WRKY结构域和1个C₂H₂型（C-X₅-C-X₂₃-H-X-H）锌指结构域，归属于Group IIa亚族。有研究表明，小麦TaWRKY33转录因子同属于Group IIa亚族，且盐处理下过表达拟南芥的根长和鲜重均显著高于野生型，表现出更好的耐盐性^［30］。生物信息学分析显示，结缕草ZjWRKY63转录因子为一个不含有信号肽的亲水性蛋白，且遗传进化分析表明，ZjWRKY63与禾本科芦苇PaWRKY65的同源性最高，亲缘关系最近。

为了初步确定ZjWRKY63基因在盐胁迫下的功能，在拟南芥中对ZjWRKY63基因进行过表达。盐胁迫处理后，发现过表达株系相较于野生型种子的萌发率、侧根数和存活率相对更高，表现出更强的耐盐能力，说明ZjWRKY63基因在拟南芥中可能正向调控耐盐性。相似的研究结论在小麦中也有被报道，小麦WRKY转录因子基因TaWRKY93受盐、干旱、低温和渗透胁迫诱导上调表达，过表达该基因的转基因拟南芥植株在含有NaCl和甘露醇的MS平板上能够显著提高主根长和侧根数^［31］，本研究中过表达ZjWRKY63基因在拟南芥中同样增加了转基因植株的侧根数，但不同的是并未提高主根长（结果未展示）。同样，小麦TaWRKY17在拟南芥中过表达能显著提高盐胁迫后转基因拟南芥的存活率，表现出高耐盐性^［27］。此外，在苦荞（Fagopyrum tataricum）中，过表达转录因子基因FtWRKY46能显著增加转基因拟南芥种子的萌发率、根长等，表现出耐盐功能^［32］。而在拟南芥中过表达玉米ZmWRKY17基因则表现出相反的趋势，转基因拟南芥种子的萌发率和根长明显下降，说明ZmWRKY17基因使拟南芥对盐胁迫更加敏感^［20］。在拟南芥中，菊花（Chrysanthemum morifolium）WRKY转录因子基因CmWRKY17过表达能够显著降低转基因植株的存活率，同样表现出盐敏感性^［33］。综上所述，WRKY转录因子家族基因在植物胁迫耐受性方面既能正向发挥调节功能，又可以负调控增加盐敏感性，而结缕草ZjWRKY63基因可能通过某些分子机制在拟南芥中正向调控耐盐性。

为进一步探究结缕草ZjWRKY63基因参与的耐盐性分子调控机制，本研究进行了qRT-PCR以评估与离子稳态（AtSOS1和AtSOS2）、脱落酸生物合成（AtABI5）、信号传导（AtMYC2）和应激反应（AtDREB1A和AtCOR15A）相关的各种因素^［34］。研究表明，AtSOS1、AtSOS2和AtNHX1是调节植物耐盐性的关键Na⁺转运蛋白，其中AtSOS1基因编码一种质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，能够调节盐胁迫下细胞内的离子稳态^{［11，35-36］}。本研究中，在盐胁迫处理前，各转基因株系中AtSOS1和AtSOS2基因的表达与野生型无显著性差异，而盐胁迫处理后，过表达株系中AtSOS1和AtSOS2基因的表达量显著高于野生型，说明在拟南芥中过表达结缕草ZjWRKY63基因促进了离子稳态基因的表达，进而部分程度上维持了盐胁迫下细胞内的稳态环境。植物激素在植物生长发育中起着至关重要的作用。为了应对植物不同发育阶段的盐胁迫，植物激素如脱落酸（ABA）、赤霉素、茉莉酸、水杨酸等会被诱导生成^［37］。脱落酸在盐胁迫条件下起着重要作用，ABA能够通过植物叶片上的保卫细胞来调节体内的水分状况，有助于缓解盐胁迫对植物生长、光合和细胞内代谢的不利影响^［38］。本研究中，在盐胁迫处理前，各转基因株系中与脱落酸合成相关的基因AtABI5以及与脱落酸信号传导相关的转录因子基因AtMYC2的表达量与野生型相比无显著差异，而盐胁迫处理后，过表达株系中AtABI5和AtMYC2基因的表达量显著高于野生型，说明结缕草ZjWRKY63基因可能通过脱落酸途径发挥耐盐性功能。另外，对胁迫应激相关基因AtDREB1A和AtCOR15A的定量分析发现，与野生型相比转基因植物中AtDREB1A和AtCOR15A的表达量在盐胁迫后同样显著增加，表明过表达结缕草ZjWRKY63基因同样能够促进胁迫应激相关基因的表达，进而提高了转基因植物的抗盐胁迫能力。

4 结论

本研究成功克隆了结缕草WRKY转录因子基因ZjWRKY63，该基因的开放阅读框为921 bp，编码306个氨基酸。生物信息学分析发现该基因具有1个WRKY功能保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序，属于WRKY IIa转录因子亚族。遗传进化分析表明结缕草ZjWRKY63与芦苇PaWRKY65亲缘关系最近。ZjWRKY63基因的耐盐性分析发现，过表达植株的种子萌发率、存活率和侧根数均显著高于野生型，初步表明该基因具有耐盐性功能。另外，对盐胁迫响应基因的表达分析发现，过表达植株中与离子稳态有关的基因、脱落酸生物合成与信号传导和应激反应等相关基因的表达在盐胁迫后显著增加，表明ZjWRKY63基因可能通过调节细胞内的离子稳态以及脱落酸途径来影响拟南芥对盐胁迫的耐受性。

参考文献

[1] Liu Y， Jiang W， Zhao W， et al. Effects of biochar application on soil properties and the growth of Melissa officinalis L. under salt stress. Scientia Horticulturae， 2024， 338（1）： 113704.

[2] Li J X， Bai X M， Zhang C， et al. Effects of different salt types on seed germination and seedling growth of Poa annua. Arid Zone Research， 2023， 40（7）： 1131-1140.

[3] 李娟霞， 白小明， 张翠， 不同盐分类型对一年生早熟禾种子萌发和幼苗生长的影响. 干旱区研究， 2023， 40（7）： 1131-1140.

[4] Wang R， Yu M Y， Cao Z J， et al. Effects of salt stress on seed germination characteristics of Poa pratensis L. Seed， 2024， 43（9）： 86-93， 100.

[5] 王蓉， 于铭玥， 曹志坚， 盐处理对草地早熟禾种子萌发特性的影响. 种子， 2024， 43（9）： 86-93， 100.

[6] Song X. Research progress on stress resistance of seashore paspalum. Modern Agricultural Science and Technology， 2024（11）： 126-132.

[7] 宋鑫. 海滨雀稗抗逆性研究进展. 现代农业科技， 2024（11）： 126-132.

[8] Zuo Z F， Lee H Y， Kang H G. Basic helix-loop-helix transcription factors： regulators for plant growth development and abiotic stress responses. International Journal of Molecular Sciences， 2023， 24（2）： 1419.

[9] Lata C， Prasad M. Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（14）： 4731-4748.

[10] Rai G K， Mishra S， Chouhan R， et al. Plant salinity stress， sensing， and its mitigation through WRKY. Frontiers in Plant Science， 2023， 14（4）： 1238507.

[11] Johnson C S， Kolevski B， Smyth D R. TRANSPARENT TESTA GLABRA2， a trichome and seed coat development gene of Arabidopsis， encodes a WRKY transcription factor. The Plant Cell， 2002， 14（6）： 1359-1375.

[12] Rushton P J， Somssich I E， Ringler P， et al. WRKY transcription factors. Trends in Plant Science， 2010， 15（5）： 247-258.

[13] Eulgem T， Rushton P J， Robatzek S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends in Plant Science， 2000， 5（5）： 199-206.

[14] Dong J X， Chen C H， Chen Z X， et al. Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response. Plant Molecular Biology， 2003， 51（1）： 21-37.

[15] Wu K L， Guo Z J， Wang H H， et al. The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins. DNA Research， 2005， 12（1）： 9-26.

[16] Eulgem T， Somssich I E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling. Current Opinion in Plant Biology， 2007， 10（4）： 366-371.

[17] Jiang J J， Ma S H， Ye N H， et al. WRKY transcription factors in plant responses to stresses. Journal of Integrative Plant Biology， 2017， 59（2）： 86-101.

[18] Liang C P， Chen L G. Preliminary exploration of the mechanism by which AtWRKY45 regulates salt tolerance in Arabidopsis thaliana. Seed Science and Technology， 2024， 42（17）： 13-17.

[19] 梁承萍， 陈利钢. AtWRKY45调控拟南芥耐盐性的机制初探. 种子科技， 2024， 42（17）： 13-17.

[20] Zhou S， Zheng W J， Liu B H， et al. Characterizing the role of TaWRKY13 in salt tolerance. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（22）： 5712.

[21] Zhu D， Hou L X， Xiao P L， et al. VvWRKY30， a grape WRKY transcription factor， plays a positive regulatory role under salinity stress. Plant Science， 2018， 280： 132-142.

[22] Li X， Ye G， Shen Z， et al. Na⁺ and K⁺ homeostasis in different organs of contrasting Zoysia japonica accessions under salt stress. Environmental and Experimental Botany， 2023， 214： 105455.

[23] Bao W， Wang X， Chen M， et al. A WRKY transcription factor， PcWRKY33， from Polygonum cuspidatum reduces salt tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Reports， 2018， 37（7）： 1033-1048.

[24] Cai R， Dai W， Zhang C， et al. The maize WRKY transcription factor ZmWRKY17 negatively regulates salt stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Planta， 2017， 246： 1215-1231.

[25] Zhao K， Zhang D， Lv K， et al. Functional characterization of poplar WRKY75 in salt and osmotic tolerance. Plant Science， 2019， 289： 110259.

[26] Yuan Y， Son J H， Park M Y， et al. Overexpression of ZjWRKY10， a Zoysia japonica WRKY transcription factor gene， accelerates leaf senescence and flowering in transgenic Arabidopsis. Journal of Plant Biotechnology， 2024， 51（1）： 1-10.

[27] He X， Duan H L， Luo L J， et al. Morphological characteristics variations of germplasm resources in Zoysia Willd. Molecular Plant Breeding， 2024， 22（13）： 4364-4376.

[28] 何潇， 段宏利， 罗丽娟， 结缕草属种质资源形态特征变异. 分子植物育种， 2024， 22（13）： 4364-4376.

[29] Li H， Li D F， Deng Y， et al. Expression analysis of abiotic stress response gene HcWRKY71 in kenaf and transformation of Arabidopsis. Acta Agronomica Sinica， 2021， 47（6）： 1090-1099.

[30] 李辉， 李德芳， 邓勇， 红麻非生物逆境胁迫响应基因HCWRKY71表达分析及转化拟南芥. 作物学报， 2021， 47（6）： 1090-1099.

[31] Li Y， Mi X F， Yan L， et al. Cloning and salt tolerance analysis of UDP-glycosyltransferases UGT72B3 gene in Carex rigescens. Chinese Journal of Grassland， 2023， 45（8）： 10-22.

[32] 李岩， 米鑫丰， 闫丽， 白颖苔草UDP-糖基转移酶UGT72B3基因的克隆与耐盐性分析. 中国草地学报， 2023， 45（8）： 10-22.

[33] Li Y， Yang Q， Huang H， et al. Overexpression of PvWAK3 from seashore paspalum increases salt tolerance in transgenic Arabidopsis via maintenance of ion and ROS homeostasis. Plant Physiology and Biochemistry， 2024， 207： 108337.

[34] Yu Y G， Wu Y X， He L. A wheat WRKY transcription factor TaWRKY17 enhances tolerance to salt stress in transgenic Arabidopsis and wheat plant. Plant Molecular Biology， 2023， 113（4）： 171-191.

[35] Wang J J， An C， Guo H L， et al. Physiological and transcriptomic analyses reveal the mechanisms underlying the salt tolerance of Zoysia japonica Steud. BMC Plant Biology， 2020， 20： 1-16.

[36] Yamasaki K， Kigawa T， Seki M， et al. DNA-binding domains of plant-specific transcription factors： structure， function， and evolution. Trends in Plant Science， 2013， 18（5）： 267-276.

[37] Zhang H Y， Liu Y W， Yang J F， et al. Identification and analysis of salt tolerance of wheat transcription factor TaWRKY33 protein. Scientia Agricultura Sinica， 2018， 51（24）： 4591-4602.

[38] 张惠媛， 刘永伟， 杨军峰， 小麦转录因子基因TaWRKY33的耐盐性分析. 中国农业科学， 2018， 51（24）： 4591-4602.

[39] Qin Y， Tian Y， Liu X. A wheat salinity-induced WRKY transcription factor TaWRKY93 confers multiple abiotic stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 464（2）： 428-433.

[40] Lv B B， Wu Q， Wang A H， et al. A WRKY transcription factor， FtWRKY46， from Tartary buckwheat improves salt tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry， 2020， 147： 43-53.

[41] Li P L， Song A P， Gao C Y， et al. Chrysanthemum WRKY gene CmWRKY17 negatively regulates salt stress tolerance in transgenic chrysanthemum and Arabidopsis plants. Plant Cell Reports， 2015， 34（8）： 1365-1378.

[42] Muchate N S， Nikalje G C， Rajurkar N S， et al. Plant salt stress： adaptive responses， tolerance mechanism and bioengineering for salt tolerance. The Botanical Review， 2016， 82（4）： 371-406.

[43] Wang Q， Guan C， Wang P， et al. The effect of AtHKT1； 1 or AtSOS1 mutation on the expressions of Na⁺ or K⁺ transporter genes and ion homeostasis in Arabidopsis thaliana under salt stress. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（5）： 1085.

[44] Shi H Z， Zhu J K. Regulation of expression of the vacuolar Na⁺/H⁺ antiporter gene AtNHX1 by salt stress and abscisic acid. Plant Molecular Biology， 2002， 50（3）： 543-550.

[45] Ryu H， Cho Y G. Plant hormones in salt stress tolerance. Journal of Plant Biology， 2015， 58（3）： 147-155.

[46] Mahajan S， Tuteja N. Cold， salinity and drought stresses： an overview. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2005， 444（2）： 139-158.

基金资助

青岛农业大学高层次人才启动基金(665/1121011)