神农香菊CiMYB4基因分析及其抗旱功能鉴定

Bioinformatics analysis of CiMYB4 in Chrysanthemum indicum var. aromaticum and functional characterization of its role in drought resistance

摘要

干旱是影响菊花地理分布和生长发育的一个重要环境因子，MYB作为植物重要的转录因子家族广泛参与非生物胁迫的调控过程。本研究通过对课题组前期从神农香菊中克隆获得的CiMYB4基因以及启动子序列进行生物信息学分析，并测定干旱胁迫处理后过表达CiMYB4烟草和野菊株系的生理指标，初步解析CiMYB4在干旱胁迫中的功能。研究结果表明：CiMYB4开放阅读框全长846 bp，编码281个氨基酸，属于R2R3-MYB亚族，定位在细胞核中。CiMYB4启动子序列中存在7个与干旱胁迫相关的顺式作用元件，其中4个为脱落酸（ABA）响应元件，3个为STRE干旱胁迫响应元件。在干旱处理7和14 d时，过表达CiMYB4烟草和野菊株系的丙二醛（MDA）含量均显著低于野生型（P<0.05），而脯氨酸（Pro）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性均显著高于野生型（P<0.05）。综合上述结果可知，CiMYB4在干旱胁迫中具有正向调控功能，是培育抗旱性强的菊花新品种潜在的基因资源。

Abstract

Drought is an important environmental factor affecting the geographical distribution and growth of chrysanthemums （Chrysanthemum×morifolium）. The MYB transcription factors， as a significant family of plant transcription factors， are widely involved in the regulation of responses to abiotic stresses. In this research， the CiMYB4 gene and its promoter sequence were cloned from Chrysanthemum indicum var. aromaticum and bioinformatics analyses were conducted. Additionally， the physiological indices of transgenic tobacco （Nicotiana tabacum） and C. indicum lines overexpressing CiMYB4 were measured during a drought stress treatment to provide preliminary insights into its function in the drought response. The results showed that the length of the CiMYB4 open reading frame was 846 bp， encoding a protein consisting of 281 amino acids. The protein was identified as a member of the R2R3-MYB subfamily and was predicted to localize to the nucleus. The promoter region of CiMYB4 contained seven cis-elements associated with drought stress， including four abscisic acid response elements and three STRE drought response elements. At 7 and 14 days of a drought treatment， the malondialdehyde content was significantly lower in CiMYB4-overexpressingtobacco and CiMYB4-overexpressingchrysanthemum plants than in their respective wild-type controls （P<0.05）， whereas the proline content and the activities of superoxide dismutase and catalase were significantly higher than those of the wild type controls （P<0.05）. Together， these results demonstrate that CiMYB4 plays a positive regulatory role in drought stress responses and it is a potential genetic resource for developing new chrysanthemum cultivars with enhanced drought tolerance.

Graphical abstract

关键词

神农香菊 / CiMYB4 / 启动子 / 抗旱

Key words

Chrysanthemum indicum var. aromaticum / CiMYB4 / promoter / drought resistance

水资源的充分供给是植物正常生长的保障，缺水会导致植物遭受干旱胁迫，影响植物正常的生长发育以及生理代谢，甚至会造成植物死亡的严重后果^［1］。植物为了应对干旱胁迫的不利影响，已在形态、生理生化以及分子机制等方面进化出多种应对策略。在形态建成策略上，植物通过增加深层根系数量、缩小叶面积和关闭气孔等方式达到增加水分吸收，减少蒸腾水分损失，提高水分利用效率的目的^［2-5］；在生化水平上，植物可以通过提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）等保护性酶活性减少干旱引发的氧化损伤^［6］，还可以通过提高渗透调节物质和次生代谢物含量维持细胞内外渗透压的平衡^［7-8］；在分子机制方面，植物可以通过激活MYB、WRKY、NAC和bZIP等转录因子调控靶基因的表达，提高植物的抗旱能力^［9-13］。

MYB转录因子是植物中成员数量最多的基因家族之一^［14］，其典型特征为N端有1~4个不完全重复且高度保守的MYB结构域。根据不完全重复的MYB结构域（R1，R2和R3）数量，将该家族成员分为4个亚族：1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB。研究发现大多数MYB转录因子家族成员仅包含两个不完全重复的MYB结构域序列，属于R2R3-MYB亚族，它们可以特异性结合靶基因启动子上的顺式作用元件来激活或抑制其转录^［15-16］。研究表明R2R3-MYB亚族基因在调控植物响应非生物胁迫中发挥重要作用。在野菊（Chrysanthemum indicum）中过表达神农香菊（C. indicum var. aromaticum）的CiMYB4基因，能显著提高镉胁迫下转基因株系的抗氧化酶活性以及镉富集转运能力^［17］。白梨（Pyrus bretschneideri）的PbMYB1L基因可通过上调AtCBF1， AtCBF2， AtCBF3和AtCBF4基因的表达增强转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系的低温耐受性^［18］。更多的研究发现许多R2R3-MYB亚族转录因子参与植物干旱胁迫响应。在棉花（Gossypium hirsutum）中沉默GhMYB3可以提高抗氧化酶活性，减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，除此之外还能够通过关闭气孔减少水分蒸发，提高棉花的抗旱性^［19］。ZmMYB56通过特异性结合ZmTOM7启动子上的顺式作用元件激活其转录，诱导玉米（Zea mays）叶片气孔关闭，减少水分蒸发^［20］。在杨树（Populus tomentosa）中过表达PtoMYB142可以靶向激活CER4和KCS6的转录，增加叶片蜡质合成，增强杨树耐旱性^［21］。ZmMYB153通过参与脱落酸（abscisic acid，ABA）信号途径，调节玉米气孔活动，从而影响植物的干旱耐受性^［22］。以上研究结果表明R2R3-MYB亚族基因能通过协调不同的路径调控植物响应干旱胁迫，然而有关菊花（Chrysanthemummorifolium）R2R3-MYB转录因子家族响应干旱胁迫的研究相对较少。

菊花常作为鲜切花和景观绿化花卉使用，具有重要的经济和观赏价值，在花卉市场中占据不可替代的地位。干旱作为一种常见的胁迫因子，严重威胁菊花的生长和产量，制约菊花的地理分布和应用范围，大大降低了菊花的经济效益和观赏价值，是菊花生命周期中最大的非生物胁迫之一。鉴于此，提高菊花的抗旱能力是园林花卉产业发展中一个亟待解决的难题。因此本研究对课题组前期从神农香菊中克隆获得的CiMYB4基因以及启动子序列进行生物信息学分析，以过表达CiMYB4烟草（Nicotiana tabacum）和野菊株系为试验材料^［23-25］，通过观察干旱胁迫后的表型以及测定相关生理指标，以期明确CiMYB4的抗旱功能，为培育抗旱性强的菊花新品种提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019年9月在东北林业大学园林学院人工栽培室进行。人工栽培室环境条件为：温度24~26 ℃，相对湿度60%~70%，12 h光照，白天光照强度为480 μmol·m^-2·s^-1。将实验室前期已获得的3个过表达CiMYB4（OX-1、OX-2、OX-3）和转空载（KZ）烟草株系的T₂代以及野生型（CK）烟草株系的种子置于1.5 mL离心管中浸泡24 h， 播种基质采用70%腐殖土+30%蛭石混合，经120 ℃高温灭菌后装入直径为10 cm，高为12 cm的花盆中，采用浸盆法充分浸润盆中的栽培基质，然后将浸泡后的烟草种子均匀地撒播在播种基质表层，覆膜保湿保温。待烟草幼苗长出2片真叶后，将其分别移栽至直径为14 cm，高为16 cm的花盆中，种植基质为经灭菌的60%腐殖土+20%珍珠岩+20%蛭石的混合基质。待烟草长至6~7片真叶时，分别选取状态良好且长势一致的不同株系的烟草开始进行自然干旱处理，每个株系处理30盆。于0、7、14和21 d进行表型观察和生理指标的测定，每个株系不同处理时间随机选取3盆测定，并重复3次。选择课题组已获得的2个过表达CiMYB4（COX-1、COX-2）、转空载（CKZ）以及野生型（WT）生长状态良好的野菊株系，剪取带顶芽长约4~5 cm的茎段作为插条，扦插于充分湿润的黄沙中，然后覆膜保湿。待插条生根后种植于直径为14 cm，高为16 cm的花盆中，种植基质同烟草。常规养护15 d后进行自然干旱处理，每个株系处理30盆。于0、7和14 d进行表型观察和生理指标的测定，每个株系不同处理时间随机选取3盆测定，并重复3次。

1.2 CiMYB4蛋白的生物信息学分析

利用NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）对CiMYB4蛋白质进行理化特性分析，利用SOPMA 2.0分析预测CiMYB4蛋白质的二级结构。

1.3 亚细胞定位

利用基因枪法将构建好的35S∷CiMYB4-GFP以及35S∷GFP载体轰击转化洋葱（Allium cepa）表皮细胞^［26］，将转化后的洋葱表皮细胞置于25 ℃环境中暗培养16~24 h后利用激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM800， 德国）观察荧光信号位置。

1.4 CiMYB4启动子序列顺式作用元件分析

使用PlantCare在线数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析预测课题组前期克隆得到的CiMYB4启动子序列中所包含的顺式作用元件。

1.5 CiMYB4启动子β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）活性检测

根据PlantCare预测的结果，将启动子进行5′端缺失分段克隆，并参照ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）说明书设计添加包含HindⅢ酶切位点的上游同源臂引物P-F、P1-F、P2-F、P3-F、P4-F和添加包含BamHⅠ酶切位点的下游同源臂引物P-R，引物序列见表1。利用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶线性化pBI121-GUS载体，将以上5段带有同源臂的启动子序列参照ClonExpress®Ⅱ One Step Cloning Kit说明书进行同源重组，重组质粒结构如图1所示。参照说明书所述步骤将阳性对照组35S∷GUS和P∷GUS、P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS以及P4∷GUS重组质粒转化到农杆菌感受态细胞EHA105（上海唯地生物技术有限公司）中，以4周龄的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）顶部第2~4片完全展开的叶片为试验材料，利用注射器将35S∷GUS、P∷GUS、P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS以及P4∷GUS农杆菌侵染液和阴性对照缓冲液注射至本氏烟草叶片中，擦除叶片上多余的菌液，黑暗环境中静置12 h后，于昼夜为16 h/8 h光环境中培养24 h，参照GUS染色试剂盒法（北京酷来搏科技有限公司）对本氏烟草叶片进行染色。染色结束后用70%乙醇溶液将染色后的叶片进行脱色，直至阴性对照叶片变为白色。

1.6 生理指标的测定

选取烟草植株茎顶部第3~4片成熟完整的叶片，野菊植株顶部第3~5片成熟完整的叶片，用锡箔纸包裹后迅速置于液氮中带回实验室，用于各项生理指标的测定。采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用酸性茚三酮法测定脯氨酸（proline，Pro）含量；采用氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）光化学还原法测定SOD活性；采用紫外分光光度法测定CAT活性^［27］。

1.7 数据整理与分析

用Excel 2016对数据进行整理和作图，利用SPSS 22.0对数据进行方差分析，用Duncan法进行多重比较（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 CiMYB4生物信息学分析

本研究以神农香菊叶片cDNA为模板克隆获得了CiMYB4基因，登录号为MH142214，其长度为846 bp（图2A），编码281个氨基酸。CiMYB4蛋白的二级结构以无规则卷曲为主（图2B），占比58.36%，α螺旋占比24.91%，β转角占比5.69%，延伸链占比11.03%。CiMYB4氨基酸序列在67~114 aa处和69~112 aa处有两个植物MYB转录因子家族的特异性SANT（MYB-DNA-binding）结构域，属于R2R3-MYB亚族（图2C）。

2.2 CiMYB4亚细胞定位

将构建好的35S∷CiMYB4-GFP以及35S∷GFP载体利用基因枪法转化洋葱表皮细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示（图3），在转化35S∷GFP空载体的洋葱表皮细胞的细胞膜与细胞核中均能观察到绿色荧光，而在转化35S∷CiMYB4-GFP融合载体的洋葱表皮细胞中仅有细胞核发出绿色荧光，证明CiMYB4定位在细胞核中。

2.3 CiMYB4启动子顺式作用元件分析

启动子在启动和调控基因转录表达的过程中发挥重要作用，而启动子上的顺式作用元件又与该基因的调控表达网络以及功能密切相关，因此对于基因启动子的研究能为后续研究基因功能奠定基础。为进一步探究CiMYB4的潜在功能，利用在线软件PlantCare对课题组前期已克隆获得的2001 bp的CiMYB4基因启动子序列进行分析。结果表明（表2和图4）CiMYB4基因启动子具有2类结构元件，包括50个TATA-box核心启动子元件以及35个CAAT-box启动子和增强子区域调控元件，具备启动子的典型特征；3类激素响应元件，包括3个ABRE、1个AAGAA-motif脱落酸响应元件和1个TGA-element生长素响应元件；3类胁迫相关的响应元件，包括1个LTR低温响应元件，3个STRE干旱胁迫响应元件，2个TC-rich repeats防卫和胁迫响应元件；7类光响应元件，包括2个G-box元件、1个GATA-motif元件、3个GT1-motif元件、1个I-box元件、2个Box 4元件、1个chs-CMA1a元件以及1个MRE元件；1类参与分生组织表达的CAT-box元件；此外，该启动子还具有7个MYB结合位点、3个MYC结合位点以及2类未知功能元件（A-box和AT~TATA-box）。通过对该启动子的分析，发现该启动子区域具有7个干旱胁迫响应相关的顺式作用元件（4个ABA响应元件和3个STRE元件），因此推测CiMYB4可能参与神农香菊的干旱胁迫响应。

2.4 CiMYB4启动子活性分析

对瞬时转化后的烟草叶片GUS染色后利用脱色液脱色，该启动子5′端不同长度缺失片段活性分析结果表明，5段5′端缺失片段均具有GUS活性（图5），表明这5段启动子片段均能启动基因的表达，但GUS活性差异明显，其中 P及P3段GUS活动较强，P1、P2、P4 段GUS活性较弱，表明-954至-417 bp启动子区域是启动基因转录的关键区域，这可能与该区域内存在多种顺式作用元件，且各元件之间相互串联发挥的协同作用有关。

2.5 CiMYB4转基因烟草抗旱性分析

不同时间干旱胁迫后，不同烟草株系的表型出现了明显不同（图6）。干旱胁迫7 d时所有烟草株系均出现了不同程度的萎蔫，但3个过表达株系（OX-1、OX-2、OX-3）的萎蔫程度轻于2个对照株系（CK和KZ）。干旱胁迫14 d时，CK和KZ株系几乎所有叶片枯黄萎蔫，而OX-1和OX-3株系大部分叶片仍保持正常状态，OX-2株系顶端部分保持正常状态。干旱胁迫21 d时，CK和KZ株系几乎全部枯死，而3个过表达株系（OX-1、OX-2、OX-3）顶端叶片仍有部分保持绿色、挺立状态，这表明CiMYB4作为正向调控因子调控转基因烟草的抗旱性。

不同时间干旱胁迫对不同烟草株系的生理指标产生了显著影响（P<0.05，图7）。MDA是膜脂过氧化的最终产物，是衡量植物受损伤程度的重要指标。随着干旱时间的延长，不同烟草株系的MDA含量均显著升高（P<0.05），其中CK和KZ株系在干旱21 d时死亡，无法测得相应指标。干旱14 d的CK和KZ株系MDA含量分别为干旱0 d时的4.91和5.43倍，而OX-1、OX-2和OX-3烟草株系的MDA含量在干旱21 d时达到最高，分别为干旱0 d时的4.00、3.81和3.66倍。不同烟草株系间的Pro含量随着干旱时间的增加均呈先升高后降低的变化趋势，2个对照组株系（CK和KZ）和3个转基因烟草株系（OX-1、OX-2、OX-3）的Pro含量均在干旱7 d时达到最高，且显著高于干旱0 d时的含量（P<0.05），分别为干旱0 d时的3.05、3.11、3.66、3.61和3.82倍。不同烟草株系的SOD和CAT活性随着干旱时间的增加发生了显著的变化（P<0.05）。5个烟草株系的SOD和CAT活性均在干旱7 d时达到最高，随后显著降低（P<0.05），表明这两种酶在应对干旱胁迫时存在明显的阈值。OX-1、OX-2和OX-3烟草株系的SOD和CAT活性在干旱7和14 d时均显著高于CK和KZ株系（P<0.05）；且在干旱14 d时差异最大，其中OX-1、OX-2和OX-3烟草株系SOD活性的平均值分别较CK和KZ株系显著提高82.83%和71.44%（P<0.05），OX-1、OX-2和OX-3烟草株系CAT活性的平均值较CK和KZ株系分别显著提高98.25%和99.68%（P<0.05）。

2.6 CiMYB4转基因野菊抗旱性分析

随着干旱时间的增加，不同的野菊株系产生了明显的变化（图8）。干旱胁迫7 d时，WT和CKZ株系叶片出现明显的萎蔫，而2个过表达CiMYB4野菊株系（COX-1和COX-2）依然保持正常的生长状态。干旱胁迫14 d时，WT和CKZ株系萎蔫倒伏，而COX-1和COX-2株系出现部分萎蔫现象，但茎秆依然呈直立状态。

不同时间干旱胁迫对不同野菊株系产生了显著影响（P<0.05，图9）。干旱0 d时4个株系野菊的MDA含量无显著差异（P>0.05），而在干旱7和14 d时，COX-1和COX-2株系的MDA含量显著低于WT和CKZ株系，其中在干旱14 d时差异最大，COX-1株系的MDA含量分别为WT和CKZ株系的57.97%和60.17%，COX-2株系的MDA含量分别为WT和CKZ株系的52.18%和54.16%。随着干旱时间的增加，不同株系野菊的Pro含量与干旱0 d相比显著增加（P<0.05），且干旱7和14 d时，COX-1和COX-2株系的Pro含量均显著高于WT和CKZ株系（P<0.05）。随着干旱时间的增加，不同株系野菊的SOD和CAT活性均呈先升高后降低的趋势。在干旱7和14 d时，COX-1和COX-2株系的SOD和CAT活性均显著高于WT和CKZ株系（P<0.05）。在干旱7 d时，COX-1和COX-2株系的SOD和CAT活性均达到最高，其中COX-1的SOD和CAT活性分别为0 d时的3.44和4.94倍，COX-2的SOD和CAT活性为0 d时的3.34和4.57倍。在干旱14 d时WT和CKZ的SOD和CAT活性显著低于0 d（P<0.05），这可能是由于干旱14 d对WT和CKZ株系造成了不可逆的损伤。

3 讨论

MYB是植物中最大的转录因子家族之一，不仅参与植物的初级和次级代谢，还参与多种生物和非生物胁迫的响应^［28］。MYB转录因子家族分为4个亚族，其中大多数MYB转录因子都属于R2R3-MYB亚族^［29-30］，该亚族在植物抗逆中发挥重要作用。在矮牵牛（Petunia hybrida）、铁皮石斛（Dendrobium officinale）、银杏（Ginkgo biloba）、拟南芥、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、烟草和大豆（Glycine max）中分别鉴定出106、99、69、137、95、393、174和288个R2R3-MYB亚族基因^{［28，31-37］}，其中许多基因已被证明能够响应干旱、高温、盐碱、重金属等非生物胁迫。本研究通过对CiMYB4基因的生物信息学分析发现，CiMYB4有两个植物MYB转录因子家族的特异性SNAT结构域，属于R2R3-MYB亚族。亚细胞定位在转录因子的功能发挥以及基因表达调控机制的研究中具有重要意义。目前绝大多数转录因子都定位在细胞核中，但也有少部分转录因子定位在质膜和细胞核中，这可能与蛋白修饰和磷酸化有关^［38-39］。CiMYB4只定位在细胞核中，表明其只在细胞核中发挥作用。

转录因子通过结合靶基因启动子的顺式作用元件调控下游功能基因的转录表达，所以在鉴定基因功能时，分析其启动子区域包含的顺式作用元件类型及数量显得尤为重要。启动子通常是指位于基因5′ UTR上游，能够与RNA聚合酶特异性结合并启动转录的非编码核苷酸序列，一般包括核心启动子区、上游元件和应答元件3个部分^［40］，其中应答元件是转录因子识别并结合的序列，与基因功能的发挥密切相关，常见的应答元件有茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif）、脱落酸响应元件（ABRE）、生长素响应元件（TGA-element）、水杨酸响应元件（TCA-element）、光响应元件（G-box）、低温响应元件（LTR）以及MYB（CAACCA）、WRKY（W-box）、MYC（CATGTG）等转录因子特异性结合顺式作用元件。本研究发现CiMYB4的启动子序列中具有3类激素响应元件、3类胁迫相关的响应元件、7类光响应元件、7个MYB结合位点以及3个MYC结合位点，其中有7个顺式作用元件与干旱调控相关，这表明CiMYB4能够参与植物多种生理功能的调控，尤其是在干旱胁迫中发挥重要作用。

干旱是限制植物生长发育的非生物因素，一直都是植物胁迫研究的热点。在干旱胁迫下，植物可以通过调控细胞运动、基因表达和抗氧化系统活性等方式增强对干旱胁迫的耐受性。其中抗氧化酶系统是降低植物ROS损伤的重要屏障，SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性在胁迫条件下会被快速激活，以清除细胞内积累的H₂O₂和O₂^·-［41］，从而达到保护植物细胞的目的。不同类型的酶发挥不同的功能。SOD首先将O₂^·-转化为H₂O₂和O₂，然后分解产生的H₂O₂和内源H₂O₂刺激POD和CAT活性。本研究发现过表达CiMYB4的野菊和烟草株系在干旱处理7和14 d时的SOD和CAT活性均显著高于转空载和野生型株系（P<0.05），这表明CiMYB4基因可能会激活抗氧化酶相关基因的表达以增强SOD和CAT的活性，清除植株体内由于干旱胁迫过量累积的ROS，这与Zhu等^［19］的研究结果一致。当胁迫导致的ROS积累量超过抗氧化酶的清除能力时，细胞膜就会发生过氧化反应，导致细胞液外渗，造成植物生理代谢紊乱。MDA是膜脂过氧化的最终产物，也是膜系统受损的重要标志之一^［42］。过表达CiMYB4的野菊和烟草株系MDA含量虽然也随干旱胁迫时间的延长显著升高（P<0.05），但均低于转空载和野生型株系。这一方面说明抗氧化酶清除ROS有明显的阈值，另一方面也表明CiMYB4基因是响应干旱胁迫的正调控因子。除抗氧化酶系统外，Pro作为一种渗透调节物质也被证明是有效的自由基清除剂，在稳定原生质胶体、细胞代谢过程、维持渗透调节平衡等方面起重要作用^［43-44］。过表达CiMYB4的野菊和烟草株系在干旱胁迫下可显著增加Pro含量（P<0.05），这表明CiMYB4可协同调控渗透调节系统与抗氧化酶系统增强植株的抗旱能力。

4 结论

神农香菊CiMYB4基因编码281个氨基酸，属于R2R3-MYB亚族，定位于细胞核中。启动子区域包含7个响应干旱的顺式作用元件。在烟草和野菊中过表达CiMYB4基因能通过提高抗氧化酶活性以及Pro含量增强转基因株系的抗旱性。本研究明确了CiMYB4基因是一个抗干旱胁迫的正向调控因子，为菊花抗旱新品种的选育提供了基因资源，具体的抗旱调控机制需后续进一步研究。

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基金资助

中央高校基本科研业务费专项资金(2572022AW15)