藜麦种子可培养内生真菌鉴定及分析

Identification and analysis of culturable endophytic fungi from quinoa seeds

摘要

藜麦作为一种新引入我国的作物，因其超高的营养价值而备受瞩目。为明确藜麦种子内生真菌的种群结构和功能特性，对4个品种藜麦种子可培养内生真菌进行分离培养，综合形态学和系统发育分析对其进行了鉴定，并对其致病性和抑菌作用进行了探究。结果表明，4种藜麦种子中分离到6属9种可培养内生真菌，包含链格孢、黄曲霉、聚多曲霉、布氏镰孢、棒状镰孢、甜菜新凸轮孢、藜新凸轮孢、草酸青霉和斯托尔篮状菌。链格孢是4个品种都包含的内生菌，分离频率最高，为64.42%，其次为黄曲霉和草酸青霉，分离频率依次为11.66%、9.20%。9种可培养内生真菌中，5种可侵染藜麦叶片，为布氏镰孢、棒状镰孢、链格孢、藜新凸轮孢和甜菜新凸轮孢；2种对藜麦病原（灰葡萄孢、茎生壳二胞菌、柑橘镰孢、链格孢、粉红单端孢）有抑制作用，为草酸青霉和斯托尔篮状菌。藜麦种子可培养内生真菌种群结构丰富，在植物病害生物防治方面具有重要的应用潜力。

Abstract

Quinoa （Chenopodium quinoa） is a newly introduced crop in China， and it is attracting much interest because of its high nutritional value. In this study， we aimed to clarify the population structure and functional characteristics of endophytic fungi in quinoa seeds. Culturable endophytic fungi were isolated from seeds of four varieties of quinoa. The fungi were cultured， identified on the basis of morphological and phylogenetic analyses， and their pathogenicity and antifungal effects were explored. In total， nine culturable endophytes were isolated from the quinoa seeds. They comprised nine species of six genera， namely， Alternaria alternata， Aspergillus flavus， Aspergillus sydowii， Fusarium boothii， Fusarium clavum， Neocamarosporium betae， Neocamarosporium chenopodii， Penicillium oxalicum， and Talaromyces stollii. A. alternata was present in seeds of all four varieties， and had the highest isolation frequency （64.42%）. The fungi with the next highest isolation frequencies were A. flavus and P. oxalicum （11.66% and 9.20%， respectively）. Among the nine culturable endophytic fungi， five （F. boothii， F. clavum， A. alternata， N. chenopodii， and N. betae） were able to infect quinoa leaves， and two （P. oxalicum and T. stollii） showed inhibitory effects against quinoa pathogens （Botrytiscinerea， Ascochytacaulina， Fusariumcitri， A. alternata， Trichotheciumroseum）. The culturable endophytic fungi in quinoa seeds showed a rich population structure and have potential applications in the biological control of plant diseases.

Graphical abstract

关键词

藜麦 / 可培养内生真菌 / 种群 / 系统发育

Key words

quinoa / culturable endophytic fungi / population / phylogeny

藜麦（Chenopodium quinoa）属于苋科藜属，一年生双子叶植物，根据花着生位置可分为3类：苋菜型、中间型、团伞型^［1］。藜麦富含人体所需优质蛋白，是联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations， FAO）推荐的全营养食品^［2］。同时藜麦含有黄酮、多酚和皂苷等功能性化合物，在抗氧化、降低血糖、抑制肥胖及增强免疫力等方面有一定的作用^［3-4］。藜麦在医疗方面也具有较高价值，藜麦中所含的阿拉伯多糖可用来治疗溃疡，其中的天然植物激素可以用于临床降脂、降压和预防心脑血管硬化等疾病^［5］。藜麦还因其特殊的营养价值具有较高的饲用价值，制作成各种高营养的饲料^［6］。近年来，我国藜麦种植面积不断扩大，主要产区为甘肃省、内蒙古自治区、山西省、云南省、青海省等^［7］。2023年有“中国藜麦之乡”美称的静乐县藜麦种植面积已达3333 hm²，成功带动种植户实现增收，成为当地的特色主导产业。

藜麦适应能力较强，在极限土质中都能生长，具有耐寒、耐旱、耐盐、抗贫瘠等应对非生物胁迫的能力^［8］。研究表明内生菌在提高耐盐碱、抗寒、抗旱等方面发挥着重要作用^［9］。Jacobsen等^［10］研究表明，在干旱条件下，藜麦通过关闭叶片气孔保持叶片水分。脱落酸对处于干旱条件下藜麦的气孔保卫细胞起作用。Adolf等^［11］研究发现，藜麦的耐盐性机制关键在于能有效控制液泡和木质部中的Na⁺，并且有更高的活性氧簇耐受性。

植物内生真菌种类复杂，主要包括子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota），其中大部分为子囊菌门，而链格孢属（Alternaria）、镰孢属（Fusarium）、茎点霉属（Phoma）、拟茎点霉属（Phomopsis）、刺盘孢属（Colletotrichum）等为内生真菌常见菌属^［12］。如唐琦勇等^［13］发现，链格孢属、新凸轮孢属（Neocamarosporium）和镰孢属为新疆北疆6个地区盐角草（Salicornia europaea）内生真菌群落的优势属；王世苗^［14］从郁金香（Tulipa gesneriana）中共分离到内生真菌33株，其中链格孢属和镰孢属为优势属；宋静静等^［15］从杨叶肖槿（Thespesia populnea）中共分离到内生真菌60株，归为5属25种，刺盘孢属（48.33%）和间座壳属（Diaporthe， 26.67%）为优势菌属；王红霞等^［16］从构树（Broussonetia papyrifera）的根、茎、叶和果实中分离到内生真菌187株，其中链格孢属（50.27%）和镰孢属（11.76%）为优势属。植物内生真菌与寄主植物存在密切关系。植物内生真菌对宿主的生长调节、次生代谢物合成以及抗逆性等方面起重要作用。一些植物内生真菌及其代谢产物在研究新型抗生素和抗癌药等方面展现出重要潜力^［17］。另外，一些植物内生真菌及其代谢产物在生物防治方面具有重要的潜力^［18］。

González-Teuber等^［19］发现，智利阿塔卡马沙漠的藜麦根系可培养内生真菌具有较高的多样性，以青霉属（Penicillium）为优势分离属，占可培养菌群的59%。呼荣等^［20］在青白藜（Quinoa）的患病茎秆和叶片内分离到可培养的内生真菌44株，优势属为链格孢属（71.40%）、毛壳属（Chaetomium， 36.70%）、青霉属（33.30%）。Xie等^［21］从藜麦不同生长发育阶段的根、茎、叶中共分离到可培养的内生真菌122株，其中成熟期可培养内生真菌数量最多，且不同部位所得可培养内生真菌数量不同，表现为根（66株）>茎（39株）>叶（17株）。朱雪峰等^［22］从藜麦种子中分离到内生真菌32株，并发现2株链格孢属真菌具有抑菌活性。王生萍等^［23］的试验结果表明，从西藏日喀则、拉萨和林芝3个地区的藜麦种子中分离到的可培养内生真菌均为子囊菌门，共26属77种，相对丰度最高的3个属为链格孢属（40.20%）、镰孢属（17.40%）和茎点霉属（13.90%）。目前关于藜麦内生真菌的研究主要集中在分离鉴定及种群多样性分析上，但对藜麦种子可培养内生真菌的种群结构缺乏较为系统的研究，在藜麦种子可培养内生真菌的致病力及抑菌作用方面报道较少。本研究旨在明确藜麦种子可培养内生真菌的种群结构，进一步丰富藜麦内生真菌资源库，为藜麦种子可培养内生真菌的潜在应用和植物病害生物防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

选择3个花序类型（中间型、苋菜型、团伞型）的4个藜麦品种，2024年6月在山西省忻州市繁峙县种植。种植地区属温带大陆性气候，年平均气温6.3 ℃，年降水量400 mm。每个小区种植1个藜麦品种，小区面积30 m²，随机排列，重复3次。采集4种藜麦灌浆期和成熟期的种子，样品置于1.5 mL离心管中，4 ℃保存。

1.2 供试菌株

供试5种病原菌分别为链格孢（Alternaria alternata）LGB-h、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）LMHM2、柑橘镰孢（Fusarium citri）LMSF-ld01、粉红单端孢（Trichothecium roseum）LMSF-fh05、茎生壳二胞菌（Ascochyta caulina）LMHS-3，均为本实验室分离保存菌种。

1.3 供试试剂、培养基和仪器

供试试剂：Taq PCR Master Mix、DNA Ladder Mix Marker、PCR引物、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar， PDA）：马铃薯葡萄糖琼脂粉46.0 g；麦芽浸粉琼脂培养基（malt extract agar medium， MEA）：麦芽浸粉琼脂粉48 g；孟加拉红培养基（rose bengal medium， RBM）：孟加拉红培养基粉36.7 g；燕麦琼脂培养基（oatmeal agar， OA）：燕麦琼脂粉72.5 g；察氏酵母膏琼脂培养基（czapek yeast autolysate agar， CYA）：察氏酵母膏琼脂粉55 g；氯硝胺18%甘油琼脂培养基［dichloran-glycerol （dg18） agar base， DG-18］：氯硝胺18%甘油琼脂粉31.6 g、甘油200 g；马铃薯胡萝卜琼脂培养基（potato carrot agar medium， PCA）：马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂粉18 g；合成低营养琼脂培养基（synthetic low nutrient medium， SNA）：参照Nirenberg^［24］的方法配制。以上所有培养基均用蒸馏水定容至1000 mL。

供试仪器：SW-CJ-FD型洁净工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；2720 Thermal Cycler PCR扩增仪：美国Applied Biosystems公司；DYY-5电泳仪：北京六一仪器厂；FR980凝胶成像系统：上海复日科技仪器有限公司；SMZ18体式显微镜及成像系统：日本Nikon公司；BX53微分干涉显微镜及成像系统：日本Olympus公司；Centrifuge 5425 R型冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司；GI54DWS型立式压力蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；WH-3微型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；RXZ-380D智能人工气候箱：宁波东南仪器有限公司；HGRF-9203热空气消毒箱：上海跃进医疗器械有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 可培养内生真菌的分离

将采集的藜麦种子4 ℃保藏，分离时供试种子标品依次用75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸钠浸泡5 min，75%乙醇浸泡1 min，无菌水漂洗3次，取最后一次漂洗液作为空白对照。将漂洗后的种子置于无菌环境中自然风干，然后接种至4种培养基（PDA、RBM、MEA和DG-18）表面，25 ℃黑暗培养，重复3次。待种子表面形成菌落后，用接种针挑取边缘菌丝于PDA上，25 ℃、12 h光照和12 h黑暗交替条件下培养，反复纯化3~5代，最后将纯化的菌株4 ℃低温保存。

对分离出的真菌菌株进行计数，并使用以下公式计算分离频率：

\mathrm{分离}\mathrm{频率}=\frac{\mathrm{某属}\mathrm{菌株}\mathrm{数量}}{\mathrm{总菌}\mathrm{株数}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.4.2 可培养内生真菌的形态学鉴定

用无菌打孔器（5 mm，中国）取内生真菌菌落边缘菌饼。分别接种到PDA、OA、MEA、CYA、SNA、PCA培养基上，25 ℃、12 h光照和12 h黑暗交替条件下培养5~15 d，测量各个菌株菌落直径和生长速率，观察菌落形态、颜色、质地以及是否产生孢子等特征。在Olympus显微镜（BX53，日本）下观察各菌株的产孢结构、分生孢子形态等，测量分生孢子、瓶梗等的大小。

1.4.3 可培养内生真菌的分子生物学鉴定

收集待测菌株菌丝，液氮研磨成粉，提取DNA，应用引物序列见表1。PCR反应体系（25 μL）：Taq PCR Master Mix_{12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所测菌株的相关序列在NCBI数据库中进行BLAST检索比对分析。结合相关菌株序列，采用邻接法（软件PAUP v. 4.0b10）进行系统发育分析，重复1000次。}

1.4.4 抑菌作用测定

将待测内生真菌的菌饼接种至距离PDA边缘5 mm处，在其中心对称点接种供试病原菌的菌饼，以只接种病原菌为对照，于25 ℃、12 h光照和12 h黑暗交替条件下培养，重复3次。7 d时观察并测量菌落半径，计算抑菌率。

\mathrm{抑菌}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{对照}\mathrm{的菌}\mathrm{落半}\mathrm{径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{处理}\mathrm{的菌}\mathrm{落半}\mathrm{径}(\mathrm{m}\mathrm{m})}{\mathrm{对照}\mathrm{的菌}\mathrm{落半}\mathrm{径}(\mathrm{m}\mathrm{m})-\mathrm{菌饼}\mathrm{半径}(\mathrm{m}\mathrm{m})}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.4.5 致病性测定

选取健康藜麦叶片经无菌水冲洗后自然风干。从培养7 d的待测内生真菌的菌落上取菌饼（直径5 mm），接种于叶片左上方，每株菌接种5片叶，以接种PDA为对照。接种后保湿置于25 ℃人工气候箱中，观察记录发病情况。发病后采集典型症状叶片，从病斑处重新分离病原菌，观察对比再分离菌株与接种菌株的形态特征。

2 结果与分析

2.1 藜麦种子可培养内生真菌种群分析

4个品种的藜麦种子中共分离到可培养内生真菌163株，依据形态学（菌落的颜色、大小、质地等）和分子生物学归为6属，分别为链格孢属、曲霉属（Aspergillus）、镰孢属、新凸轮孢属、青霉属、篮状菌属（Talaromyces）。其中9种可培养内生菌株鉴定到种，分别为链格孢、黄曲霉（Aspergillus flavus）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、布氏镰孢（Fusarium boothii）、棒状镰孢（Fusarium clavum）、甜菜新凸轮孢（Neocamarosporium betae）、藜新凸轮孢（Neocamarosporium chenopodii）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、斯托尔篮状菌（Talaromyces stollii）。链格孢是4个品种都包含的内生菌，分离频率最高，为64.42%，其次为黄曲霉、草酸青霉，分离频率依次为11.66%、9.20%。团伞型藜麦包含的内生菌最多，有链格孢、黄曲霉、棒状镰孢、藜新凸轮孢、草酸青霉共5种（表2）。

2.2 藜麦种子可培养内生真菌的鉴定

2.2.1 斯托尔篮状菌

代表菌株LMNS-G1P1在CYA培养7 d，菌落呈平坦、淡粉色、绒毛状、菌丝致密、边缘整齐、直径45~46 mm，背面呈橙黄色、边缘淡黄色（图1A）。MEA培养7 d，菌落中央呈绿色、棉絮状、边缘白色、整齐、直径43~45 mm，背面呈黄褐色（图1B）。分生孢子梗帚状、双轮生兼三轮生；梗基每轮3~6个，瓶梗披针形，每轮4~6个（图1C）；分生孢子椭球形，壁光滑，大小（2.5~3.6） μm×（1.6~2.5） μm，平均3.0 μm×2.2 μm（图1D）。

代表菌株LMNS-G1P1的ITS和CaM基因序列长度分别为557和499 bp。以Penicillium stolkiae（NRRL 5816）为外类群构建系统发育树，结果表明，菌株LMNS-G1P1与CBS408.93、JN1-1和HH1-1以100%的自展支持率聚为一个分支（图2A）。在斯托尔篮状菌株系间，菌株LMNS-G1P1与JN1-1、HH1-1聚类在一起，形成一个亚分支，支持率99%。综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-G1P1为斯托尔篮状菌。

2.2.2 草酸青霉

代表菌株LMNS-K3R2在PDA培养7 d，菌落呈平坦、中央淡粉色、绒状、边缘白色、具同心环纹、直径61~74 mm，分生孢子结构大量产生、孢子易脱落，背面呈浅棕色（图3A）。MEA培养7 d，菌落呈平坦、中央灰绿色、边缘白色、有同心环纹、直径77~82 mm，背面呈棕黄色（图3B）。分生孢子梗帚状、双轮生；梗基每轮2~3个，排列紧密；瓶梗披针形或圆柱形，每轮2~6个（图3C）；分生孢子椭球形，壁光滑，大小（3.2~5.9） μm×（2.0~3.7） μm，平均4.3 μm×2.8 μm（图3D）。

代表菌株LMNS-K3R2的CaM和ITS基因序列长度分别为623和565 bp。以P. stolkiae（NRRL 5816）为外类群构建系统发育树，结果表明，菌株LMNS-K3R2与CBS173.81、CBS219.30和CV0822以100%的自展支持率聚为一个分支。在草酸青霉株系间，菌株LMNS-K3R2与CBS173.81、CBS219.30聚类在一起，形成一个亚分支，支持率90%（图2A）。综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-K3R2为草酸青霉。

2.2.3 黄曲霉

代表菌株LMNS-K3D1在PDA培养7 d，菌落中央呈黄绿色、绒毛状、边缘白色、整齐、具多条辐射状沟纹、直径52~53 mm，背面呈淡黄色、有裂痕（图4A）。分生孢子梗顶端膨大成球形顶囊、棕褐色，表面产生辐射状小梗，顶端着生分生孢子（图4B，C）；分生孢子球形或卵圆形，大小（3.1~7.3） μm×（2.9~5.8） μm、平均4.7 μm×4.4 μm（图4D）。

代表菌株LMNS-K3D1的CaM和ITS基因序列长度分别为583和594 bp。将其ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与黄曲霉（NRRL1957、DTO：245-A7、DTO：132-A4）的相似性为99%。以CaM基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-K3D1与NRRL1957、DTO：245-A7和DTO：132-A4以100%的自展支持率聚为一个分支（图5A），综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-K3D1为黄曲霉。

2.2.4 聚多曲霉

代表菌株LMNS-K2R1在PDA培养7 d，菌落中央呈橙黄色、稍隆起、绒状、菌丝致密、质地较硬、边缘白色，直径34~35 mm，背面呈深褐色，有裂痕（图6A）。在RBM培养15 d，菌落中央呈灰绿色至暗绿色、绒状、菌丝致密、边缘灰白色至白色、具同心环纹、直径37~39 mm，背面呈灰白色（图6B）。瓶梗安瓿状，大小（6.3~10.9） μm×（1.8~2.6） μm，平均8.2 μm×2.6 μm（图6C）；分生孢子球形或近球形、壁平滑，大小（3.4~4.7） μm×（2.8~4.7） μm，平均4.0 μm×3.7 μm（图6D）。

代表菌株LMNS-K2R1的CaM和ITS基因序列长度分别为512和544 bp。将其ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与聚多曲霉（DTO：246-A3、DTO：266-I6、DTO：245-G9）和田纳西曲霉（NRRL13150、DTO：286-C6）的相似性为98%，无法区分。以CaM基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-K2R1与DTO：246-A3、DTO：266-I6、DTO：245-G9、DTO：236-I9、DTO：236-D4和NRRL250以100%的自展支持率聚为一个分支（图5A），综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-K2R1为聚多曲霉。

2.2.5 布氏镰孢

代表菌株LMNS-G2P3在PDA、OA和SNA培养3 d，菌落直径70~72 mm。PDA培养3 d，菌落呈棉絮状、中央菌丝稀疏、边缘发达，背面呈淡橘色、可产生色素（图7A）；OA培养3 d，菌落呈羊毛状、气生菌丝发达，背面呈橙黄色、可产生色素（图7B）；SNA培养3 d，菌落呈絮状、气生菌丝稀疏，背面呈紫色、可产生色素（图7C）。培养7 d时，在3种培养基上菌落颜色加深。目前暂未在培养基上观察到其分生孢子形态。

代表菌株LMNS-G2P3的tef1基因序列长度为649 bp。以tef1基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-G2P3与NRRL29105、NRRL29020、NRRL29011、NRRL26916和LC18723以77%的自展支持率聚为一个分支（图5B），综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-G2P3为布氏镰孢。

2.2.6 棒状镰孢

代表菌株LMNS-K3P1在PDA培养7 d，菌落呈淡粉色、羊毛状、气生菌丝发达、边缘不整齐、直径62~63 mm，背面呈淡橘色（图8A）；OA培养7 d，菌落呈白色、棉絮状、气生菌丝发达、直径43~45 mm，背面呈黄褐色（图8B）；SNA培养7 d，菌落呈白色、絮状、气生菌丝不发达、直径63~75 mm，背面呈白色（图8C）。目前暂未在培养基上观察到其分生孢子形态。

代表菌株LMNS-K3P1的tef1基因序列长度为612 bp。以tef1基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-K3P1与CBS126202、LC18293以58%的自展支持率聚为一个分支（图5B），综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-K3P1为棒状镰孢。

2.2.7 链格孢

代表菌株LMNS-G2M1在PDA培养7 d，菌落呈黄棕色至灰棕色、绒毛状、具明显同心环纹、直径84~87 mm，背面呈棕黄色（图9A）；PCA培养7 d，菌落呈深棕色至墨绿色、棉絮状、菌丝较PDA稀疏、有明显同心环纹、直径79~82 mm，背面呈黑褐色（图9B）。

代表菌株LMNS-G2M1在PDA培养5 d，形成具多重分枝的矮树状分生孢子链，1~4个分枝、2~8个孢子长，通常有二次分枝（图10A，B）。分生孢子卵形或近椭圆形，淡褐色至褐色，具1~6个横膈膜、0~4个纵隔膜，分隔处略缢缩且颜色加深，大小（5.7~21.9） μm×（4.2~11.8） μm，平均12.1 μm×7.7 μm（图10C）。

以Alt a 1、endoPG和OPA10-2基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-G2M1、LMNS-G4M4和LMNS-G1M1与CBS194.86、CBS595.93、CBS121348、CBS102598、CBS118814、CBS118818、CBS102603、CBS102599、CBS102602、CBS102604、CBS119543、CBS102596和CBS918.96以89%的自展支持率聚为一个分支（图2B）。在链格孢株系间，系统发育树显示了种内多样性，菌株LMNS-G2M1、LMNS-G4M4、LMNS-C1M1与CBS194.86、CBS595.93、CBS121348、CBS102598和CBS118814聚类在一起，形成一个亚分支，支持率74%（图2B）；综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-G2M1、LMNS-G4M4、LMNS-C1M1为链格孢。

2.2.8 藜新凸轮孢

代表菌株LMNS-C3M2在PDA培养7 d，菌落呈平坦、灰褐色、绒状、直径19~21 mm，背面呈中央黄褐色、边缘灰绿色（图11A）；培养35 d，菌落埋生、凸起，中央深褐色至灰白色、表面有黑色颗粒、沿菌落中央密集分布，边缘黄褐色，背面呈黄褐色至深褐色、开裂（图11B）。分生孢子器质地坚硬，黄褐色至深褐色，近球形（图11C）。分生孢子椭圆形或梭形，通常有隔膜，隔膜处微缩，大小（12.3~19.6） μm×（4.3~7.6） μm，平均14.7 μm×5.8 μm（图11D）。

菌株LMNS-C3M2的ITS基因序列长度为558 bp。将其ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与藜新凸轮孢（CBS344.78）的相似性为99%。基于ITS基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-C3M2与CBS344.78、CBS432.77和CBS246.79以100%的自展支持率聚为一个分支（图5C）。综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-C3M2为藜新凸轮孢。

2.2.9 甜菜新凸轮孢

代表菌株LMNS-C1R3在PDA培养7 d，菌落呈平坦、中央灰褐色、绒状、菌丝致密、边缘灰白色、直径65~67 mm，背面呈黄褐色（图12A）。分生孢子器深褐色、球形、集生、埋生（图12B）。分生孢子单胞、无色、椭圆形或卵圆形，大小（4.6~8.4） μm×（3.3~4.8） μm，平均6.0 μm×4.0 μm（图12C）。

菌株LMNS-C1R3的ITS基因序列长度为558 bp。将其ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与甜菜新凸轮孢（CBS109410、ICMP-10945、CBS523.66）的相似性为99%。基于ITS基因序列构建系统发育树发现，菌株LMNS-C1R3与ICMP-10945、CBS523.66和CBS109410以100%的自展支持率聚为一个分支（图5C）。综合形态学和系统发育分析确定菌株LMNS-C1R3为甜菜新凸轮孢。

2.3 藜麦种子可培养6种内生真菌的致病性

结果表明，有5种可培养内生真菌可侵染藜麦叶片，为布氏镰孢、棒状镰孢、链格孢、藜新凸轮孢和甜菜新凸轮孢（图13）。接种后1 d，甜菜新凸轮孢可侵染藜麦叶片，病斑呈黄褐色、椭圆形、直径6~7 mm（图13B）。接种棒状镰孢和藜新凸轮孢后2 d，叶片表面出现病斑，接种棒状镰孢的叶片病斑呈圆形、表面覆盖灰色霉层、直径5~6 mm（图13D），接种藜新凸轮孢的病斑呈褐色、圆形、直径1 mm（图13E）。接种布氏镰孢和链格孢后3 d，叶片表面出现明显病斑，接种布氏镰孢的叶片病斑呈淡褐色、表面附着褐色小点、不规则、不受叶脉限制、直径9~11 mm（图13F），接种链格孢的叶片病斑中央呈深褐色、边缘淡黄色、不规则、直径4~6 mm（图13G）。接种后1~3 d对照组叶片正常生长（图13A），接种黄曲霉没出现明显病斑（图13C）。

2.4 藜麦种子可培养内生真菌的抑菌作用

结果表明有2株可培养内生真菌（草酸青霉和斯托尔篮状菌）对5种藜麦病原（灰葡萄孢、茎生壳二胞菌、柑橘镰孢、链格孢、粉红单端孢）有抑制作用（图14A，B）。对峙培养7 d，草酸青霉对灰葡萄孢、茎生壳二胞菌、柑橘镰孢、链格孢、粉红单端孢的平板对峙抑制率依次为11.81%、53.07%、47.19%、32.64%和19.91%（图14C）；斯托尔篮状菌对灰葡萄孢、茎生壳二胞菌、柑橘镰孢、链格孢、粉红单端孢的平板对峙抑制率依次为1.49%、38.82%、21.80%、12.64%和16.33%（图14D）。

3 讨论与结论

研究发现链格孢属、镰孢属真菌等可作为内生真菌存在于多种植物中。盐碱地冬枣（Ziziphus jujube）中内生真菌丰富，优势菌群为链格孢属和镰孢属，相对分离频率分别为37.84%和21.62%^［31］。此外，荒漠多枝柽柳（Tamarix ramosissima）、滨海湿地的盐生植物芦苇（Phragmites australis）和盐生植物翅碱蓬（Suaeda heteroptera）内生真菌的优势属均为链格孢属^［32-34］。呼荣等^［20］研究发现，青白藜患病茎秆和叶片部位内生真菌的优势属是链格孢属。王生萍等^［23］研究发现，从西藏3个地区的藜麦种子中分离到的可培养内生真菌相对丰度最高的属为链格孢属。本研究共分离并鉴定可培养内生真菌6属9种，其中链格孢、黄曲霉和草酸青霉为分离优势种，分别占总菌株数的64.42%、11.66%、9.20%。进一步说明了链格孢属真菌在不同宿主植物的内生真菌群落中均占据重要地位。

获得的6属9种内生真菌中，有5种为常见的植物病原菌，其中2种为常见的藜麦叶斑病病原（链格孢、藜新凸轮孢）^［35-37］。王伟^［38］研究发现，黄曲霉可引发玉米（Zea mays）穗腐病。单柳颖^［39］研究发现，布氏镰孢可引发玉米茎腐病。Gilardi等^［40］研究发现，棒状镰孢可引起番茄（Solanum lycopersicum）叶斑病和果腐病。Vaghefi等^［41］研究发现，甜菜（Beta vulgaris）新凸轮孢可造成甜菜根腐病和叶斑病。虽然这些病原菌在藜麦采集区暂未引发任何症状，但不排除其在适宜环境条件下发病的可能性，仍然存在潜在风险。此外，荆丹等^［42］、宫安东^［43］发现曲霉属和镰孢属真菌是常见的毒素真菌，极易侵染花生（Arachis hypogaea）、玉米、小麦（Triticum aestivum）等农产品。这两种毒素真菌均可造成巨大的农业经济损失，严重威胁人畜生命健康。本研究发现黄曲霉只存在于藜麦种子的开花期，这可能与开花期种子易受外界环境侵扰有关。因此，应加强藜麦开花期田间管理，防止此类真菌在种子中定殖，影响藜麦品质。

吾尔恩·阿合别尔迪等^［44］研究发现天山雪莲（Sasussured involucrata）内生菌斯托尔篮状菌能够产生抗菌活性物质。目前关于斯托尔篮状菌抑菌作用的研究报道相对较少，但本研究首次发现斯托尔篮状菌对藜麦病原菌（茎生壳二胞菌、柑橘镰孢）具有较好的抑菌效果，这表明斯托尔篮状菌在抗菌应用方面也具有潜在的价值。草酸青霉在抑制多种植物病原菌方面展现出强大的潜力。它对番茄枯萎病具有良好的生物防治效果^［45］。草酸青霉通过多种机制，如营养竞争和重寄生等，有效抑制尖孢镰孢菌（Fusariumoxysporum）的生长发育^［46］。张先富等^［47］研究表明，在室内试验条件下，草酸青霉对尖孢、串珠、层出和腐皮镰孢菌等多种镰孢菌均有较强的抑制作用。研究发现，草酸青霉对青枯劳尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）有显著的抑制效果^［48］。魏蜜等^［49］从油茶（Camellia oleifera）根部土壤中分离的草酸青霉能抑制油茶软腐病、炭疽病等多种病原菌孢子的萌发。这些研究表明，草酸青霉可作为一种生物防治剂，在抑制多种植物病原菌方面具有广泛的应用前景。

本研究从4种藜麦的种子中分离出可培养内生真菌共6属9种。其中，链格孢、黄曲霉和草酸青霉为分离优势种。布氏镰孢、棒状镰孢、链格孢、藜新凸轮孢和甜菜新凸轮孢对藜麦叶片有致病能力。草酸青霉和斯托尔篮状菌对5种藜麦病原有抑制作用。藜麦种子可培养内生真菌种群结构丰富，在植物病害生物防治方面具有潜在应用价值。

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基金资助

山西农业大学“科技创新提升工程”项目(CXGC2023009)

山西省重点研发计划(2022ZDYF117)

山西省现代农业产业技术体系建设专项(2025CYJSTX03-31)

“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程项目(TYGC25-01)

“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程项目(TYGC25-02)