梭梭WOX转录因子家族鉴定及HaWOX29和HaWOX54在根生长中的功能研究

Identification of the WOX transcription factor family in Haloxylon ammodendron and functional analyses of the roles of HaWOX29 and HaWOX54 in root growth

摘要

荒漠植物梭梭具有发达的根系，其侧根可寄生中药肉苁蓉，使得梭梭在荒漠治理和荒漠区社会发展中具有重要的生态和经济价值。WOX转录因子参与植物根的生长发育，本研究从梭梭全基因组数据中鉴定出64个WOX转录因子家族成员，根据前期转录组分析结果，筛选克隆了在根中表达量高的HaWOX29和HaWOX54；qPCR分析表明，HaWOX29和HaWOX54在根中的表达量明显高于其他组织，干旱、盐及高温胁迫下下调表达，低温和吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）处理下上调表达；利用农杆菌介导法侵染梭梭种胚，获得过表达HaWOX29和HaWOX54的植株，表型和根系扫描分析发现过表达HaWOX29的梭梭平均主根根长是转空载体对照组的2.49倍；过表达HaWOX54植株主根根长是空载体的2.08倍，平均分支数是4.34倍。因此初步推测HaWOX29基因可能参与梭梭主根的伸长，HaWOX54基因可能参与梭梭侧根的发育和主根的伸长。本研究筛选鉴定参与梭梭根生长发育的WOX转录因子，为研究梭梭根发育的分子机制和筛选优异的梭梭种质资源提供了理论和技术指导。

Abstract

The desert plant Haloxylon ammodendron， commonly known as sorghum or saxaul， has a well-developed root system characterized by lateral roots that are capable of parasitizing the traditional Chinese medicine plant Cistanche deserticola. This trait endows H. ammodendron with significant ecological and economic value for desert management and for the social development of desert regions. In plants， WOX transcription factors play a crucial role in the growth and development of roots. In this study， we identified 64 members of the WOX transcription factor family from the H. ammodendron genome. Building upon previous transcriptome analysis results， we screened and cloned the genes HaWOX29 and HaWOX54， which exhibited high transcript levels in the roots. Quantitative PCR analysis indicated that the transcript levels of HaWOX29 and HaWOX54 were obvious higher in roots than in other tissues， and that both of these genes were down-regulated under drought， salt， and high-temperature stresses. Conversely， they were up-regulated under low-temperature conditions and treatments with various hormones， namely indole-3-acetic acid， abscisic acid， and salicylic acid. Through Agrobacterium-mediated transformation， we obtained plants overexpressing HaWOX29 and HaWOX54. Phenotypic and root scanning analyses revealed that the average primary root length of the HaWOX29-overexpressing plants was 2.49-times than that of the control group （transformed with the empty vector）. The primary roots of the HaWOX54-overexpressing plants were 2.08-times longer than those of the control group， and the average root branching number was 4.34-times greater. Thus， we concluded that HaWOX29 may facilitate the elongation of primary roots in H. ammodendron， while HaWOX54 may be implicated in the development of lateral roots and the elongation of primary roots. The results of this study identify WOX transcription factors associated with the growth and development of H. ammodendron roots， offering theoretical and practical guidance for investigating the molecular mechanisms underlying root development and for screening superior germplasm resources of H. ammodendron.

Graphical abstract

关键词

梭梭 / WOX转录因子 / 根发育 / 分子机制

Key words

Haloxylon ammodendron / WOX transcription factors / root development / molecular mechanisms

梭梭（Haloxylon ammodendron）是苋科（Amaranthaceae）梭梭属（Haloxylon）的一种超耐旱多年生小乔木，是我国荒漠地区植树面积最大的树种之一^［1-2］。梭梭不仅在遏制土地沙化方面发挥了重要的生态价值，还带来了良好的经济效益。一年生的梭梭枝条可作为大型反刍动物的饲料，而多年生的同化枝常被当地人用作柴火^［3］。梭梭的根系以发达的垂直根系为主，具有迂回生长的特性，主要分布在地下50~100 cm的土层中。尽管侧根数量较少，但其根系能够深入土壤吸收深层水分。同时，根系分布的时空异质性使其在不同季节和环境条件下能够有效利用有限的水资源^［4］。不同树龄的梭梭根系生物量占总生物量的35%~40%^［5］。通过电子显微镜观察，梭梭根系的结构由外到内分为表皮层、皮层和维管柱3部分^［6］。此外，梭梭根部还寄生着名贵中药肉苁蓉（Cistanche deserticola）。当肉苁蓉的种子在靠近梭梭根系的地方萌发时，会向梭梭根系发出信号，梭梭根系会穿破肉苁蓉种子，形成接种点，从而建立寄生关系^［7］。作为荒漠地区主要的建群种，梭梭因其发达的根系能够在高温干旱环境下正常生长，成为植物逆境生物学的重要研究对象。然而，梭梭的扦插生根率几乎为0^［8］，在梭梭的器官发生途径中，诱导生根率仅为50%，在体细胞胚发生途径中，不定芽生根也较为困难^［9］。尽管已有许多研究从形态结构、根系分布和再生体系等方面探讨了梭梭根的特性，但尚未有从分子水平上对梭梭根生长发育进行研究的相关报道。因此，研究与梭梭根生长发育相关的基因及其调控的可能分子机制十分重要。

WOX（WUSCHEL相关同源框）转录因子家族是植物特有的转录因子之一，广泛参与植物的生长发育、干细胞分裂分化以及胚胎和器官形成等重要生理过程。近年来，部分WOX家族成员在植物根生长发育中的作用逐渐被揭示。比如，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，WOX9基因在胚胎主根创始细胞（垂体细胞）中表达，控制主根创始细胞的特化及主根的起始过程^［10］；WOX11则在离体叶片再生不定根的过程中特异性表达于不定根创始细胞中，调控其向根原基的起始过程；WOX5在根尖分生组织（root apical meristem， RAM）中维持干细胞稳态，对侧根的起始和发育至关重要^［11］。此外，在水稻（Oryza sativa）中，沉默OsWOX4基因后，主根数量显著增加，而过表达该基因则显著抑制主根伸长，表明该基因与根的发育密切相关^［12］。与此同时，在木本植物中也有相关研究。例如，白桦（Betula platyphylla）中的BpWOX11过表达株系在组织培养生根阶段，其不定根长度和鲜重显著高于对照株系，且转基因株系的田间扦插生根率明显高于对照株系，表明BpWOX11能够促进白桦不定根的形成，提高扦插生根率^［13］；银腺杨（Populus alba×Populus glandulosa）中PagWOX11/12a基因可以促进杨树根系生长，增强植物抗旱性和耐盐性^［14］。这些研究表明，WOX家族成员在植物根的各个发育阶段扮演着重要角色。目前对WOX家族成员的功能研究主要集中在模式植物拟南芥和水稻以及一些作物中，而在荒漠植物中的研究较少。

鉴于WOX转录因子在植物根发育中的重要作用，本研究以梭梭为对象，分析和鉴定了WOX转录因子家族成员。基于对梭梭根、同化枝以及胚性和非胚性愈伤组织的转录组测序结果^［15-16］，本研究筛选并克隆了可能与根发育相关的HaWOX29和HaWOX54基因。通过qPCR分析这两个基因在不同组织及逆境胁迫下的表达模式。此外，利用实验室构建的梭梭种胚遗传转化体系^［17］，获得了过表达HaWOX29和HaWOX54的植株，以分析其在根生长中的功能。本研究旨在筛选与梭梭根发育相关的WOX转录因子，为梭梭根生长发育的分子机制研究提供理论依据，并为优异种质资源的筛选提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究使用的植物材料采自古尔班通古特沙漠南缘（44°28′ N，88°11′ E）的单株梭梭的种子和花。

1.2 试验方法

1.2.1 梭梭WOX转录因子家族生物信息学分析

首先，基于梭梭全基因组序列，使用TBtools软件提取梭梭WOX基因序列及其蛋白序列。通过Pfam网站（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）下载梭梭WOX转录因子家族同源异型结构域Homeodomain的HMMER文件（PF：PF00046）。对候选基因进行验证分析，利用NCBI-CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测Homeodomain蛋白结构域，剔除无典型结构域、结构不完整和冗余的序列，最终确定梭梭WOX转录因子家族成员。此外，使用TBtools软件提取梭梭基因组注释文件中的WOX基因家族位置信息。然后通过MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）对WOX基因家族成员进行保守基序分析，最终使用TBtools对基因结构及保守基序的分析结果进行可视化展示。

使用TBtools软件提取HaWOXs基因家族上游2000 bp的启动子。通过在线网站Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool-s/plantcare/html/）分析梭梭HaWOXs的顺式作用元件。

为了更进一步明确HaWOX29和HaWOX54基因的功能，选择与已经报道且调控机制相关的氨基酸序列，同时使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）编码的氨基酸进行BLASTP比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/），并选择相似度高的植物氨基酸序列，采用MEGA 11软件和邻近法构建系统发育进化树，参数为1000次重复。

1.2.2 梭梭幼苗培养及模拟非生物胁迫和激素处理

梭梭种子在75%酒精中消毒3 min后用无菌水洗涤3次，再用次氯酸钠溶液消毒13 min，用无菌水冲洗数次直至水面清澈。接种在MS（murashige-skoog）培养基（0.1732 g MS+0.8 g蔗糖+0.24 g琼脂+40 mL ddH₂O，北京西美杰科技有限公司，北京）上，培养箱温度为26 ℃，16 h光/8 h暗循环，培养30 d获得梭梭幼苗。

模拟干旱、高盐、低温、高温非生物胁迫处理：将梭梭幼苗分别浸没于20%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 6000溶液、200 mmol·L^-1 NaCl溶液，将梭梭幼苗分别放置于4和50 ℃的人工气候培养箱中，分别在处理的第0、1、3、6、12、24和48 h时，对梭梭幼苗的根和同化枝分别取样，每个时间段进行3个生物学重复采样，液氮速冻，于-80 ℃保存。

模拟吲哚乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）、脱落酸（abscisic acid， ABA）、水杨酸（salicylic acid， SA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）激素诱导：将梭梭幼苗浸泡在20 μmol·L^-1 IAA、100 μmol·L^-1 ABA、50 mg·L^-1 SA和50 mg·L^-1 MeJA溶液中，覆盖保鲜膜后置于28 ℃光照培养箱中，在处理的第0、1、3、6、12、24、48 h时，对梭梭幼苗的根和同化枝分别取样，每个时间段进行3个生物学重复采样，液氮速冻，于-80 ℃保存。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析

使用植物多糖多酚总RNA提取试剂盒（DP441天根生化科技有限公司）提取梭梭总RNA。随后，通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop（赛默飞世尔有限公司）微量紫外/可见光分光光度计分析RNA的质量。参照TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）说明书，在20 µL反应液中将2 µg总RNA反转录为cDNA。

设计HaWOX29和HaWOX54的实时荧光定量引物（表1），分析梭梭不同组织（根、同化枝、花、种子）和模拟非生物胁迫处理（干旱、盐、高温、低温）以及不同激素（IAA、ABA、SA和MeJA）处理后的基因表达模式，以梭梭Ha18SrRNA为内参基因，用2^-∆∆Ct法计算相对表达量^［18］。

1.2.4 基因克隆及植物过表达载体的构建

以梭梭cDNA为模板，通过SnapGene设计特异性克隆引物（表1），进行PCR扩增，将目的片段回收后送至生工生物工程有限公司（上海）进行测序。

设计带有pCAMBIA3301同源臂的HaWOX29、HaWOX54引物，以梭梭cDNA为模板，克隆目的片段，同源臂引物序列见表1；BstEⅡ、BglⅡ酶切pCAMBIA3301切去GUS基因后，回收获得线性化载体，将线性化后的载体与目的片段进行无缝克隆（图1），详细步骤见无缝克隆试剂盒-SC612（金沙生物科技有限公司），转入DH5α大肠感受态中，菌液PCR验证后送测，测序无误后提取pCAMBIA3301-HaWOX29、pCAMBIA3301-HaWOX54质粒转化GV3101农杆菌，转化详细步骤参考北京酷来博GV1301感受态细胞转化方法^［16］。

设计带有pGBKT7同源臂引物（表1），克隆含有pGBKT7-HaWOX29、pGBKT7-HaWOX54的目的片段；选择BamHⅠ、EcoRⅠ两个酶切位点对pGBKT7进行双酶切，酶切产物回收详细步骤见DNA产物纯化试剂盒（D2111-02，广州）说明书，将目的片段与线性化载体连接，热激法转入AH109酵母感受态中，观察在缺陷培养基（0.7 g SD/-Ade/-His/-Trp+25 μL X-α-Gal）上的生长状况，分析转录自激活活性。

1.2.5 农杆菌转化梭梭种胚

将农杆菌培养至对数生长期（OD₆₀₀=1.0），收集菌体，MS液体培养基（1.732 g MS+8 g蔗糖+400 mL无菌水）重悬至菌液浓度OD₆₀₀为0.6~0.7，加入等体积的150 μmol·L^-1乙酰丁香酮。放入黑暗环境2 h即可得到配置好的侵染液。采用本实验室建立的梭梭种胚侵染方法进行农杆菌侵染，将清洗消毒好的梭梭种胚进行划伤处理，再将种胚放入农杆菌菌液，220 r·min^-1，侵染10 min后取出，无菌滤纸吸干表面的菌液，黑暗共培养2 d，添加头孢霉素延迟筛选28 d后，再添加草丁膦（phosphinothricin）抗性筛选40 d后获得PPT抗性植株，共进行3次转化。将得到的过表达HaWOX29、HaWOX54基因的梭梭植株与转pCAMBIA3301空载体梭梭植株相比较，转基因和转空载体都随机选取3个植株，拍照记录。

将根部表面洗净，用镊子将根部完全展开放入扫描仪托盘中，用植物根系扫描仪（EPSONV700 PHOTO，上海）扫描成图像，最后用根系分析软件（WinRHIZO 2012）对图像进行分析计算。可得到总根长（通过图像分析软件对根系图像中的所有根段长度进行累加得到的）、总根表面积（通过计算根系图像中每个根段的表面积并累加得到的）、根体积（通过计算根系图像中每个根段的体积并累加得到的）、根平均直径（所有根段直径的平均值）、分支数（侧根和细根的分支数量）、根尖数（根系中活跃生长的根尖数量）等指标^［18］。

1.3 数据处理

采用Excel 2007计算出平均值和标准误，使用SPSS 27.0.1软件进行显著性水平的判断依据为：P<0.05为显著，P>0.05为不显著，P<0.01为极显著，进一步明确转HaWOX29和HaWOX 54基因植株与转空载体对照植株之间的表型差异。采用GraphPad Prism 9和Photoshop 2023软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 梭梭WOX转录因子家族生物信息学分析

2.1.1 梭梭WOX转录因子家族鉴定及染色体定位

基于全基因组数据，成功提取到梭梭64个WOX 转录因子家族成员，使用TBtools软件将染色体定位可视化，依次排列进行命名为HaWOX1~64（图2A）。发现以上HaWOXs基因不均匀地分布在梭梭的9条染色体上，每条染色体所包含的HaWOXs基因数量也各不相同，每条染色体上的颜色越深代表此处的基因密集度越高。从中发现Hic-asm-3中含有HaWOXs基因数量最少，只有3个；而Hic-asm-1中含有HaWOXs基因数量最多，达到12个。

2.1.2 梭梭HaWOXs基因家族保守基序和基因结构分析

对梭梭HaWOXs基因家族进行保守基序和基因结构分析（图2B）。梭梭HaWOXs基因家族成员含有8个保守基序，除HaWOX6、HaWOX8、HaWOX25、HaWOX34和HaWOX62只有一个Motif，其他基因的Motif分布的数量和位置大致相同。这也证实了HaWOXs基因在演化过程中保持了相对的保守性；发现各成员间mRNA序列长度差异较大，梭梭HaWOXs基因家族成员的外显子数均在两个以上，而HaWOX4、HaWOX6、HaWOX47、HaWOX48、HaWOX53、HaWOX54和HaWOX63含有外显子数超过10个，说明这些基因结构较为复杂。

2.2 梭梭HaWOX29和HaWOX54基因的克隆及蛋白系统进化树分析

通过RT-PCR克隆和验证，HaWOX29基因的编码序列（coding sequence，CDS）全长为678 bp，HaWOX54基因的CDS全长为654 bp（图3A）。通过NCBI Blast比对，选取甜菜（Beta vulgaris subsp. vulgaris）、藜麦（Chenopodium quinoa）、苋（Amaranthus tricolor）、紫草（Lithospermum erythrorhizon）、菠菜（Spinacia oleracea）等以及模式植物拟南芥构建蛋白系统进化树，结果显示（图3B），HaWOX29与甜菜（KMT20244.1）、苋（XP_057531409.1）和菠菜（XP_021846961.2）处于同一分支，亲缘关系较近；HaWOX54与藜麦（XP_02176894.1）、甜菜（KMT08693.1）和菠菜（XP_021849935.1）处于同一分支，亲缘关系较近。而HaWOX29和HaWOX54与拟南芥、肥皂草、辣椒等其他物种的亲缘关系较远。

2.3 梭梭HaWOXs基因启动子顺式作用元件分析

根据预测结果（表2），HaWOX29启动子元件含有参与调控分生组织和响应干旱的顺式作用元件；HaWOX54启动子元件含有参与茉莉酸甲酯和脱落酸响应相关的顺式作用元件。由此可以表明HaWOX29和HaWOX54基因启动子预测到含有分生组织和植物相关激素的顺式作用元件，可能参与到梭梭根的发育过程。

2.4 HaWOX29和HaWOX54基因表达模式分析

通过qRT-PCR技术对梭梭不同组织（种子、花、同化枝、根）的基因表达模式分析发现，HaWOX29和HaWOX54基因在根组织中呈显著的组织特异性表达，表明这两个基因可能在梭梭根系发育中发挥作用（图4A）。

结合启动子元件预测结果，分析发现HaWOX29和HaWOX54基因的表达受到多种环境胁迫和激素信号的调控。通过qPCR分析，结果表明（图4B）：干旱胁迫处理下第3和12 h HaWOX29基因表达量先上升后下降，HaWOX54基因表达量随着处理时间逐渐上升；在盐胁迫处理下HaWOX29基因表达量在第3和12 h下降，在其他处理时间段则上升，而HaWOX54基因在第3、12和48 h表达量下降，其余处理时间的表达量则上升，这一结果表明HaWOX29和HaWOX54基因可能参与梭梭根系对逆境胁迫的响应机制。相反，在低温处理下，HaWOX29和HaWOX54基因的表达量显著上调，并在处理后第3 h达到峰值，这可能与低温条件下根系的适应性调节有关。在高温处理下，HaWOX29基因上调表达，并在处理后第12 h达到最大值，而HaWOX54基因表达量为先上升后下降，表明高温可能通过阶段性激活这两个基因来调节根系的生理响应。

此外，HaWOX29和HaWOX54基因对激素处理也表现出不同的响应模式：在IAA和ABA处理下，HaWOX29基因的表达量分别在处理后第6和24 h上升并达到峰值，而HaWOX54基因的表达量则在处理后第6 h迅速上升并达到峰值（图4B）；在SA处理下，HaWOX29基因的表达量在处理的第1 h达到峰值，而HaWOX54基因先上调后下调表达，这表明HaWOX29和HaWOX54可能通过响应这些激素信号来调节根系的生长和发育。然而，在MeJA处理下，两个基因的表达模式更为复杂：在处理后第6 h之前，基因表达量呈下降趋势，而在第6 h之后则开始上升，表明MeJA可能对这两个基因的表达具有双向调节作用。综上所述，HaWOX29和HaWOX54基因在梭梭根系中具有较高的表达水平，并且其表达受到多种环境胁迫和激素信号的调控。

2.5 HaWOX29和HaWOX54具有转录自激活活性

转录激活活性验证显示pGBKT7-HaWOX29和pGBKT7-HaWOX54可以单独激活下游基因转录，在SD/-Ade/-His/-Trp+X-α-Gal培养基上正常生长，β-半乳糖苷酶分析显蓝色（图5），说明HaWOX29和HaWOX54蛋白具有转录自激活活性。

2.6 对梭梭中过表达HaWOX29和HaWOX54基因进行功能分析

2.6.1 pCAMBIA3301植物表达载体的构建

通过线性化后的pCAMBIA3301载体与目的基因进行连接，利用同源重组技术构建pCAMBIA3301-HaWOX29、pCAMBIA3301-HaWOX54重组植物表达载体，采用3对引物对其进行验证，琼脂糖凝胶电泳显示的条带大小均正确（图6）。此外，公司的测序结果与原始序列结果一致，说明成功构建植物过表达载体。

2.6.2 梭梭种胚遗传转化

利用热激法^［16］转化农杆菌GV3101，采用“农杆菌介导的梭梭种子遗传转化体系构建的方法”（专利号：2024107566095）^［17］通过农杆菌介导法侵染划伤后的梭梭种子，观察到未侵染有伤口的梭梭种子不生根，有伤口的梭梭种子在侵染的一段时间后开始发芽并生根，说明农杆菌对梭梭生根有刺激作用。农杆菌介导法侵染过程如下（图7），将菌液OD₆₀₀值调节至0.6~0.7，加入150 mmol·L^-1的乙酰丁香酮，黑暗条件下放置2 h；将被无菌锯条划伤后的种胚放入配置好的菌液中侵染10 min；然后使用无菌滤纸吸去种胚上的菌液，黑暗条件下MS培养基共培养2 d、然后进入MS+250 mg·L^-1头孢霉素（cephalosporin）延迟筛选培养基中30 d，最后经过MS+1 mg·L^-1 PPT抗性筛选培养基40 d后，获得过表达植株，在此期间需要观察农杆菌污染情况，及时更换新的培养基。

2.6.3 表型分析和根系指标分析

PPT抗性筛选结束后，分别对pCAMBIA3301空载、转基因梭梭进行取样拍照，每组设有3个生物学重复，结果表明OE_HaWOX29基因与空载体对照组相比主要表现在主根伸长（图8A），OE_HaWOX54基因与空载体对照组相比主根和侧根数明显增多（图8B）。通过WinRHIZO根系扫描仪分析，结果表明OE_HaWOX29基因梭梭苗的平均主根根长为（12.19±1.56） cm，分支数为（75.33±46.36）个，而空载对照组平均主根根长为（4.90±0.96） cm，分支数为（59.33±11.37）个，OE_HaWOX29基因梭梭苗的根长和分支数分别是转空载体对照组的2.49和1.27倍；OE_HaWOX54基因梭梭苗平均主根根长为（10.17±1.26） cm，分支数为（257.33±48.60）个，分别是空载体的2.08和4.34倍（表3）。

为进一步研究过表达植株参与根的生长发育中的表达模式，扫描结束后，提取过表达植株总RNA，反转录cDNA进行分子检测和qRT-PCR验证，结果显示在以过表达植株为模板成功克隆出的HaWOX29和HaWOX54中，条带大小均正确（图9A）；OE_HaWOX29和OE_HaWOX54在根中的表达量明显高于转空载对照组（图9B）。

3 讨论

WOX是一类植物特有的转录因子家族，参与植物胚胎和体胚发育、愈伤组织的形成与维持、根的发育以及茎尖分生组织（shoot apical meristem， SAM）的形成等重要生理过程^［19-21］。目前，WOX家族已经在白菜（Brassica rapa）^［22］、紫薇（Lagerstroemia indica）^［23］、甘蓝型油菜（Brassica napus）^［24］等各类植物中陆续得到鉴定，但梭梭WOX基因家族相关研究还未见报道。本研究鉴定出梭梭WOX家族的64个成员，随机分布在9条染色体上，并根据在染色体上的排列顺序进行命名；在对保守结构域和基因结构分析中发现处于同一进化分支的WOX成员其Motif组成、排列顺序和基因结构基本相似，这表明梭梭WOX家族在进化过程中高度保守。

根系作为高等植物的关键营养器官，其生长发育在很大程度上决定了植物对水分和养分的吸收效率，以及对干旱、盐分等非生物胁迫的耐受能力，这些都对植物的生命活动至关重要。与此同时WOX基因家族也参与植物对非生物胁迫（如干旱、盐、冷）的响应^［25］。本研究通过分析HaWOX29和HaWOX54基因在逆境胁迫和激素处理下的表达模式，揭示了其在根系发育和非生物胁迫响应中的潜在调控功能。其中HaWOX29和HaWOX54基因在低温胁迫下均呈上调表达，这与甘蓝型油菜中BnWOX基因在冷胁迫下表达显著升高的结果一致^［24］。然而，在干旱和盐胁迫下，HaWOX29和HaWOX54基因下调表达；在高温胁迫初期，HaWOX29上调表达而HaWOX54下调表达，提示同一家族不同基因可能通过差异调控适应复杂环境变化。在IAA、ABA、SA等激素处理下HaWOX29和HaWOX54基因上调表达，这与WOX基因参与激素信号交叉调控的结论相符^［26］；而本研究中MeJA激素处理下HaWOX29和HaWOX54基因表达量先降后升，可能反映了茉莉酸信号在胁迫后期来调节WOX基因的表达从而促进生长和提高防御能力。这些发现为进一步阐明HaWOX29和HaWOX54在梭梭根系发育中的分子机制提供了重要线索。

农杆菌介导的遗传转化技术作为植物基因工程领域的重要突破，现已成为作物性状定向改良的核心生物技术手段。该体系通过T-DNA精准转移机制，能够实现外源基因的稳定整合与高效表达，为抗逆性增强、品质优化及代谢通路改造等精准育种目标提供了强有力的技术支撑^［27］。本研究通过农杆菌介导的梭梭种子遗传转化体系^［17］，在不经过愈伤组织培育的情况下，仅用70 d就获得了过表达植株，根生长表型明显，可以用于验证基因功能。这与传统的遗传转化方法相比，大大缩短了转化周期。其结果表明，OE_HaWOX29植株主根显著伸长，与拟南芥中WOX11/12促进主根延伸的表型一致，后者通过激活细胞分裂素信号和维持根尖分生组织活性实现根系伸长^［28］，但HaWOX29基因调控根生长发育的作用机制是否与拟南芥WOX11/12基因调控一致还需要进一步研究；而OE_HaWOX54植株在主根伸长和侧根数量上的双重增强，这一现象在小叶杨（Populus simonii）中PsWOX11基因过表达促进了杨树侧根的长度和直径增加^［29］以及水稻中OsWOX10基因促进初生根的分化^［30］呈现相似的作用。暗示其可能整合了分生组织活性和侧根原基起始的双重调控。

综上所述，本研究不仅验证了HaWOX29和HaWOX54基因在梭梭根系生长发育中的功能，还为研究WOX家族在根系生长发育中的分子机制提供方向。在后续研究中可以进一步研究其上游互作蛋白和下游靶基因，从而更全面地理解HaWOXs基因在梭梭根发育中的作用机制。

4 结论

本研究筛选出与根发育相关的2个梭梭WOX转录因子家族基因，分别是HaWOX29和HaWOX54。研究发现，HaWOX29和HaWOX54基因在低温、IAA、SA和ABA激素处理下均表现出上调表达，并且具有转录自激活活性。根据表型和根系指标分析，与空载对照组相比，OE_HaWOX29显著促进主根的伸长，侧根数量也有增加；而OE_HaWOX54则明显增强主根和侧根的生长。综上所述HaWOX29基因促进主根生长更为明显，HaWOX54基因促进侧根生长更为明显。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2024D01A70)