老芒麦EsJRL基因家族鉴定与表达分析

Identification and expression analysis of EsJRL genes in Elymus sibiricus

摘要

Jacalin类凝集素基因家族在植物中广泛存在，与植物的生长发育、逆境胁迫及病虫害防御密切相关。基于老芒麦基因组数据，利用生物信息学方法对EsJRL基因家族进行鉴定，并对其进行理化性质、染色体分布、系统进化、基因结构、保守结构域和启动子顺式作用元件分析。通过RNA-Seq数据及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对EsJRL基因在不同时期的旗叶及非生物胁迫（外源激素、干旱和低温）下的表达模式进行分析。结果显示，从老芒麦中共鉴定到84个EsJRL基因，在13条染色体两端不均匀分布，编码氨基酸序列长度为93~1574 bp。根据系统发育分析结果，将EsJRL家族成员分为8个组。保守基序分析发现大部分EsJRL基因包含Motif 1、Motif 3和Motif 7。种内共线性结果显示，在老芒麦基因组中共发现39个基因重复事件。非同义替代率与同义替代率的比值（Ka/Ks）分析显示，所有重复基因对均受到纯化选择。顺式作用元件预测表明，EsJRL基因启动子区域富含与光响应、胁迫响应、激素响应以及植物生长发育有关的功能元件。表达模式分析显示，仅有33个EsJRL基因在老芒麦不同时期旗叶中表达，其中19个EsJRL基因在两个种质中均表达。RT-qPCR结果表明，多数EsJRL基因在赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）处理下显著上调（P<0.05），少数EsJRL基因响应干旱和低温胁迫后上调表达，其中，EsJRL28-2基因表达量在干旱胁迫和GA处理下显著下调（P<0.05），低温胁迫下仅EsJRL43基因表达量显著下调（P<0.05）。

Abstract

The Jacalin-like lectin gene family is widely found in plants. Its members are known to be involved in plant growth and development， responses to adverse environmental conditions， and defense against pests and diseases. Based on the genomedataof Elymus sibiricus， the EsJRL gene family was identified using bioinformatics methods and analyzed to determine the chromosomal distribution， phylogeny， promoter cis-acting elements， and structure of the genes， and the conserved structural domains and physicochemical properties of the putative proteins. The transcript profiles of EsJRL genes in flag leaves at different growth stages and under various stress conditions （exogenous hormones， drought， and low temperature） were analyzed on the basis of RNA-Seq data and by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） analysis. A total of 84 EsJRL genes were identified from the E. sibiricus genome. They were unevenly distributed at both ends of 13 chromosomes， and the length of the coding sequences ranged from 93 to 1574 bp. Conserved motif analysis revealed the presence of Motif 1， Motif 3， and Motif 7 in 83， 86， and 86 protein sequences， respectively， indicative of a high degree of structural conservation among the EsJRL gene family. Intraspecific covariance analyses revealed 39 duplication events （18 pairs of tandem duplicated genes and 21 pairs of segmental duplicated genes） in the E. sibiricus genome， and a Ka/Ks analysis showed that all duplicated genes have been subject to purifying selection during their evolutionary history. Cis-acting element prediction showed that the promoter regions of EsJRL genes were enriched with functional elements related to response to light， hormones， and growth and development. Gene expression analyses indicated that only 33 EsJRL genes were expressed in the spikes of two E. sibiricus lines， XH04 and XH05， at different growth stages. Only 19 EsJRL genes were expressed in both germplasm materials. The RT-qPCR results indicated that most EsJRL genes were significantly up-regulated under gibberellin， abscisic acid， and salicylic acid treatments （P<0.05）， and a few EsJRL genes were up-regulated in response to drought and low temperature stress. EsJRL28-2 was significantly down-regulated under drought stress and gibberellin treatment （P<0.05）. Only one EsJRL gene， EsJRL43， was significantly down-regulated under low temperature stress （P<0.05）.

Graphical abstract

关键词

老芒麦 / Jacalin相关凝集素（JRL） / 生物信息学 / 表达分析 / 非生物胁迫

Key words

Elymus sibiricus / Jacalin-related lectin （JRL） / bioinformatics / expression analysis / abiotic stresses

植物凝集素（lectins）是一类重要的糖结合蛋白，广泛参与植物的信号传导、胁迫响应以及生长发育过程。近年来，随着对糖分子识别机制和植物抗逆性研究的深入，凝集素家族在植物抗逆性和衰老调控中的潜在应用受到了广泛关注。其中，类凝集素相关受体激酶（Jacalin-related lectins，JRLs）作为凝集素家族的一个重要亚类，因其独特的结构和功能多样性，成为研究的热点。JRL蛋白家族以其保守的Jacalin结构域为特征，能够识别并结合特定的糖分子。根据其结构域类型，JRLs可分为3类：只有一个Jacalin结构域的merojacalins，有多个Jacalin结构域的holojacalins，以及有Jacalin结构域和其他结构域的嵌合型jacalins^［1-2］。这些蛋白通过糖分子结合能力，广泛参与植物的非生物胁迫响应、生物防御和生长发育调控。研究表明，至少有26种植物中报道了JRL蛋白的存在^［3］。

JRL蛋白的研究始于20世纪80年代，最早在菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus）种子中被鉴定，因其结合半乳糖的能力使其被命名为Jacalin^［4］。根据其碳水化合物结合特异性，JRL蛋白可进一步分为半乳糖特异性（galactose-specific jacalin-related lectins， gJRLs）和甘露糖特异性（mannose-specific jacalin-related lectins， mJRLs）两类^［5-6］。gJRLs储存于液泡中，主要结合半乳糖及其衍生物，参与营养储备和静态防御功能^［7］。大多数JRL蛋白是mJRLs，主要分布于细胞质和细胞核，能够结合甘露糖及其衍生物，参与信号传递和基因调控^［8］。多种植物JRL蛋白的三维结构分析表明，Jacalin结构域由3组平行的β折叠层围绕棱柱轴排列，具有稳定的β-棱柱结构（β-prism structure），提供了精确的糖结合空间位点，从而实现高特异性的糖结合能力^［9］。JRL蛋白在植物的抗逆性和生长调控中发挥了重要作用。水稻（Oryza sativa）的OsJAC1基因编码一种嵌合禾本科特异性蛋白，该蛋白是N端为dirigent和C端为JRL结构域的模块化蛋白，参与木质素合成调控，提高了对稻瘟病菌的抗性^［10］；水稻的OsJRL（Os01g0348900）基因通过调节苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成负向调节水稻的耐寒性^［11］；水稻的OsJRL45和OsJRL40可增强细胞的抗氧化能力并防止活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度积累，二者相互作用可增强盐胁迫耐受性^［12-14］；大麦（Hordeum vulgare）HvHorcH基因能够显著提高植物在低氮胁迫下的耐受性^［15］；毛竹（Phyllostachys edulis）PeJRL13基因在低温和盐胁迫下显著上调表达，进一步支持了JRL基因在非生物胁迫响应中的关键作用^［16］。此外，JRL蛋白还与植物生长和发育密切相关，在植物衰老相关机制中展现了潜在调控能力。在小麦（Triticum aestivum）中，在幼叶和芽顶端分生组织的春化过程中诱导了一种包含Jacalin结构域的凝集素VER2，可调节开花和小穗发育过程^［17］。拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtJAC1基因通过调节开花时间影响植物生命周期^［18］。

老芒麦（Elymus sibiricus）是一种具有优良的抗寒、抗旱性以及耐盐碱等特性的多年生禾草^［19］，在非生物胁迫响应和延缓衰老研究中具有重要价值。然而，老芒麦JRL基因家族未见有相关研究报道，其潜在功能尚未系统阐明。本研究以老芒麦为对象，利用生物信息学技术系统鉴定其JRL基因家族，结合RNA-Seq与RT-qPCR验证其在不同种质、激素处理及干旱、低温胁迫下的表达模式，揭示其在抗逆响应中的潜在功能，以期为分子育种和生态修复实践奠定理论基础，并提供重要的遗传资源。

1 材料与方法

1.1 老芒麦EsJRL基因家族成员的鉴定和染色体定位

基于课题组无参转录组数据，筛选出命名为Cluster1432.35582的编码序列（coding sequence，CDS），并提交ORF of NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）网站得到蛋白序列，将获得的蛋白序列提交InterPro^［20］（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）得到JRL的蛋白保守结构域（PF01419），并在pfam数据库（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下载该保守结构域。老芒麦全基因组数据和注释文件下载自figshare数据库（https：//figshare.com/articles/dataset/_i_Chromosome-scale_assembly_of_the_wild_cereal_relative_Elymus_sibiricus_i_/24964659），并结合HMMER3程序从老芒麦蛋白数据库中鉴定EsJRL蛋白序列。以小麦的TaJRL蛋白作为查询序列，通过Blastp在本地老芒麦蛋白数据库中进行比对，设置E-value<1e^-10。将两种方法获得的结果取并集，在InterPro和NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi）数据库中进一步验证，最后利用TBtools软件去除冗余序列。从老芒麦的基因组注释信息gff3文件中提取JRL家族基因的位置信息，并使用软件TBtools进行可视化呈现。

1.2 老芒麦EsJRL家族成员蛋白理化性质分析

使用ExPASy网站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）对EsJRL蛋白序列进行等电点、分子量预测、稳定系数和平均亲水系数等理化性质分析。

1.3 老芒麦EsJRL基因家族系统进化和共线性分析

采用Clustal W对老芒麦JRL蛋白与已报道的水稻^［21］、小麦^［22］和拟南芥^［23］JRL蛋白进行多序列比对分析。基于比对结果，使用IQ-Tree构建最大似然（maximum likelihood， ML）系统发育树，设置1000次bootstrap检验。进一步应用MCScanX进行基因组共线性分析，并通过Advanced Circos实现结果可视化。

1.4 老芒麦EsJRL基因的基因结构、保守基序和结构域分析

在MEME工具（https：//meme-suite.org/meme/index.html）中分析保守基序，最大基序数设为10，最佳基序宽度为10~50。从老芒麦gff3注释文件获得基因结构信息，利用TBtools可视化。使用NCBI CDD和SMART鉴定保守结构域并用TBtools进行可视化。

1.5 老芒麦EsJRL家族基因顺式作用元件分析

提取EsJRL转录起始位点上游2000 bp的启动子序列，并提交至Plant CARE数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件的预测分析，使用TBtools可视化顺式作用元件。

1.6 老芒麦EsJRL家族表达模式分析

为分析老芒麦EsJRL基因家族成员在不同种质老芒麦旗叶中的表达模式，从NCBI数据库中下载不同种质老芒麦的转录组数据，包括XH04早花种质老芒麦（SRR2993880-SRR2993881和SRR29938906-SRR29938909）和XH05晚花种质老芒麦（SRR29938886-SRR29938892）。利用Python程序，通过Hisat2建立索引，将老芒麦基因组数据与RNA-Seq数据进行比对，使用Feature Counts计算每个基因或转录本的read count，通过R语言的统计分析工具DESeq 2进行差异表达分析，筛选出EsJRL基因家族差异基因，通过计算log₂FC来描述不同条件下基因的响应模式，并使用pheatmap包绘制热图，进行可视化。

1.7 老芒麦EsJRL基因在非生物胁迫和外源激素处理下的RT-qPCR分析

试验材料为老芒麦种子，挑选大小均匀、饱满完整的种子于2024年7月种植在甘肃农业大学牧草实训基地。待其生长至二叶一心期，将老芒麦幼苗移入20 cm×20 cm盆栽中，每盆50株，室温培养，14 h光照，10 h黑暗，放置7 d。分别进行100 μmol·L^-1脱落酸（abscisic acid， ABA）、100 μmol·L^-1赤霉素（gibberellin， GA）和100 μmol·L^-1 水杨酸（salicylic acid， SA）激素处理，以及干旱和低温2种逆境处理。其中，干旱处理使用20% PEG 6000溶液浇灌植物，处理期将植物置于常温下，模拟水分胁迫。低温处理将老芒麦植株置于4 ℃的培养箱（HGZ-HA250，上海）中，进行冷处理以模拟低温胁迫。正常生长为对照（CK），各处理4次重复。激素处理方式为叶面喷施，至叶片表面形成均匀液滴。处理12 h后，取每个处理的叶片，液氮速冻，-80 ℃保存。采用液氮研磨法^［16］，使用TRNzol Universl总RNA提取试剂（TIANGEN，DP424）提取总RNA，并使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，RR047A）进行反转录得到cDNA，-20 ℃保存。根据老芒麦基因组中鉴定到的EsJRL基因序列，使用Primer Premier 5设计荧光定量引物（表1），通过NCBI Primer-Blast检验引物的特异性，并由北京擎科生物有限公司合成引物。以贾燕伟^［24］所用的内参基因Actin作为本试验的内参基因EsActin（正向引物：ACCCGAGACTAGATGATAACAGCA；反向引物：TAGCCTCACTCAGCACTTTCCAA），使用TBGreen® PremixExTaq™Ⅱ试剂盒（TaKaRa，宝日医生物技术（北京）有限公司）进行RT-qPCR验证，反应体系与反应程序参照试剂盒说明书，通过2^-ΔΔCt法^［24］计算基因相对表达量。

1.8 数据处理

使用Excel 2021进行基因表达量的计算，运用GraphPad Prism 9.0进行数据分析、作图和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 老芒麦EsJRL基因家族成员的鉴定和染色体定位

在老芒麦基因组中共鉴定出84个EsJRL家族成员，主要分布在13条染色体的两端，在chr1H、chr2St、chr3H和chr4H染色体两端观察到基因家族成员的密集分布，其中chr1H染色体上分布最多，为18个家族成员，chr5H染色体上分布最少，为2个家族成员，其余染色体上EsJRL家族成员有3~12个不等。此外，EsJRL基因中存在18个串联重复基因对，chr7St染色体上含3个，chr1H、chr2St、chr3St、chr4H、chr7H和chr7St染色体上含有2对，其余染色体上各含有1个串联重复对（图1）。根据EsJRL基因在染色体上的位置，依次命名为EsJRL1~EsJRL84。

2.2 老芒麦EsJRL基因家族成员蛋白理化性质分析

EsJRL基因编码氨基酸序列长度为93~1574 bp，分子量（molecular weight， MW）为9.71~178.37 kDa；等电点（theoretical isoelectric point， pI）为4.19~9.88，68个酸性蛋白质（pI<7）和26个碱性蛋白质（pI>7），表明老芒麦中JRL蛋白的等电点分布偏向于酸性；不稳定性系数（instability index，II）为10.79~46.56，部分蛋白如EsJRL42（II为22.92）在体外表现出较高的稳定性，而EsJRL17（II为46.56）稳定性较差；脂溶性指数（aliphatic index， AI）为59.13~96.68，其中EsJRL19的AI为93.80，具有较强的热稳定性，而EsJRL55的AI为59.13，显示出较低的热稳定性；亲水性平均值（grand average of hydropathicity， GRAVY）为-0.511~0.032，其中EsJRL15、Es7JRL83和EsJRL30的GRAVY值分别为0、0.006、0.032，其余91个JRL蛋白的GRAVY均小于0，表明EsJRL基因家族具有亲水性，主要倾向于在亲水环境中发挥作用（表2）。

2.3 老芒麦EsJRL基因家族成员的系统发育分析和共线性分析

为探究JRL基因家族的进化关系，基于老芒麦、小麦、拟南芥和水稻的JRL蛋白进行多序列比对与系统发育分析（图2）。结果显示，JRL基因家族成员可分为8个亚家族（Clade Ⅰ~Ⅷ），同一亚家族中的基因结构相似。各家族成员数量不等，Clade Ⅳ族最大，包含22个EsJRL蛋白、11个OsJRL蛋白、3个TaJRL蛋白和42个AtJRL蛋白，最小组为Clade Ⅱ，仅包含5个EsJRL蛋白和6个TaJRL蛋白。EsJRL蛋白分布于所有亚家族。为揭示EsJRL基因家族的进化关系，使用MCScanX对EsJRL基因进行了共线性分析（图3）。结果表明，EsJRL基因（71.4%）位于重复区域，在染色体chr1H、chr1St、chr2H、chr2St、chr3H、chr3St、chr4St、chr6H、chr7H和chr7St上共检测到21对片段重复基因。为了解其在进化过程中遇到的选择压力，对所有串联重复基因对计算了非同义替代率（non-synonymous substitution， Ka）、同义替代率（synonymous substitution， Ks）以及Ka/Ks。结果显示，所有串联基因对的Ka/Ks均小于1（表3），说明这些基因在进化历史中均受到纯化选择。

2.4 老芒麦EsJRL基因的结构、保守基序和结构域分析

通过TBtools软件对基因结构可视化，发现所有EsJRL基因都含内含子，大部分基因内含子数目为1~3个。使用在线网站MEME识别老芒麦EsJRL蛋白的10个保守基序（Motif 1~10），长度为11~39 bp。Motif 1、Motif 3和Motif 7分别存在于83、86和86个基因序列中，其中Motif 1的e值最低，为4.9e^-887，表明这些基序在基因家族中具有高度保守性。Motif 8、Motif 9和Motif 10出现频率较低。结构域分析揭示EsJRL蛋白的结构域多种多样，具有不同数量的Jacalin结构域和不同类型的其他结构域，其中8个EsJRL基因包含多个与Jacalin超家族相关的结构域，如EsJRL7、EsJRL16和EsJRL42等。此外，除了Jacalin结构域外，部分EsJRL蛋白还包含一个或多个其他类型的结构域。例如，EsJRL77包含NB-ARC、RX-CC_like、LRR、PKc_like和PLN03210结构域，EsJRL35、EsJRL43、EsJRL68和EsJRL82都包含dirigent结构域（图4）。

2.5 老芒麦EsJRL基因家族顺式作用元件分析

使用Plant CARE网站在EsJRL基因上游序列（2000 bp）区域，共鉴定出36种元件，包括光响应、激素响应、植物发育、胁迫响应及其他类型。其中，光响应元件的种类和数量占据主导地位，几乎分布于所有EsJRL基因中，主要包括G-box、ACE和Box 4元件。此外，大量激素响应元件也存在于EsJRL基因启动子区域，包括生长素响应元件（AuxRE、TGA-element）、赤霉素响应元件（GARE-motif、P-box、TATC-box）、脱落酸响应元件（the abscisic acid responsiveness， ABRE）、茉莉酸响应元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和水杨酸响应元件（TCA-element）等。除了光和激素响应元件外，EsJRL基因启动子区域还被鉴定出多种胁迫响应元件，主要包括干旱响应元件（MYB binding site， MBS）、低温响应元件（low-temperature responsiveness， LTR）、厌氧诱导响应元件（anaerobic induction responsive element， ARE）以及防御应激相关的TC-rich repeats。此外，还有大量与植物发育相关的顺式作用元件，包括种子发育调控元件（RY-element）、胚乳特异性表达元件（GCN4_motif）、细胞周期调控元件（MSA-like）及分生组织特异性表达元件（CAT-box）。同时，还鉴定出与类黄酮生物合成相关的元件（MYB binding site I， MBSI）以及与昼夜节律调控相关的circadian元件（图5）。

2.6 老芒麦EsJRL基因表达模式分析

对老芒麦RNA-seq数据进行分析，在穗期，发现有33个EsJRL基因在XH04种质的旗叶中表达，有23个在XH05种质的旗叶中表达，有19个在两个种质中均有表达。在两个种质中部分基因在开花期高表达，而到晚穗期表达量则显著降低。其中EsJRL75仅在XH04中表达，在开花期的表达量明显增加，而在晚穗期则明显下降，开花期的表达量为晚穗期的32倍。EsJRL58和EsJRL79在不同品种中的表达模式与EsJRL75表现出相似的变化趋势，表明这些基因在开花相关的生物过程（花器官发育、开花启动和生殖发育）中发挥关键作用。EsJRL82、EsJRL23和EsJRL42等基因在XH04晚穗期表达较高，但在开花期表达量较低。晚穗期EsJRL基因的表达量明显高于开花期，说明这部分基因可能与营养物质的积累和转移相关，为开花和生殖提供能量和结构基础。EsJRL82和EsJRL35在两个品种中的表达变化相反，暗示不同品种老芒麦的基因调控可能受到不同遗传背景或环境条件的影响。部分基因（EsJRL42、EsJRL35和EsJRL57）在不同发育阶段和处理条件下的表达量变化较小，表现出较高的表达稳定性（图6）。

2.7 老芒麦EsJRL基因在非生物胁迫和外源激素处理下的RT-qPCR分析

为研究EsJRL基因在不同激素（GA、ABA、SA）处理及非生物胁迫（PEG 6000、低温4 ℃）条件下的表达模式，选出13个EsJRL基因进行了RT-qPCR分析（图7）。结果显示，在不同激素和非生物胁迫条件下，EsJRL基因家族表现出显著的动态变化。在GA处理下，EsJRL8、EsJRL23、EsJRL32、EsJRL35和EsJRL43基因的表达水平较CK显著上调（P<0.05），其中EsJRL32基因上调最明显，表达量是CK的122.1倍。与之相比，EsJRL28-2基因表达水平则显著下调（P<0.05），较CK下调82%；在SA处理下，EsJRL6、EsJRL28-2和EsJRL32的表达水平较CK显著上调（P<0.05），其中EsJRL32上调最明显，表达量是CK的34.2倍；在ABA处理下，EsJRL8、EsJRL23、EsJRL29、EsJRL31-1、EsJRL31-2、EsJRL35、EsJRL37、EsJRL43和EsJRL74基因的表达水平显著上调（P<0.05），其中EsJRL31-2上调最明显，表达量为CK的798.1倍。在非生物胁迫处理中，干旱胁迫显著诱导了EsJRL14、EsJRL23和EsJRL74的表达，较CK上调至3.3、23.2和26.4倍，而EsJRL28-2则显著下调82%（P<0.05）；在低温处理下，EsJRL31-1的表达量较CK显著上调10.9倍（P<0.05），而EsJRL43的表达量显著下调约96%（P<0.05）。EsJRL43在GA处理下的表达量较CK显著上调（P<0.05）；EsJRL28-2在SA处理下的表达量较CK显著上调（P<0.05），而在GA和干旱处理下则显著下调（P<0.05）；EsJRL29在ABA处理下的表达量也显著上调（P<0.05），为CK的66.4倍，而其他处理条件下其表达量无显著变化。

3 讨论

JRL基因家族是植物中重要的转录因子家族之一，广泛参与植物的生长发育及环境适应过程。随着转基因技术和基因组学的迅速发展，许多植物物种中的JRL基因家族得到了鉴定，包括水稻^［21］、小麦^［22］和拟南芥^［23］等，这为进一步探讨JRL基因在植物中的作用机制提供了重要的研究基础。本研究结合生物信息学手段，利用老芒麦的全基因组数据，系统地鉴定和分析了EsJRL基因家族的特征，并进一步揭示了其潜在的生物学功能。老芒麦的EsJRL基因家族可能具有与水稻和小麦等禾本科物种相似的进化背景。研究表明，JRL基因的数量因物种而异，例如十字花科植物的JRL基因数量为46~123个，而禾本科植物则为20~41个^［25］。禾本科植物往往具有相似数量的JRL基因，并且这些基因可能以相似的速度扩增^［16］。本研究中，从老芒麦中鉴定出了84个EsJRL基因，数量显著高于其他禾本科植物，可能是老芒麦JRL基因家族的扩展复制所致。通过基因组数据的系统分析，构建了老芒麦、小麦、水稻和拟南芥中的JRL蛋白进化树，并将其划分为8个组（Clade Ⅰ~Ⅷ）。结果显示，老芒麦与小麦和水稻具有更近的亲缘关系，而与双子叶植物拟南芥则存在显著分化，进一步表明单子叶植物和双子叶植物在功能适应性上存在明显差异。在进化过程中，基因家族的扩展通常通过分段和串联复制实现^［26-27］。通过染色体定位和共线性分析结果表明，老芒麦EsJRL基因家族中发生了18个片段重复事件和21对串联重复基因，这些重复事件对EsJRL家族的扩展起到了重要作用。所有串联重复基因对的Ka/Ks均小于1，表明EsJRL基因家族在进化过程中经历了较强的选择性保守，从而维持了其基本功能和结构特征。这一发现与水稻OsJRL基因家族的研究一致^［28］，该研究证明JRL基因可能是通过串联和片段复制从古老的Jacalin结构域进化而来的。启动子区域的分析表明，老芒麦EsJRL基因家族启动子区域含有36种顺式作用元件，主要包括光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件和植物发育相关元件等，光响应元件（如G-box、ACE、Box 4）几乎分布于所有基因中。在非生物胁迫下，对水稻的研究发现，OsJRL蛋白在干旱和激素处理下具有高度的组织特异性^［29］。除激素反应元件（如ABA、GA和SA相关响应元件等）外，还检测到大量与非生物胁迫和植物发育相关的顺式作用元件的存在，表明JRL基因家族不仅与植物的胁迫响应相关，而且还可能在种子发育、细胞周期调控及分生组织的特异性表达中起着重要作用。胡婉茵^［30］的研究发现，OsJRL（LOC_Os01g24710）可能作为一种镉离子外排转运体参与水稻镉代谢，通过CRISPR/Cas基因敲除OsJRL基因，使其蛋白功能域的不完整导致蛋白功能丧失或部分丧失，提高突变体的镉吸收能力，降低了镉胁迫耐受限度。

许多植物凝集素主要存在于储存组织中，例如种子、块茎、鳞茎、根茎和树皮^［31］。RNA-Seq分析显示，老芒麦EsJRL基因在旗叶的表达具有显著的时空特异性，仅33个EsJRL基因在开花期和抽穗期显著表达，其中EsJRL49、EsJRL52、EsJRL82和EsJRL75基因在抽穗期表达量较高。暗示这些基因可能在花器官发育和籽粒形成中起关键作用，并与小麦中JRL基因在花器官和籽粒发育中的表达模式一致^［17］。此外，JRL基因对多种植物激素的诱导具有显著响应。小麦中的TaJRLL1对SA和茉莉酸甲酯（MeJA）处理有响应^［32］。在本研究中挑选了13个EsJRL基因，分析其在GA、ABA、SA、干旱和低温处理下的表达模式。结果显示，GA处理后8个EsJRL基因上调表达，SA处理后34个EsJRL基因上调表达，ABA处理后7个EsJRL基因上调表达。不同激素处理对不同基因的表达模式存在显著差异。例如，在GA和SA处理下EsJRL32表达水平显著上调，而在ABA中几乎未发生变化；相反，EsJRL37在ABA处理下表达显著上调，而在GA和SA处理中无显著变化。结果表明，JRL基因对激素的响应具有较高的特异性，并可能通过不同的信号通路实现功能。陈同睿等^［33］的研究发现小麦的TaJRL53可能通过调控植物体内活性氧产生、茉莉酸（jasmonate，JA）信号途径、诱导病程相关蛋白基因的表达水平，从而提高植株对赤霉菌的抗性。张会龙^［34］的研究表明，过表达PeJRL能够抑制转基因拟南芥中ABA的生物合成，减轻了由ABA诱导产生的活性氧所造成的氧化损伤。并非所有对生物胁迫有反应的EsJRL基因都受植物激素调节，部分基因在某些激素处理下调，在其他植物中也报道了类似的发现。此外，EsJRL对低温和干旱胁迫下响应分析显示，EsJRL74和EsJRL23在干旱处理下表达水平显著上调，而EsJRL31-1在低温处理下显著下调。与EsJRL43互为同源基因的EsJRL35的表达在所有处理下均无显著变化，表明这些基因在非生物胁迫下可能以不同的方式发挥作用。

4 结论

本研究从老芒麦参考基因组中鉴定到84条EsJRL基因，不均匀分布在13条染色体的两端。EsJRL蛋白相对较小，编码的氨基酸为93~1574个，分子量为9.71~178.37 kDa。根据系统发育关系、保守基序及基因结构，可将EsJRL蛋白分为8组，大部分成员均含有Motif 1、Motif 3和Motif 7。顺式作用元件分析共预测到37种元件，以光响应和激素响应元件为主。共线性分析表明，片段重复和串联重复在该家族的扩增中起到了重要作用。RNA-Seq数据揭示了不同EsJRL基因可能在老芒麦生长发育过程中发挥着不同的功能。RT-qPCR结果表明，13个EsJRL基因均能参与响应干旱、低温和激素胁迫，并且其响应过程可能与ABA信号传导相关。本研究结果可为进一步探究EsJRL基因功能提供理论依据，揭示它们在植物生长发育、环境适应以及抗逆性改良中的关键作用，为老芒麦等作物的分子育种提供新的研究思路。

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基金资助

国家现代农业产业技术体系(CARS-34)

国家自然科学基金(31660684)