藜麦NAC转录因子CqNAC66响应干旱和盐胁迫的功能研究

Functional analysis of quinoa NAC transcription factor CqNAC66 in response to drought and salt stress

摘要

为探究藜麦NAC家族成员CqNAC66基因的抗旱耐盐功能，本研究对CqNAC66进行亚细胞定位，并将CqNAC66基因导入本氏烟草中进行过表达，比较野生型和转基因株系在干旱（20%PEG-6000）和盐（200 mmol·L^-1 NaCl）胁迫下的形态及生理响应。结果表明，CqNAC66转录因子定位在细胞核中；过表达CqNAC66能够显著降低烟草植株的离体叶片失水率；在干旱和盐胁迫下，过表达CqNAC66能够显著降低烟草的萎蔫指数，并显著提高烟草叶片的表面积和地上部鲜重；过表达CqNAC66能够显著提高烟草叶片的叶绿素相对含量（SPAD值）和过氧化物酶活性，显著降低丙二醛含量。综上所述，CqNAC66在烟草中的异源表达能够显著提高烟草植株的抗旱性和耐盐性，CqNAC66可能通过保持植株的叶绿素稳定，调节植物的抗氧化酶系统，缓解胁迫造成的细胞氧化损伤来提高转基因烟草抵抗干旱和盐胁迫的能力。

Abstract

This research explored the function of quinoa （Chenopodium quinoa） NAC family member， CqNAC66 involved in drought resistance and salt tolerance. CqNAC66 was subcellularly localized in this study， and transgenic lines of Nicotiana benthamiana overexpressing CqNAC66 were obtained to compare the morphological and physiological responses of wild-type （WT） and transgenic plants after exposure to drought （20% PEG-6000） and salt （200 mmol·L^-1 NaCl） stress. The results showed that CqNAC66 protein was subcellularly localized in the nucleus. Overexpression of CqNAC66 significantly decreased the water loss rates of excised leaves of tobacco plants. Under drought and salt stress treatment， overexpression of CqNAC66 in tobacco plants significantly decreased the leaf wilting index， and significantly increased the leaf surface area and aboveground fresh weight. In addition， overexpression of CqNAC66 significantly increased the relative content of chlorophyll （SPAD） and the activities of peroxidase， and significantly decreased the content of malondialdehyde in leaves of the studied tobacco plants. In conclusion， the heterologous expression of CqNAC66 in N. benthamiana improved the drought and salt tolerance of plants and CqNAC66 appeared to improve the resistance of transgenic tobacco by maintaining the stability of chlorophyll， regulating the plant antioxidant enzyme system and alleviating the cellular oxidative damage caused by stress.

Graphical abstract

关键词

藜麦 / CqNAC66 / 抗旱 / 耐盐 / 功能验证

Key words

quinoa / CqNAC66 / drought resistance / salt tolerance / functional verification

干旱和盐胁迫是影响农作物产量和品质的重要限制因素，严重制约农业发展^［1-2］。藜麦（Chenopodium quinoa，2n=4x=36）为一年生苋科藜属作物，原产于南美洲安第斯山地区，是一类营养丰富的双子叶假谷物。作为印加土著居民的主要传统食物，藜麦已有7000多年的种植历史，被古代印加人称为“粮食之母”^［3］。藜麦种子无麸质且营养丰富，是一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物。更重要的是，藜麦能够在极端气候环境及土壤条件下生长，对于土壤盐渍、干旱、霜冻等逆境胁迫表现突出的抗性^［3］。藜麦在抗旱、耐盐防御响应中会产生一系列涉及多信号途径的应答反应，例如藜麦盐泡细胞中Na⁺和Cl^-的离子转运、盐分的隔离或外排^［4］、根尖细胞的钾保持^［5］、有机渗透调节物质的积累^{［4，6-7］}、气孔关闭的调节^［8-9］、主根的生长^［10］、抗氧化酶活性的增强^［11］及胁迫应答相关基因的表达^［12-13］等，这些均受到复杂的基因调控。其中，转录因子作为一类重要的调节蛋白，通过与胁迫应答基因启动子上的顺式作用元件相结合来激活下游目标基因的表达，实现转录水平上的调控。NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）家族是植物中最大的转录因子家族之一，其命名源于矮牵牛（Petunia×atkinsiana）NAM（no apical meristem）、拟南芥ATAF1/2（Arabidopsis thaliana transcription activation factor 1/2）和CUC2（cup-shape cotyledon 2）基因^［14］。NAC调控植物抗旱和耐盐性的分子机制研究已在拟南芥、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）和玉米（Zea mays）等植物中报道^［14］。藜麦是异源四倍体作物，遗传背景比较复杂，相较于拟南芥和水稻等模式植物，藜麦抗旱及耐盐的理论基础研究仍相对滞后。

转录因子NAC在结构上主要由位于N末段有较高保守性的NAC区和位于C末端相对多样性的转录激活区（transcription activation region，TAR）组成，其中NAC区可以进一步分为A、B、C、D和E五个亚区，C亚区含有与DNA连接有关的DNA结合区（DNA binding domain，DBD），D亚区则含有与细胞核定位有关的核定位信号区（nuclear localization signal，NLS）^［1，15］。转录因子NAC不仅在植物生长发育过程中起着重要的调节作用，还参与多种生物及非生物胁迫的抗逆反应^［16］。有研究表明，NAC基因主要通过激活胁迫应答相关基因的表达^［17-18］，调节 Na⁺/K⁺平衡及基因的表达量^［19］，促进有机渗透调节物质的积累^{［17， 20-21］}，调节气孔关闭^{［17， 20， 22］}，调控植株根系发育^{［17， 23-24］}等方式来响应干旱及盐胁迫，提高植株的抗逆性。NAC019/055/072属于AtNAC3亚家族，是NAC转录因子家族的重要成员。拟南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072（RD26）蛋白序列同源性高，其基因的表达模式和功能类似^［25］。有研究表明，这3个密切相关的拟南芥NAC蛋白能够响应各种非生物胁迫和激素的处理^［14］。例如，ANAC019/055/072能够被干旱、高盐和脱落酸（abscisic acid，ABA）所诱导，过表达ANAC019/055/072会提高转基因拟南芥的抗旱能力，并且这3个蛋白能与干旱诱导基因ERD1（early responsive to dehydration stress）的启动子区域（包含MYC-like序列CATGTG）特异性结合^［26］。此外，ANAC019/055参与植物防御响应中茉莉酸（jasmonic acid，JA）和ABA信号转导途径之间的交叉对话^［27］，ANAC019/055还能在EIN2和EIN3下游发挥功能^［28］，而EIN2和EIN3是增强植物盐胁迫抗性的乙烯信号通路的正调控因子^［29］。NAC072则与依赖ABA的防御响应相关，ANAC019/055/072基因含有ABRE基序，能够响应外源ABA的诱导^［27］。

本研究前期工作^［1］鉴定出藜麦含有90个NAC转录因子成员，其中CqNAC66为AtNAC3亚家族成员，与拟南芥ANAC019/055/072同属一个亚家族，编码区为897 bp，编码298个氨基酸。CqNAC66在藜麦根和叶片的表达量较高，在茎部表达量较低；盐胁迫处理下藜麦根部CqNAC66的表达量明显上升^［1］。目前，藜麦抗逆基因的研究主要集中在基因表达方面，基因功能验证方面的研究较少，且藜麦高效稳定的遗传转化体系还未建立，基于藜麦的功能基因研究受到较大的阻力，因此本研究构建该基因的过表达载体，通过对本氏烟草（Nicotiana benthamiana）进行遗传转化，测定干旱和盐胁迫下CqNAC66转基因植株的形态和生理指标，来探究藜麦CqNAC66响应干旱和盐胁迫的功能，为藜麦抗逆分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以本氏烟草为背景材料进行遗传转化。工程菌为大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101。过表达载体pART-CAM购自陕西博瑞德公司。NovoRec^® Plus One Step PCR Cloning Kit购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。植物基因组DNA提取试剂盒TransDirect Plant Tissue PCR Kit购自北京全式金生物技术股份有限公司。植物RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit和荧光定量PCR试剂盒2×QuantiTect SYBR Green PCR mix购自德国QIAGEN公司，反转录试剂盒SuperScript™ Ⅲ Reverse Transcriptase Kit购自美国Invitrogen公司。

1.2 试验方法

1.2.1 CqNAC66过表达载体的构建和转基因烟草的获得

含有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点的CqNAC66的CDS序列由北京擎科公司合成，所获得的基因片段连接至过表达载体pART-CAM的多克隆位点处。构建好的重组质粒pCAM-CqNAC66经过测序验证之后转入农杆菌菌株GV3101中，采用叶盘法^［30］对本氏烟草进行农杆菌介导的CqNAC66过表达遗传转化。再生植株生成后，切取部分叶片提取基因组DNA，用于PCR验证的基因特异引物如表1所示，扩增的目的片段长度是305 bp，退火温度为56 ℃。此外，提取烟草叶片的RNA，并反转录成cDNA。烟草内参基因为β-actin gene（JQ256516.1），引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0设计，由华大基因公司合成，具体序列如表1所示，退火温度为59 ℃，循环次数设定为40个循环，CqNAC66基因的相对表达量通过2^{-ΔΔCt［31］}的方法进行计算。

1.2.2 藜麦CqNAC66的亚细胞定位

以重组载体pCAM-CqNAC66为模板，通过PCR的方法克隆目的基因，引物序列见表1，其中下划线标记序列为与载体同源的序列，退火温度为56 ℃，扩增长度为932 bp。采用同源重组的方法将所扩增出的基因片段连接至pCAM-EGFP质粒的XhoⅠ和EcoRⅠ多克隆位点处，测序验证后将重组载体导入农杆菌GV3101中，并将检测成功的菌液注射到烟草倒三叶和倒四叶中进行侵染，黑暗过夜后正常培养2 d，之后切取侵染区域，撕表皮制片，并用FV3000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）进行观察。

1.2.3 植物材料的处理和取样

将过表达CqNAC66和野生型的烟草种子播于MS培养基（4.54 g MS粉+30 g 蔗糖+7 g琼脂粉）上，置于22~24 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度50%~70%的MGC-350HP-2气候箱（上海一恒科学仪器有限公司）中生长2周，之后将幼苗移栽到营养土壤与蛭石的混合基质中（营养土∶蛭石=2∶1）培养2周。分别配制20%的PEG-6000和200 mmol·L^-1的NaCl胁迫溶液，随机挑取生长良好且一致的植株进行胁迫处理。将处理3 d后的烟草植株进行形态鉴定和相关形态指标的测定，并采集鲜样用于生理指标的测定。每个样品采集自3株独立的植株，进行3次生物学重复。

1.2.4 相关形态和生理指标的测定

参照前人研究^［32］统计植株的萎蔫程度分级（图1），并根据公式\sum \frac{\mathrm{萎蔫}\mathrm{级数}\times \mathrm{该级}\mathrm{株数}}{\mathrm{最高}\mathrm{萎蔫}\mathrm{级数}\times \mathrm{总株}\mathrm{数}}计算植株的萎蔫指数；利用Yaxin-1241叶面积仪（北京雅欣理仪科技有限公司）获取烟草叶片的表面积；使用千分称测定烟草植株的地上部鲜重；完整剪下正常生长的CqNAC66转基因烟草和野生型烟草的第2片完全展开叶，立即测定质量m₀，之后分别于叶片离体后0.5、1、2、3、4、5、6 h测定质量m_x，并根据公式（m₀-m_x ）/m₀×100%计算离体叶片的失水率，具体方法参照前人研究^［33］；使用SPAD-502 Plus叶绿素仪（日本Konica Minolta公司）测定烟草第3片完全展开叶的相对叶绿素含量（soil and plant analyzer development，SPAD）并避开叶脉，重复测定3次。采用愈创木酚法测定过氧化物酶（peroxidase， POD）活性，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量^［34］。

1.3 数据处理

采用Excel软件处理数据和作图，使用SPSS 25.0软件，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey HSD法分析显著性差异（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 CqNAC66的亚细胞定位

2.1.1 pCAM-CqNAC66-EGFP的构建和农杆菌GV3101的转化

根据CqNAC66基因和pCAM-EGFP载体序列设计特异性PCR引物，以pCAM-CqNAC66载体为模板进行PCR扩增，1.0%琼脂糖电泳检测获得大小为932 bp的条带，与预期目的片段相符合（图2A）。切胶回收后将CqNAC66与过表达载体pCAM-EGFP相连接，转化到大肠杆菌后挑单克隆进行菌落PCR鉴定后并测序，如此完成重组载体pCAM-CqNAC66-EGFP的构建（图2B）。将测序正确的质粒转化农杆菌（图2C），用于烟草的瞬时转化。

2.1.2 CqNAC66的亚细胞定位

本研究利用农杆菌介导法，在本氏烟草中分别瞬时表达CqNAC66-GFP融合蛋白以及GFP蛋白。通过共聚焦显微镜进行观察，结果发现CqNAC66-GFP融合蛋白的绿色荧光信号仅存在于细胞核处，但GFP蛋白的绿色荧光信号弥散于整个细胞质中（图3）。

2.2 CqNAC66过表达载体的构建及转基因烟草的获得

本研究通过化学合成法克隆CqNAC66的CDS序列（图4A），并将其连接到表达载体pART-CAM上，完成重组载体pCAM-CqNAC66的构建（图4B），之后将重组载体导入到农杆菌中。烟草叶盘被CqNAC66转基因农杆菌侵染后置于培养基上共培养（图4C），并进行新生芽（图4D）和根的分化（图4E）。

对再生幼苗进行PCR鉴定，特异性条带为305 bp（图5A），与预期目的片段相符合，说明CqNAC66外源基因已整合到烟草植株的基因组DNA中，获得20株阳性植株。将阳性植株移栽生长后，挑选8个转基因株系进行qPCR检测，发现CqNAC66在转基因烟草中成功表达（图5B），结合CqNAC66的表达量和植株生长表型，本研究确定CqNAC66-15和CqNAC66-17株系作为后续用于CqNAC66基因功能验证的试验材料。

2.3 CqNAC66转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性

2.3.1 烟草植株的表型分析

为了确定CqNAC66是否参与烟草对干旱和盐胁迫的响应过程，本研究对烟草植株的离体叶片失水率进行测定，并进行逆境胁迫下植株的表型分析。结果显示，在正常生长条件（CK）下，野生型（WT）和CqNAC66转基因植株的长势一致，在干旱（20%PEG-6000）和盐（200 mmol·L^-1 NaCl）胁迫处理3 d后，野生型烟草的叶片出现萎蔫，叶柄变软，植株生长受到明显抑制，而过表达植株CqNAC66-15和CqNAC66-17株系的萎蔫程度较浅，与CK相比植株的生长未受到显著抑制（图6）。

当植物遭遇干旱、盐胁迫后，水分亏缺严重，细胞失去紧张，叶片和茎的幼嫩部分下垂，引起萎蔫现象。因此，通过将萎蔫指数作为评估植物抗旱、耐盐性的重要指标。本研究结果表明，干旱胁迫下，WT叶片发生萎蔫，其萎蔫指数显著高于CK；转基因株系CqNAC66-15和CqNAC66-17虽出现了萎蔫，但萎蔫指数较低。盐胁迫下，WT叶片萎蔫指数显著高于CK，而CqNAC66转基因株系未出现萎蔫现象（图7）。本研究对烟草植株叶片的表面积进行测定，结果表明，在干旱和盐胁迫下，WT的叶片生长受到抑制，与CK相比分别显著下降了62.49%和38.45%（P<0.05），而CqNAC66-15和CqNAC66-17株系叶片的表面积与CK相比无显著差异。干旱和盐胁迫下，WT植株的地上部鲜重与CK相比分别显著下降了63.82%和38.59%（P<0.05），其地上部生长被显著抑制，而CqNAC66-15和CqNAC66-17的地上部鲜重与CK相比无显著差异。在离体0~2 h，CqNAC66转基因植株的叶片与WT相比无显著差异；离体3~6 h之后，CqNAC66转基因植株的离体叶片失水率极显著低于WT（P<0.01）。

2.3.2 烟草叶片的生理指标分析

在干旱（20% PEG-6000）和盐（200 mmol·L^-1 NaCl）胁迫下，WT叶片SPAD值与CK相比分别显著下降了23.96%和35.26%（P<0.05），而2种胁迫处理下的CqNAC66转基因植株SPAD值与CK相比无显著差异（图8）。在干旱和盐胁迫下，WT叶片内的POD活性与CK相比仅轻微上升，无显著差异；而2种胁迫处理后CqNAC66转基因植株与CK相比POD活性显著上升，其中CqNAC66-15株系分别升高40.40%和36.61%（P<0.05），CqNAC66-17株系分别升高49.64%和52.41%（P<0.05）。此外，在干旱和盐胁迫下，WT叶片的MDA含量与CK相比分别显著升高227.50%和178.15%；而2种胁迫处理后的CqNAC66转基因植株的MDA含量与CK相比无显著差异。

3 讨论

转录因子CqNAC66是藜麦AtNAC3亚家族的重要成员，与ANAC019/055/072同源性较高，而ANAC019、ANAC055和ANAC072这3个同源基因能够响应各种逆境胁迫^［14］，过表达这些基因能够显著提高植株对逆境胁迫的耐受性^{［14， 26-27］}。前期研究^［1］通过对CqNAC66蛋白的结构进行分析，发现在CqNAC66蛋白的D亚区处存在一个潜在的核定位信号，这表明CqNAC66的亚细胞定位可能在细胞核处。本研究的烟草瞬时表达试验进一步表明CqNAC66是一个核蛋白，定位在细胞核处，这与其他研究的NAC转录因子亚细胞定位结果一致^［35-36］。

通过比较干旱和盐胁迫处理后植株的萎蔫指数、叶片表面积及地上部鲜重等形态指标，结果表明WT发生显著萎蔫，且植株的生长受到显著抑制，而CqNAC66转基因株系在遭受胁迫后的萎蔫指数较低，且生长受抑制程度不显著，说明CqNAC66在烟草中的异源表达能够显著提高植株的抗旱性和耐盐性。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量直接影响植物的光合效率和生长状态。SPAD值是叶绿素的相对含量，可评估植物对逆境的响应程度和耐受性^［37］。本研究中WT在干旱和盐胁迫处理下SPAD值显著下降，说明胁迫后WT叶片的叶绿素合成和积累受到影响，进而影响植株的光合作用效率；而CqNAC66转基因植株在胁迫处理下SPAD值未发生显著变化，说明胁迫条件下转基因植株叶片内的叶绿素未发生分解。当植物遭遇环境压力时，会导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）在体内过量积累，植物可以通过激活抗氧化酶活性来维持细胞ROS稳态，帮助植物抵御不良影响^［38］。因此，POD活性可以作为衡量植物生长发育和抗逆性的指标。MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物在逆境条件下的受伤害程度^［39］。在本研究中，CqNAC66转基因烟草叶片在胁迫处理后呈高水平的POD活性和低水平的MDA含量也反映了转录因子CqNAC66的导入能够激活烟草植株的抗氧化途径，增强抗氧化酶活性，降低细胞的氧化损伤，从而提高烟草的抗旱性和耐盐性。此外离体叶片失水率的测定结果也表明过表达CqNAC66能够显著降低烟草离体叶片的失水率，增强烟草植株的抗逆性。本研究转基因植株对逆境胁迫的形态和生理响应结果与前人研究类似^［40-41］。CqNAC66转录因子响应藜麦干旱和盐胁迫抗性机制仍需进一步深入研究。

4 结论

本研究对藜麦CqNAC66转录因子进行亚细胞定位，并以CqNAC66转基因烟草为材料，探讨其抗旱、耐盐功能，结果发现，藜麦CqNAC66转录因子定位于细胞核中，CqNAC66在烟草中过表达能够显著降低干旱和盐胁迫下植株的萎蔫程度及生长受抑制程度，并且CqNAC66通过保持叶绿素稳定，提高抗氧化酶活性，减少细胞氧化损伤来提高转基因烟草的抗旱耐盐能力。本研究为藜麦的抗逆机制挖掘奠定基础，也为其他植物的抗逆分子育种提供基因资源。

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基金资助

山西省基础研究计划（自由探索类）面上项目(202303021221167)

山西大同大学博士科研启动基金项目(2017-B-18)