紫花苜蓿与红豆草在不同生长时期缩合单宁合成差异的比较研究

A comparative study of differences in condensed tannin synthesis between Medicago sativa and Onobrychis viciifolia at different growth stages

摘要

本研究以‘甘农3号’、‘甘农7号’、‘精英’紫花苜蓿及‘甘肃’红豆草为材料，分析苗期至成熟期6个生长期茎、叶部位总酚、总黄酮、缩合单宁（CT）及次生代谢产物（芦丁、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素）动态积累规律，并测定苯丙烷代谢途径关键酶［苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）］和类黄酮途径［花青素还原酶（ANR）、无色花色素还原酶（LAR）］活性，以解析缩合单宁合成调控机制。结果表明：1）缩合单宁含量随生育期推进呈显著变化，‘甘肃’红豆草现蕾期、紫花苜蓿结荚期为累积高峰期，且叶部含量普遍高于茎部；2）总黄酮与芦丁含量变化趋势与缩合单宁相似；3）4CL、ANR、PAL、LAR和C4H活性在‘甘肃’红豆草现蕾期、紫花苜蓿结荚期显著升高，表明苯丙烷代谢向缩合单宁合成方向增强。品种间比较显示，‘甘农3号’紫花苜蓿缩合单宁含量在结荚期显著高于其他品种（P<0.05），表示其具有更强单宁合成潜力。本研究明确了 CT 合成关键酶与代谢产物的动态关联，为牧草 CT 代谢调控及高单宁品种选育提供理论依据。

Abstract

In this study， we explored the differences in condensed tannin （CT） synthesis and accumulation between alfalfa （Medicago sativa） and sainfoin （Onobrychis viciifolia）. Stems and leaves of the alfalfa cultivars ‘Gannong No. 3’， ‘Gannong No. 7’， and ‘Elite’， and the sainfoin ‘Gansu’ were sampled across six growth stages from seedling to maturity. The contents of total phenolics， total flavonoids， CTs， and secondary metabolites （rutin， gallic acid， epicatechin gallate， epicatechin， catechin） were determined. In addition， to decipher the regulatory mechanism of condensed tannin synthesis， we measured the activities of key enzymes in the phenylpropanoid metabolic pathway （phenylalanine ammonia-lyase， PAL； 4-coumarate-CoA ligase， 4CL； cinnamate 4-hydroxylase， C4H） and the flavonoid pathway （anthocyanidin reductase， ANR and leucoanthocyanidin reductase， LAR）. The results show that： 1） The condensed tannin content varied significantly among growth stages， peaking at the bud stage in O. viciifolia ‘Gansu’ and the pod-setting stage in M. sativa， while the condensed tannin content was generally higher in leaves than in stems. 2） The trends in the contents of total flavonoids and rutin were analogous to those of condensed tannins. 3） The activities of 4CL， ANR， PAL， LAR， and C4H significantly increased at the bud stage of O. viciifolia ‘Gansu’ and the pod-setting stage of M. sativa， indicative of enhanced metabolic flow of the phenylpropanoid pathway towards condensed tannin synthesis. Among the alfalfa varieties， M. sativa ‘Gannong No. 3’ exhibited significantly higher condensed tannin content at the pod-setting stage （P<0.05）， suggesting stronger tannin synthesis potential. The results of this study clarify the dynamic correlations between key CT synthesis enzymes and metabolites， providing a theoretical basis for metabolic regulation of CT in forage crops and for breeding high-tannin varieties.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / 红豆草 / 缩合单宁 / 酚酸

Key words

Medicago sativa / Onobrychis viciifolia / condensed tannins / phenolic acids

缩合单宁（condensed tannins，CT）属于类黄酮物质，也被称为原花青素（phenolic acids，PA）^［1］，CT的合成受苯丙烷代谢途径［苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、4-香豆酸-CoA连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）］ ^［2］和类黄酮合成途径［花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）、无色花色素还原酶（leucoanthocyanidin reductase，LAR）］关键酶的协同调控^［3-4］，其核心结构由儿茶素（catechin）和表儿茶素（epicatechin）单元构成^［5］。缩合单宁广泛存在于植物界，是牧草中重要活性成分，通常存在于饲料豆科植物的叶、茎、花和种子中^［6］。在豆科牧草中，CT可通过结合蛋白质形成难溶性复合物，减缓瘤胃微生物对蛋白质的快速降解，从而降低气体（如甲烷、CO₂）瞬时过量产生，预防反刍动物臌胀病^［7-9］。然而，CT在不同牧草中的含量差异显著，紫花苜蓿和红豆草是具有不同CT含量的优质牧草，其CT含量受生长期影响较大^［10］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）作为多年生豆科牧草，具有饲用价值好、营养丰富、适口性好、产量高且稳定等特点，被誉为“牧草之王”^［11］。与禾本科植物和许多豆科植物相比，紫花苜蓿的初始蛋白质降解速度过快，苜蓿叶表皮细胞壁和叶肉细胞质地较薄，且叶部中几乎不含有CT，易导致反刍家畜大量采食后发生臌胀病^［12-14］。

红豆草（Onobrychis viciaefolia）作为多年生豆科牧草，富含蛋白质、氨基酸、粗脂肪和矿物质，被誉为“牧草皇后”^［15-17］。红豆草因富含缩合单宁而具有预防臌胀病的作用，是一种优良的豆科牧草^［18］。

紫花苜蓿与红豆草同属豆科牧草，却在饲用价值形成机制上呈现显著分异——前者以高蛋白低单宁为特点，后者因富含 CT 可降低反刍动物胀气风险。目前关于紫花苜蓿、红豆草茎、叶组织中CT合成代谢的变化规律主要集中在不同发育阶段（如营养生长期、盛花期、成熟期）、不同部位含量动态研究、不同环境因子对CT合成的调控机制^{［17，19-21］}，对不同生长期CT含量及前体物质（如儿茶素、表儿茶素）含量与相关酶活性的关联性仍不明确。本研究分析紫花苜蓿、红豆草茎、叶CT、前体物质、合成关键酶活性在不同发育期的含量变化，分析不同生育期茎、叶组织中 CT 及其前体物质积累规律以及关键限速酶活性动态变化，进一步分析代谢产物与酶活性的内在关联，以期为CT代谢调控机制及牧草品种改良提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试供材料

紫花苜蓿、红豆草草种均由甘肃创绿草业科技有限公司提供，品种包括：‘甘农3号’（Gannong No.3）；‘甘农7号’（Gannong No.7）；精英（Elite），‘甘肃’红豆草（O. viciifolia ‘Gansu’）。

甲醇、乙酸、乙腈：色谱纯。没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、表儿茶素没食子酸酯、L-苯丙氨酸、肉桂酸、对香豆酸、矢车菊素、二氢槲皮素：纯度≥98%，购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验地概况

本研究于2024年在甘肃省张掖市高台县小海子村试验基地开展。试验区属温带大陆性干旱气候，年均温8.0 ℃，年降水量250~350 mm。

1.3 试验设计

采用随机区组设计，设3次重复，小区面积3 m×5 m（15 m²），株距20~25 cm，行距50 cm。田间管理按当地紫花苜蓿高产栽培模式进行，统一实施灌溉、除草及病虫害防治措施。

1.4 样品采集与处理

于紫花苜蓿6个关键生长期进行采样：苗期（2024-04-30）、分枝期（2024-05-17）、现蕾期（2024-06-06）、开花期（2024-06-20）、结荚期（2024-07-02）和成熟期（2024-07-30）。每小区随机选取3个样点，分别采集茎、叶组织样品各50 g，迅速置于液氮中速冻，24 h内转移至-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续总酚、总黄酮、CT含量、前体物质及代谢酶活性测定。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 前体物质含量测定

1） 测定指标： 芦丁（rutin）、没食子酸（gallic acid）、儿茶素（catechin）、表儿茶素（epicatechin）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate）。

2） 样品处理： 称取 0.2 g样品于10 mL离心管，加入2 mL 70%的甲醇溶液，将样品混匀，50 ℃超声波提取30 min后，12000 r·min^-1 室温条件下离心10 min；将上清转移至新的10 mL离心管，其沉淀按上述步骤重新提取2次；将3次离心后的上清混匀后过0.22 μm滤膜备用^［22-23］。

3） 仪器条件： 色谱柱：Diamonsil C18 （250.0 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：40 ℃；进样量：10 µL；检测波长：280 nm；流动相：A为乙腈，B为0.5%乙酸^［24-26］（表1， 表2）。

1.5.2 总酚、总黄酮、缩合单宁含量测定

总酚含量采用福林-酚比色法测定^［27］。以没食子酸绘制标准曲线，得曲线方程为y=0.3267x+0.0016，R²=1。

总黄酮含量：采用NaNO₂-AlCl₃比色法测定^［28-29］。以芦丁绘制标准曲线，得曲线方程为y=0.2269x+0.0112，R²=0.9996。

缩合单宁含量：采用香草醛-盐酸法测定^［30］。以儿茶素绘制标准曲线，得曲线方程为y=0.2045x+0.0009，R²=0.9997。

1.5.3 酶活性测定

4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）活性的测定：参照Knobloeh等的方法^［31］，略有改进。取0.5 g左右叶部研磨匀浆， 转入离心管加提取液0.1 mol·L^-1 Tris-HCL （pH 7.5） 2 mL， 4 ℃下12000 r·min^-1离心20 min， 上清液为酶粗提取液用于测定4CL活性。反应系统由5 mmol·L^-1对香豆酸， 2 mmol·L^-1 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）， 1 mmol·L^-1 辅酶A（coenzyme A， CoA）， 5 mmol·L^-1 MgCl₂， 0.1 mol·L^-1 Tris-HCL （pH 7.5）缓冲液组成， 反应时加酶液0.1 mL， 30 ℃水浴反应30 min， 333 nm测定吸光值。设置空白对照，除不加入酶液外，其他反应体系成分和操作步骤与样品组相同，下同。

花青素还原酶（ANR） 活性的测定：采用分光光度法测定^{［12， 32］}，略有改进。取0.5 g左右叶部研磨匀浆， 转入离心管加提取液0.1 mol·L^-1 磷酸缓冲液（pH 7.0） 2 mL， 4 ℃下12000 r·min^-1离心20 min， 上清液为酶粗提取液用于测定ANR活性。反应体系包括5 mmol·L^-1矢车菊素、1 mmol·L^-1辅酶NADPH、0.5 mmol·L^-1抗坏血酸（vitamin C， Vc） 和0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液（pH 7.0）组成，反应时加酶液0.2 mL，25 ℃水浴反应30 min，在紫外可见分光光度计340 nm测定吸光值。

肉桂酸-4-羟化酶（C4H） 活性的测定：采用分光光度法测定^［33-34］，略有改进。酶液提取与4CL一致。反应体系包括5 mmol·L^-1肉桂酸溶液、1 mmol·L^-1辅酶NADPH、0.1 mol·L^-1 Tris-HCL （pH 7.5）缓冲液组成，反应时加酶液0.1 mL，30 ℃水浴反应30 min 后，在 310 nm 处测定吸光值。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定：采用苯丙氨酸比色法^［35］。取0.5 g左右叶部研磨匀浆， 加入 0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），转入离心管加0.1 mol·L^-1 硼酸缓冲液［pH 8.8，含 10 mmol·L^-1 巯基乙醇和 50 mmol·L^-1 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt， EDTA-Na₂）］，4 ℃下12000 r·min^-1离心20 min， 上清液为酶粗提取液用于测定PAL活性。反应系统由0.1 mol·L^-1 硼酸缓冲液（pH 8.8）， 20 mmol·L^-1 L-苯丙氨酸溶液组成， 反应时加酶液0.1 mL， 37 ℃水浴反应30 min，290 nm测定吸光值。

无色花青素还原酶（LAR）活性的测定：采用分光光度法测定^［36］。称取0.5 g左右叶部研磨匀浆， 加入 0.5 g PVP，转入离心管加加0.1 mol·L^-1硼酸缓冲液（pH 8.8），混匀后，静置 10 min，4 ℃、8500 r·min^-1，离心10 min，取上清，即为粗酶液。反应体系包括 0.82 mmol·L^-1 NADPH·Na₄， 0.1 mol·L^-1 Tris-HCI （pH 7.7）， 0.024 mmol·L^-1 二氢槲皮素，在65 ℃下反应1 h； 再加入8% HCI-甲醇， 6% 香草醛-甲醇，在65 ℃下反应1 h （期间不断摇动试管）；反应结束后于500 nm处测定吸光值。

1.6 数据分析

用Excel 和SPSS（11.0）软件进行数据处理， 采用SPSS（11.0）进行方差分析（ANOVA），检验各组间差异的显著性，用Origin 2024软件绘图。

2 结果与分析

2.1 超高效液相色谱（UPLC）测定缩合单宁合成前体物质

2.1.1 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草芦丁含量

SE时期，GSHD-L芦丁含量最高（13.760 μg·g^-1）（P<0.05），此时期各品种芦丁含量叶部均高于茎部。BR时期，芦丁含量整体上升。BU时期，GSHD-L芦丁含量显著升高（176.492 μg·g^-1）（P<0.05），此时期紫花苜蓿品种茎部芦丁含量高于叶部。FL时期，紫花苜蓿茎、叶部芦丁含量达到高峰，‘甘肃’红豆草含量整体下降。PO时期，芦丁含量在不同品种间呈现分化趋势。GN3-L的芦丁含量最高（72.064 μg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）。MT时期，紫花苜蓿叶部芦丁含量呈现回落趋势，但茎部含量上升。‘甘肃’红豆草芦丁含量整体上升（图1）。

2.1.2 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草没食子酸含量

SE时期，各品种的没食子酸含量较低，其中ALF-E-L的没食子酸含量最高（79.993 μg·g^-1），显著高于除GN3-L外的其他品种（P<0.05），此时期叶部没食子酸含量普遍高于茎部。BR时期，没食子酸含量整体呈上升趋势。BU时期，没食子酸含量继续上升，总体趋势仍是叶部含量高于茎部。FL时期，含量大幅上升，在多个品种中达到峰值。PO时期，不同品种的没食子酸含量出现分化趋势，紫花苜蓿各品种茎部没食子酸含量均降低，显著低于叶部（P<0.05）；ALF-E-L（103.503 μg·g^-1）、GN7-L（99.955 μg·g^-1）和GN3-L（98.054 μg·g^-1）含量较高。MT时期，紫花苜蓿各品种没食子酸含量均下降，‘甘肃’红豆草反而升高（图2）。

2.1.3 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草表儿茶素没食子酸酯含量

SE时期，GSHD-L的表儿茶素没食子酸酯含量最高（64.034 μg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05），此时期叶部表儿茶素没食子酸酯含量普遍高于茎部。BR时期，表儿茶素没食子酸酯含量明显上升，部分品种大幅增加，GSHD-S的表儿茶素没食子酸酯含量最高（306.830 μg·g^-1），显著高于所有其他品种（P<0.05）。BU 时期，表儿茶素没食子酸酯含量整体呈下降趋势，但部分品种仍维持较高水平，其中GSHD-S的表儿茶素没食子酸酯含量依然最高（255.308 μg·g^-1），但相比BR时期有所下降（P<0.05）。FL时期，表儿茶素没食子酸酯含量进一步下降。PO时期，表儿茶素没食子酸酯含量在不同品种间出现分化趋势，其中GSHD-S的含量最高（94.692 μg·g^-1），且显著高于其他品种（P<0.05），GN7-L（80.743 μg·g^-1）和GN3-L（78.179 μg·g^-1）的表儿茶素没食子酸酯含量仍然较高。MT时期，表儿茶素没食子酸酯含量整体呈下降趋势（图3）。

2.1.4 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草表儿茶素含量

SE时期，不同品种的表儿茶素含量存在差异。其中，GSHD-L的表儿茶素含量最高（40.306 μg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）；此时期叶部的表儿茶素含量普遍高于茎部。BR时期，各品种表儿茶素含量相比SE时期普遍上升；GSHD-L依然最高（55.075 μg·g^-1），其次是GSHD-S（36.782 μg·g^-1），二者均显著高于其他品种（P<0.05）。BU时期，表儿茶素含量在部分品种中进一步上升。FL时期，表儿茶素含量普遍上升。PO时期，GSHD-L（171.392 μg·g^-1）达到峰值，显著高于所有其他品种（P<0.05）。MT时期，表儿茶素含量整体呈下降趋势（图4）。

2.1.5 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草儿茶素含量

SE时期，GSHD-S儿茶素含量最高（54.295 μg·g^-1），显著高于除ALF-E-L外的其他品种所有部位（P<0.05）。BR时期，儿茶素含量整体上升，GN3-S含量最高（69.537 μg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）。BU时期，儿茶素含量明显上升，GN7-L（116.807 μg·g^-1）最高，ALF-E-L和GSHD-L次之，三者显著高于其他品种其他部位（P<0.05），该时期叶部儿茶素积累远高于茎部。FL时期，紫花苜蓿各品种叶部儿茶素含量降低，茎部含量增加，红豆草茎、叶部位含量均增加。PO时期，紫花苜蓿各品种茎部儿茶素含量降低，叶部含量增加；红豆草茎、叶部位含量均降低；GN3-L（92.371 μg·g^-1）最高，显著高于其他品种（P<0.05）。MT时期，儿茶素含量再次升高，GSHD-L（183.185 μg·g^-1）最高，显著高于紫花苜蓿（P<0.05）（图5）。

2.2 不同生长期紫花苜蓿品种和‘甘肃’红豆草总酚、总黄酮、缩合单宁含量动态分析

2.2.1 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草总酚含量

SE时期，GSHD-L总酚含量最高（24.943 mg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）；其次为 GN7-L （10.783 mg·g^-1） 和GN3-L （8.640 mg·g^-1）。BR时期，总酚含量整体下降。BU时期，紫花苜蓿总酚含量整体下降，红豆草含量升高。FL时期，总酚含量开始回升，GSHD-L接近SE期 （24.624 mg·g^-1）；GN3-L （12.738 mg·g^-1） 和GN7-L （12.363 mg·g^-1）较高。PO时期，总酚含量继续上升。MT时期，总酚含量整体上升，GSHD-L最高（28.732 mg·g^-1），显著高于其他品种所有部位（P<0.05）；GN3-L （16.420 mg·g^-1） 和 GN7-L （14.566 mg·g^-1）较高；整体表现为叶部总酚含量高于茎部（图6）。

2.2.2 基于不同生长期紫花苜蓿品种、‘甘肃’红豆草总黄酮含量动态分析

SE时期，GSHD-L组分的总黄酮含量最高（12.485 mg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）。BR时期，总黄酮含量整体下降，GSHD-L仍为最高（7.767 mg·g^-1）（P<0.05）；紫花苜蓿各品种中ALF-E-L （1.312 mg·g^-1）较高。BU时期，总黄酮含量略有回升，但仍低于SE时期，GSHD-L为最高（10.479 mg·g^-1）。FL时期，紫花苜蓿总黄酮含量开始回升，GSHD-L有所下降，但仍为最高（7.682 mg·g^-1）；GN3-L（1.789 mg·g^-1）和GN7-L（1.654 mg·g^-1）较高。PO时期，总黄酮含量进一步上升。MT时期，总黄酮含量整体达到升高，GSHD-L仍为最高（7.460 mg·g^-1）。紫花苜蓿各品种中ALF-E-L （3.936 mg·g^-1）较高，整体表现为叶部总酚含量高于茎部（图7）。

2.2.3 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草缩合单宁含量

SE时期，GSHD-L组分含量最高（1.471 mg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）。BR时期，GSHD-L缩合单宁含量（5.760 mg·g^-1）迅速上升，显著高于其他品种（P<0.05）。GN7-L（0.846 mg·g^-1）和ALF-E-L （0.761 mg·g^-1）次之。BU时期，缩合单宁含量略有回升。FL时期，紫花苜蓿各品种叶部缩合单宁含量上升，红豆草整体缩合单宁含量下降。PO时期，各品种缩合单宁含量整体升高。MT时期，各品种茎部缩合单宁含量上升，叶部缩合单宁含量降低，GSHD-L为最高（4.821 mg·g^-1），显著高于其他品种（P<0.05）；GN3-L（1.741 mg·g^-1）和GN7-L（1.312 mg·g^-1）较高。整体表现为叶部总酚含量高于茎部（图8）。

2.3 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草4CL、ANR、C4H、LAR和 PAL 酶活性动态

GSHD-L在现蕾期的 4CL、ANR、C4H、LAR和PAL活性均高于分枝期（P<0.05），说明此阶段黄酮生物合成最活跃，可能是关键积累时期。GN3-L品种在结荚期4CL、ANR、C4H、LAR和PAL活性均显著高于开花期，但均显著低于GSHD-L（P<0.05），说明不同品种对酶活性的调控机制可能不同（图9）。

2.4 主成分分析（PCA）

2.4.1 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草茎部酚类和黄酮类化合物含量分析

紫花苜蓿（ALF-E-S、GN3-S、GN7-S）和‘甘肃’红豆草（GSHD-S）的数据点聚集区域存在明显分离，‘甘肃’红豆草的数据点更靠近儿茶素、缩合单宁和总酚的负载向量，说明其在这些物质的积累上更具有优势。紫花苜蓿样本点主要集中在图的中心区域，且与其他样本点有一定重叠，显示其代谢物积累较为多样，难以通过某一特定代谢物显著区分。缩合单宁、儿茶素和总酚的负载向量较长，并指向‘甘肃’红豆草的样本点，说明这些代谢物对PC1（40.1%）的贡献较大，可以作为物种间区分的主要标志。没食子酸和表儿茶素没食子酸酯的负载向量较短，贡献相对较小，与紫花苜蓿样本点较为接近，难以作为明显的物种区分指标（图10）。

2.4.2 不同生长期紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草叶部酚类和黄酮类化合物含量分析

‘甘肃’红豆草样本点在PC1的正向轴上有明显的分布特征，主要靠近儿茶素、缩合单宁、总酚和表儿茶素的负载向量。这表明‘甘肃’红豆草在这些代谢物的积累上有显著优势，可能是其次生代谢调控的重要特征。紫花苜蓿的样本点主要集中在PC1轴的负向区间，与没食子酸和表儿茶素没食子酸酯等代谢物的负载向量较为接近，显示出这类代谢物的积累特征。部分样本点与其他物种重叠，反映其代谢物积累的多样性和交集性。缩合单宁和儿茶素的负载向量较长，说明它们在PC1主成分上的贡献较大，并且在‘甘肃’红豆草中积累较多，是区分物种和处理的关键代谢物。没食子酸和表儿茶素没食子酸酯的负载向量相对较短，贡献相对较小，表现出重叠区域较多，难以作为物种间显著的区分标志（图11）。

2.4.3 紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草酚类和黄酮类化合物及酶活性分析

4CL 的箭头指向与儿茶素、ANR、LAR、芦丁的箭头指向较为一致，呈正相关关系。PAL 的箭头指向与表儿茶素、总黄酮、总酚、表儿茶素没食子酸酯的箭头指向相近，呈正相关关系。C4H 的箭头指向与总黄酮、缩合单宁、总酚的箭头指向相近，呈正相关关系。ANR 和 LAR 的箭头指向与表儿茶素、芦丁相近，呈正相关关系。缩合单宁与总黄酮、总酚、表儿茶素没食子酸酯等方向趋同，呈正相关关系。缩合单宁与儿茶素、表儿茶素的箭头指向呈现出一定程度的趋同性。5个酶（4CL、PAL、C4H、ANR、LAR）的箭头指向与没食子酸的箭头指向相反，表现为负相关关系（图12）。

2.5 紫花苜蓿和‘甘肃’红豆草酚类和黄酮类化合物及酶活性相关性分析

4个样品中，4CL 与芦丁呈正相关，C4H 与表儿茶素没食子酸酯呈负相关，PAL 与没食子酸呈正相关关系。GN3-L-PO、GSHD-L-BU中，LAR 与儿茶素呈正相关，表儿茶素、总酚、ANR 与缩合单宁呈正相关。GN3-L-PO、GN3-L-FL中，儿茶素与缩合单宁呈正相关。GN3-L-PO、GN3-L-FL、GSHD-L-BU中，总黄酮与缩合单宁呈正相关（图13）。

3 讨论

3.1 缩合单宁及其前体物质变化趋势

酚类和黄酮类化合物是苯丙烷代谢途径的重要产物，其含量变化通常与次生代谢产物的积累密切相关^［37］。酚类物质的含量在不同叶组织中变化很大，生理阶段和环境胁迫也会影响酚类物质的组成和含量^［38-39］。本研究发现，‘甘农3号’紫花苜蓿叶部在结荚期总酚和总黄酮含量显著高于开花期，这可能与结荚期植物需要合成更多的次生代谢产物以抵御外界环境压力有关^［40-42］。而‘甘肃’红豆草在现蕾期总黄酮含量表现出显著的积累趋势，而总酚含量在现蕾期与分枝期相近，这一现象可能与现蕾期植物生理活动的变化密切相关^［43］，表明苯丙烷代谢途径在这些时期被强烈激活，总酚和总黄酮的积累为缩合单宁的合成提供了充足的底物^［44］。此外，芦丁的含量也表现出类似的趋势，可能作为缩合单宁合成的前体或中间产物参与了代谢过程。而没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素和儿茶素的含量变化趋势与缩合单宁不一致，表明这些化合物可能通过不同的代谢途径或调控机制参与次生代谢过程。已有研究表明，4CL催化生成的香豆酰CoA 除用于缩合单宁合成外，还可作为前体参与木质素、黄酮醇等物质的合成^［45］；当这些竞争途径在特定时期被激活时，即使 4CL 酶活性升高，表儿茶素、儿茶素的积累仍可能受限^［46］。同时类黄酮物质的合成不仅受基因型的调控，还受多种外部因素的显著影响^［47］。例如，气候变量（如水分^［48］、光照^［49］和温度^［50］）以及栽培管理措施^［51］等环境因子，均会显著影响类黄酮物质的类型、含量及其积累动态。

3.2 前体物质的变化趋势

主成分分析（PCA）结果显示，在叶部样本中，儿茶素、芦丁、表儿茶素等成分与 PC1 呈显著正相关关系，说明这些成分在代谢过程中可能具有一定的协同作用。芦丁可能作为黄酮类化合物的代表，参与苯丙烷代谢途径的调控，与Hou等^［52］的研究一致。缩合单宁的变化趋势与儿茶素密切相关，儿茶素含量增加时，缩合单宁含量也随之增加。表儿茶素可能通过ANR途径（表儿茶素 → 原花青素）参与缩合单宁的合成^［53］。另外，没食子酸和表儿茶素没食子酸酯的箭头方向相反，表明它们在代谢途径中可能处于不同的合成支路，或受到不同的调控机制。在茎部样本中，缩合单宁、表儿茶素、总黄酮、儿茶素、总酚等成分与 PC1 呈显著正相关关系，说明这些成分在茎中的代谢模式具有一定的一致性。与叶部相比，茎部的代谢模式可能更加依赖于某些关键代谢物（如缩合单宁和总黄酮）的积累，这可能与茎部的生理功能（如支撑和运输）密切相关。

3.3 紫花苜蓿与红豆草缩合单宁合成生长期差异及关键酶协同调控机制

PAL催化苯丙氨酸脱氨基形成肉桂酸，是整个苯丙烷代谢途径的起始酶和限速酶^［54］。C4H催化肉桂酸的苯环羟化形成4-香豆酸^［55］。4CL以ATP供能，将CoA通过高能硫酯键与4-香豆酸连接，产物香豆酰CoA作为活化形式参与到后续合成^［56］。ANR催化花青素转化为原花青素^［57］，是缩合单宁合成的关键酶^［58-59］。LAR直接催化无色花色素还原生成儿茶素，是缩合单宁合成的关键单体之一^［60］。这些关键酶的活性变化直接影响缩合单宁及其前体物质的合成，但酶促反应与代谢产物积累之间的关系往往受到多种因素调控。从代谢物测定数据来看，‘甘农3号’紫花苜蓿在结荚期叶部缩合单宁含量最高，而‘甘肃’红豆草在现蕾期叶部缩合单宁含量最高，这与刘秀丽等^［19］、Wang 等^［61］及Rufino-Moya等^［10］的研究一致，进一步证实紫花苜蓿与红豆草在缩合单宁合成过程中，存在“关键积累时期不同”与“叶部含量高于茎部”的特异性积累，这为解析本研究中缩合单宁合成与关键酶活性的动态关联提供了基础数据支撑。‘甘农3号’紫花苜蓿在结荚期PAL、ANR、C4H、LAR及4CL酶活性显著高于开花期，而‘甘肃’红豆草在现蕾期也表现出较高的PAL、ANR、C4H、LAR和4CL酶活性，表明苯丙烷代谢途径在这些时期被激活，从而为缩合单宁的合成提供了充足的前体物质。C4H 主要靠近总黄酮、总酚、缩合单宁等代谢物，说明它可能影响苯丙烷代谢途径的多个下游产物，与Jia等^［62］的研究一致。PAL、C4H、4CL、ANR、LAR酶活性同步升高，表明单宁合成并非依赖单一酶调控。

4 结论

不同生长期中，叶部缩合单宁、总酚和总黄酮含量普遍高于茎部。‘甘农3号’紫花苜蓿在结荚期叶部缩合单宁含量最高，而‘甘肃’红豆草在现蕾期叶部缩合单宁含量最高。紫花苜蓿没食子酸及其衍生物（如表儿茶素没食子酸酯）的含量相对较高，与这些物质显著相关的代谢物主要是表儿茶素和儿茶素。PCA分析进一步揭示，‘甘肃’红豆草的缩合单宁、表儿茶素及总黄酮积累水平较高，并与PAL、C4H、4CL、LAR和ANR酶活性相关性较强。因此，调控PAL、C4H、4CL、LAR和ANR酶活性可能是提高紫花苜蓿缩合单宁合成的有效途径。

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基金资助

农业生物育种国家科技重大专项(2022ZD0401102)

甘肃省高校研究生“创新之星”项目(2025CXZX-838)