基于BSA技术的稗属牧草抽穗期QTL定位及候选基因分析

QTL mapping and analysis candidate genes for heading stage in Echinochloa based on bulked segregant analysis

摘要

抽穗期是影响作物产量形成和环境适应性的关键阶段，解析其分子调控机制对牧草种质资源创新和新品种培育具有重要意义。很多稗属植物是优良的耐盐碱牧草，然而目前稗属牧草抽穗期的分子调控机制尚不明确，制约了不同生态区适生品种的分子设计育种和盐碱地的可持续利用。为了系统解析稗草抽穗期的遗传调控网络，本研究以稗的基因组作为参考基因组，采用BSA-Seq（bulked segregant analysis sequencing）技术对湖南稷子和宁夏无芒稗及其杂交F_2：3群体（共62份样本）进行分析。基于R 4.2.2，采用Index算法定位抽穗期相关QTL（quantitative trait locus），通过String数据库构建蛋白质互作网络筛选候选基因，并利用GO和KEGG数据库对候选基因进行功能注释。研究结果表明：共鉴定出11347个SNP和1992个Indel有效变异位点；定位到两个候选QTL：qHD-16-1（193.14 kb，包含17个基因）和qHD-6-1（11.05 kb，包含2个基因）；筛选出EcRCS3、EcCYSK（错义突变）、EcP0710H01.9、EcAPG、EcCFAT、EcNBA1共6个关键候选基因。功能注释表明，这些基因主要通过调控硫代谢、半胱氨酸和蛋氨酸等代谢途径影响开花基因表达或直接影响花芽分化，从而调控稗草的抽穗期。本研究为稗草分子标记辅助育种提供了重要的基因资源和潜在的分子靶点，并为盐碱地适生牧草品种的精准选育奠定了理论基础，具有重要的科学价值和应用前景。

Abstract

Heading date is a crucial agronomic trait that significantly influences crop yield formation and environmental adaptability. Elucidating the molecular regulatory mechanisms of heading date is essential for forage germplasm innovation and for breeding new varieties. Echinochloa species （barnyard grass） are ideal forage resources for marginal land utilization because of their remarkable salt-alkali tolerance. However， the molecular mechanisms underlying the regulation of heading date in Echinochloa remain unclear. This knowledge gap substantially constrains molecular breeding of ecologically adapted varieties and the agricultural development of areas with saline-alkali soils. To decipher the genetic regulatory network controlling heading date in barnyard grass， we employed bulked segregant analysis sequencing （BSA-Seq） to analyze Echinochloa crusgalli var. frumentacea， Echinochloa crusgalli var. mitis， and their F_2∶3 hybrid population （62 samples in total）， using the Echinochloa genome as a reference. Then， quantitative trait locus （QTL） mapping was performed using the Index algorithm in R 4.2.2， and a protein-protein interaction network was constructed using the String database to identify candidate genes. Functional annotation of these genes was conducted using the Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes databases. A total of 11347 single nucleotide polymorphisms and 1992 insertion/deletion mutations were identified as effective variants. Two candidate QTLs were mapped： qHD-16-1 （193.14 kb， containing 17 genes） and qHD-6-1 （11.05 kb， containing two genes）. Six key candidate genes ［EcRCS3， EcCYSK （missense mutation）， EcP0710H01.9， EcAPG， EcCFAT， and EcNBA1］ were identified. Functional annotation revealed that these genes regulate heading date primarily by modulating sulfur， cysteine， and methionine metabolic pathways， thereby influencing the expression of flowering-related genes and flower bud differentiation. This study provides valuable genetic resources and potential molecular targets for molecular marker-assisted breeding and offers critical insights into the molecular mechanisms underlying the regulation of heading date in barnyard grass （Echinochloa spp.）. These findings establish a theoretical foundation for precision breeding of saline-alkali-adapted forage varieties， demonstrating significant scientific merit and promising application prospects for the utilization of saline-alkali land.

Graphical abstract

关键词

稗属牧草 / 抽穗期 / BSA-Seq / QTL定位 / 候选基因分析

Key words

Echinochloa / heading stage / BSA-seq / QTL mapping / candidate genes analysis

土壤盐碱化是制约我国西北内陆干旱半干旱地区可持续发展的关键环境因素，科学改良和合理利用盐碱地资源，不仅关乎旱区农业生产的可持续性和农村经济的稳定发展，更是实现国土空间优化治理和生态系统功能提升的重要途径。稗属（Echinochloa spp.）牧草是一类繁殖力强、生态适应范围广的1年或多年生禾本科（Gramineae）自花授粉植物^［1］。稗属牧草具显著抗旱和耐盐碱生理特性，兼具有较高的饲用价值，其茎秆及籽粒含有丰富的营养，并且可多次刈割利用，是亚洲地区的主要粮饲作物^［2］。王玉兰等^［3］研究表明，种植在宁夏地区盐碱地的湖南稷子（Echinochloa crusgalli var. frumentacea）在大旱季节仍能保持较高的种子产量及草产量，是改良和利用盐碱地的优质草种。

抽穗期作为植物从营养生长向生殖生长转变的关键发育阶段，直接决定着作物的种子产量、生物量积累和生态适应性^［4］。抽穗期的精准调控是植物完成生活史和保证繁殖成功的重要生物学基础，更是作物遗传改良的核心研究内容。在模式植物和主要农作物中，抽穗期调控网络研究已取得重要突破。如在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已鉴定出306个开花相关基因（flowering interactive，http：//www.flor-id.org），其中，LFY （Leafy）、CO （Constans）、FT （Flowering locus t）、SOC1 （Suppressor of overexpression of constans 1）是核心调控基因。水稻（Oryza sativa）的研究更为深入，共定位734个抽穗期相关基因和数量性状位点（quantitative trait locus， QTL）（http：//archive.gramene.org/qtl/），并阐明以Hd1 （Heading date 1）-Ehd1 （Early heading date 1）-Hd3a （Heading Date 3a）和Ghd7 （Griains height date 7）为核心的光周期响应通路。在小麦（Triticum aestivum）中则发现了春化途径的Vrn （Vernalization）基因家族（Vrn-1至Vrn-4）^［5］和光周期响应的Ppd-1 （Photoperiod-1）基因系列（Ppd-A1/B1/D1）^［6-7］等。在青稞（Hordeum vulgare）中鉴定到早抽穗主效QTL cqHD2H-2及其候选基因 HORVU2Hr1G087460 （HvNF-YB3）^［8］。相比之下，稗属植物抽穗期分子调控机制研究明显滞后。解析其遗传调控网络，不仅可完善C₄植物发育生物学理论，更能为培育广适性稗草品种提供分子靶点，对推动盐碱地改良和饲草产业发展具有重要实践价值。

集群分离分析法（bulked segregant analysis， BSA）是由Michelmore等^［9］在1991年提出，其原理为选择目标性状差异显著的亲本杂交创建子代分离群体，从子代分离群体中选取极端表型个体（各30~50株），等量混合DNA构建双亲本和双极端混池，采用Illumina平台进行全基因组测序，最后通过单核苷酸多态性指数法（single nucleotide polymorphism-index， SNP-index）、欧氏距离（euclidean distance， ED）和G'-value等算法识别关联区间^［10］。相比传统QTL定位，BSA-Seq可在短的周期内，低成本和高精度地定位QTL。因此，BSA-Seq技术目前已被广泛应用于多种作物农艺性状相关QTL或基因的定位中，如Takagi等^［11］用BSA-Seq技术鉴定出水稻耐盐候选基因OsRR22，并在2年内培育出了耐盐水稻新品种。Gao等^［12］基于BSA-Seq定位到分布在谷子（Setaria italica）1号和4号染色体上的3个株高相关QTL（包含9个候选基因）。赵卫国等^［13］利用BSA-Seq在油菜（Brassica napus）A06染色体上定位到5个矮秆性状相关基因BnaA06g27050D、BnaA06g34100D、BnaA06g34810D、BnaA06g35080D和BnaA06g36480D。

稗属牧草作为典型的短日照植物，其生长发育表现出显著的光周期依赖性。当播种期不合适或引种地理跨度过大时，稗草植株会出现抽穗期紊乱现象，表现为过早、过晚抽穗甚至不抽穗。过早抽穗将导致株高降低、生物产量减少和饲用品质下降，而抽穗延迟则会引起结实率下降、籽粒不饱满及种子产量降低，严重时可导致生殖生长完全停滞。这一光周期敏感性严重限制了稗属牧草品种的跨地区推广应用，成为制约盐碱地生物改良和农牧产业可持续发展的关键瓶颈因素。尽管Wu等^［14］通过系统发育学和比较基因组学研究，已鉴定出稗属植物的FT、Hd1、Ehd1等13个开花相关基因，但对主效基因的深入挖掘及其上下游调控网络的系统解析仍然欠缺。现有关于稗草的研究主要集中于种质资源调查、系统进化分类及抗逆性评价等领域^［2］，在优良基因资源开发利用方面研究较为薄弱，特别是关于抽穗期分子调控机制的研究尤为匮乏。

基于此，本研究采用BSA-Seq技术，选用抽穗期差异显著的湖南稷子（E. crusgalli var. frumentacea）和宁夏无芒稗（Echinochloa crusgalli var. mitis）作为亲本开展杂交育种，构建F_2：3分离群体。从F_2：3群体中挑选极端早抽穗和晚抽穗单株各30株，连同2个亲本进行DNA提取和建库，利用Illumina NovaSeqTM平台开展高通量测序。通过全基因组测序（whole genome sequencing， WGS）技术开发全基因组范围内的SNP和Indel变异标记，采用ΔSNP-index和ΔIndel-index方法定位与抽穗期性状关联的基因组区域，筛选候选区域和候选基因并进行功能注释。本研究旨在阐明稗属牧草抽穗期的遗传调控基础，为培育具不同发育特性（早熟、中熟、晚熟）的稗草新品种提供科学依据和技术支撑，从而满足不同生态区的生产需求，推动盐碱地资源的可持续利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用的母本‘海子1号’湖南稷子是由宁夏草原站万力生研究员于1987年培育成功的牧草品种，该品种已通过全国牧草及饲料作物品种审定委员会审定并获得农业部品种登记^［15］。‘海子1号’湖南稷子株高190~220 cm，叶宽3.00~3.50 cm，具有优良的抗倒伏特性，生育期150 d左右。父本材料宁夏无芒稗为禾本科稗属1年生植物，是吴素琴研究团队通过长期栽培驯化野生种质获得的地方品种^［16］。其株高170~200 cm，叶宽2.50~2.90 cm，生育期120 d左右。经细胞学鉴定，两个亲本均为自花授粉的六倍体植物（2n=6x=54）。本课题组于2020年选用晚抽穗型湖南稷子（母本）与早抽穗型宁夏无芒稗（父本）进行杂交试验。为克服双亲花期不遇的问题，采用分期播种方案，母本采用常规单次播种，父本采用分期播种（每周播种一批次），最终获得F₁代种子295粒。2022年在宁夏回族自治区平罗县高庄乡试验基地进行F₁代种子的大田扩繁，获得F₂群体。同年秋季，根据F₂群体在抽穗期和穗部性状表现出的明显分离现象，选取偏母、偏父及中间型植株穗子各50穗，共150穗，创建F_2：3群体。

1.2 试验方法

1.2.1 大田试验

于2023年4月15日采用条播方式进行田间播种，按单穗单行方式构建穗行圃（单粒传法），设置行距60 cm，行长3 m，过道宽度2 m，总种植面积1400 m²。在拔节期及孕穗期分别追施尿素1次，每次施肥量为199.50 kg·hm^-2（折合纯氮91.80 kg·hm^-2）。在分蘖期、拔节期、孕穗期各进行1次灌溉，共计3次，灌水定额为1200 m³·hm^-2。其余田间管理均按照常规大田栽培规范执行。

1.2.2 性状调查与记录

当植株主穗穗尖突破剑叶叶鞘且外露长度≥1 cm时，判定为该单株进入抽穗期，并记录具体日期。田间首个抽穗植株出现后，每隔2~4 d调查1次。将各株系从播种到抽穗的时间作为该株系的抽穗期表型值，采用Tukey法识别并剔除异常值，以株系内有效观测单株的抽穗期算术均值作为该株系的抽穗期表型值^［17］。

1.2.3 材料处理与全基因组测序分析流程

基于F_2：3群体抽穗期表型鉴定结果，分别选取极端早抽穗和晚抽穗单株各30株，连同双亲材料（湖南稷子和宁夏无芒稗），采集幼嫩叶片样本。样品经锡箔纸包裹后立即放入液氮中速冻，并送至上海美吉生物医药科技有限公司进行建库和测序分析。采用改良CTAB法^［18］提取叶片基因组DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性和污染情况，使用NanoDrop（ND-2000）技术检测DNA浓度及纯度，筛选合格样本（OD_260/280为1.8~2.0，OD_260/230≥2.0）构建测序文库。样品检测合格后，将30株早抽穗的DNA等量混合成早抽穗混合池，30株晚抽穗的等量混合成晚抽穗混合池。利用DNA超声波破碎仪（Covaris M220， 美国）将2个混合池和2个亲本的DNA片段化至350 bp，经末端修复、加A尾和接头连接等步骤完成文库构建。采用Illumina NovaSeq ^TM 平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，测序深度为：亲本12.39×，子代34.12×。对测序所得到的原始数据进行Fastp^［19］质控，去除接头和低质量序列，将过滤得到的Clean reads通过BWA软件的MEM2方法^［20］比对至稗参考基因组上（基因组信息：Echinochloa crusgalli，1278.6 Mb，网址：https：//plants.ensembl.org/Echinochloa_crusgalli/Info/Index）。比对结果经Picard软件的MKDUP功能去除重复，利用GATK^［21］的Best practices流程处理比对结果（BAM文件），利用GATK的Haplotyper方法进行变异SNP和Indel的开发，过滤条件按照GATK推荐的参数进行（https：//software.broadinstitute.org/gatk/documentation/article.php？id=3225），使用SnpEff软件^［22］结合参考基因组信息对所有的变异位点进行基因功能预测，并对变异位点功能进行注释。

1.2.4 候选基因筛选及功能注释

基于基因分型的结果，筛选亲本间纯合差异的多态性位点。以亲本互为参照，以公式（1）~（3）为基础用R 4.2.2计算2个子代混合池变异位点的SNP-index和Indel-index，以所有SNP-index和Indel-index的平均值作为该窗口的SNP-index和Indel-index。计算2个混池间SNP-index和Indel-index差，即为ΔIndel-index和ΔSNP-index^［23-24］。为了降低单一变异位点带来的随机波动，采用滑窗（默认设置：1 Mb窗口，10 kb步长）和loess拟合2种方法对ΔSNP-index和ΔIndel-index值进行降噪处理。为了提高分析准确性，对滑窗结果均使用bootstrap法，针对不同位点深度和混池大小随机抽样0.005次，之后以阈值P≤0.995作为阈值线。对于loess拟合则采用1000000分位数作为阈值线，选取阈值线之上变异位点作为候选区间。基于String数据库，对采用上述2种方法确定的QTL内基因进行蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks， PPI）分析筛选候选基因，利用R/clusterProfile 3.16软件对候选基因进行GO和KEGG数据库注释，并对其进行功能预测。

Inde{x}_{Wild}=\frac{De{p}_W}{De{p}_M+De{p}_W}（1）

Inde{x}_{Mut}=\frac{De{p}_M}{De{p}_M+De{p}_W}（2）

\mathrm{\Delta }Index=Inde{x}_{Mut}-Inde{x}_{Wild}（3）

式中：Dep_M 和Dep_W 分别为突变型和野生型的等位基因在突变池与野生池中的Reads数目。

2 结果与分析

2.1 稗属牧草抽穗期的表型特征

对亲本及F_2：3群体的抽穗期性状进行统计分析（表1和图1）可知，亲本抽穗期处于F_2：3群体范围内，抽穗期在双亲之间差异显著（P<0.05）。F_2：3群体的抽穗期具有超亲分离现象，平均为94.00 d，变异范围为66.00~130.00 d，变异系数（coefficient of variation， CV）为20.39%。通过数据正态分布的适合性检验发现，抽穗期的偏度为0，峰度绝对值小于2，说明性状的表型符合正态分布，具有典型的数量性状遗传特征。

2.2 测序质量评估

由表2可知，用高通量测序技术对检测合格的亲本及子代混合池共4个样本进行全基因组测序，平均测序深度父母本在（11.58×）~（13.20×）间，子代混池则在（33.81×）~（34.42×）间，共获得120.46 G原始测序数据，经过数据过滤后，最终得到116.99 G高质量的Clean reads数据。GC含量为45.73%~48.35%，GC分布正常，Q₃₀≥94.82%，测序数据质量较高。

使用BWA软件将Clean reads比对到稗的参考基因组。4个样本的比对率介于98.97%~99.75%，数据比对率高。在不同染色体区域的覆盖度和测序深度分布情况上，1×覆盖率百分比父母本超过91.57%，子代混池超过93.69%，4×覆盖率百分比父母本超过81.55%，子代混池超过91.35%。参考基因组被均匀覆盖，随机性良好。

2.3 SNP和Indel的检测和注释

根据检测和注释结果进行SNP和Indel变异位点统计分析（表3）。4个样本中SNP和Indel变异位点数量均表现为宁夏无芒稗最少，分别为2610012和429336个，早抽穗混合池数量最多，分别为2829785和489104个。4个样本间，同一类型的SNP和Indel数量比例大致相当。SNP和Indel变异位置信息均主要包括7种类型。其中，大部分SNP和Indel位于基因区间，而非编码转录突变、外显子缺失突变和终止子编码突变类型的Indel和SNP较少。

2.4 候选区域的定位与分析

以亲本基因型为参照，对所获变异位点再一次进行过滤，过滤去除非二态性（有多种基因型）的变异位点，筛选2个亲本间纯合差异的遗传标记，过滤后获得SNP 11347个，Indel 1992个，基因4254个（图2）。

对经过亲本标记过滤的子代变异位点用Index方法计算2个子代混池的ΔSNP-index和ΔIndel-index，再用Index-slid和Index-loess两种算法进行关联分析。基于滑窗的SNP-index在16号染色体上定位了1个长度为0.19 Mb（2296912~2490050 bp）的区域。基于loess拟合的SNP-index在6号染色体上定位到1个长度为9.9 Mb（6914689~16813256 bp）的区域（图3）。

基于滑窗的Indel-index共获得 11个与性状相关的候选区域，分布在1、2、4、13、14、16、17、26、6、7、8号染色体上。基于loess拟合的Indel-index共获得7个与性状相关的候选区域，分布在2、6、7、21、24、26、4号染色体上（图4和表4）。

结合两种方法，在6号染色体上，loess拟合的Indel-index与SNP-index共同定位到9.9 Mb（6914689~16813256 bp）包含944个基因的qHD-6-2，滑窗的Indel-index与SNP-index共同定位到11.05 kb（16802203~16813256 bp）包含2个基因的qHD-6-1。其中qHD-6-2包含qHD-6-1，因此推测qHD-6-1为候选QTL。在16号染色体上，loess拟合和滑窗的Indel-index与SNP-index共同定位到193.14 kb（2296912~2490050 bp）包含17个基因的qHD-16-1，确定其为候选QTL。

2.5 候选基因的筛选与功能注释

对qHD-6-1和qHD-16-1的共19个基因进行GO、KEGG富集分析，并按P_adjust排序对前20个GO和KEGG注释信息进行重点分析。其中GO数据库分别从细胞组分、分子功能、生物学过程3个方向对基因进行分类注释。19个基因中有14个富集在GO数据库的89个term中，包括75个生物学过程，6个细胞组分和8个分子功能。前20个功能组包括18个生物学过程、2个分子功能；在生物学过程中，这些基因主要参与代谢、生物合成等生物学过程；在分子功能中，这些基因主要参与结合、催化活性等功能。在KEGG数据库中，有4个基因富集在硫代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，色氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，柠檬酸循环（TCA循环），缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，赖氨酸降解，丙酮酸代谢，同源重组，糖酵解/糖异生和丙酸代谢通路中（图5）。

数量表型性状一般由多个基因联合调控，进一步对2个QTL中的19个基因进行PPI分析表明（图6），EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9和EcCFAT基因间存在蛋白互作，EcAPG和EcNBA1基因间存在蛋白互作。以此，将EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9、EcAPG、EcCFAT、EcNBA1共6个基因推测为控制稗属牧草抽穗期的候选基因，其中EcCYSK为非同义突变基因（表5）。进一步对这6个基因进行KEGG富集分析（图7），结果显示，EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9参与硫代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，EcNBA1参与同源重组代谢通路。

3 讨论

传统作物育种方法存在周期长、效率低等局限性，随着高通量测序技术的快速发展，分子标记辅助育种（molecular marker assisted breeding， MAS）技术通过实现目标性状的精准选择，显著提高了育种效率^［10］。稗属牧草作为干旱半干旱地区农牧业生产的重要饲草资源，其品种改良对保障区域粮饲安全具有战略意义^［3］。因此，解析稗属牧草抽穗期的分子遗传机制，对利用MAS技术培育具有优良农艺性状的新品种具有重要的理论价值和实践意义^［25］。

本研究采用BSA-Seq技术，在16和6号染色体上成功定位到3个与稗草抽穗期相关QTL，并将其中193.14 kb（2296912~2490050 bp）包含17个基因的qHD-16-1和11.05 kb（16802203~16813256 bp）包含2个基因的qHD-6-1推测为候选QTL。数量表型性状一般是由多个基因协同调控，本研究对2个QTL中的19个候选基因进行了蛋白质互作网络分析（图6），结果表明EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9和EcCFAT基因之间存在蛋白互作关系，EcAPG和EcNBA1基因之间也存在明显互作。通过功能注释分析（表5），最终筛选出6个调控稗属牧草抽穗期的关键候选基因：EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9、EcAPG、EcCFAT、EcNBA1。这6个基因的功能分别为半胱氨酸合酶（EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9）、GDSL酯酶/脂肪酶（EcAPG）、松柏醇酰基转移酶（EcCFAT）、BRISC复合体（EcNBA1）（表5），其中EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9参与硫代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，EcNBA1参与同源重组代谢通路（图7）。

植物抽穗是一个复杂的生理生化过程，需要有足够的能量物质供应，同时受内源激素的精确调控。在氨基酸代谢通路中，半胱氨酸和蛋氨酸作为关键代谢物，通过参与植物的生理代谢和信号转导过程，不仅调控花芽分化和开花时间，还影响花粉发育和质量^［26］。Wang等^［27］对不同生育期水稻的根、茎、叶、花蕾等器官的非编码转录组（lincRNAs）进行研究表明，编码半胱氨酸合成酶的RCS3基因在水稻的花蕾和花朵中特异性高表达，而编码半胱氨酸合成酶的另一个P0710H01.9基因则在花期的花蕾、根和叶部位呈差异表达模式。Huang等^［28］对活性氧（reactive oxygen species， ROS）激发蛋白质相分离控制干细胞命运的研究进一步揭示了半胱氨酸通过氧化形成二硫键，促进TMF（terminating flower）蛋白质相分离，进而调控花原基分化基因AN（Anatha）的表达，从而精准调控番茄（Solanum lycopersicum）的茎尖分生组织的成熟和开花，这一机制为理解开花调控提供了新的视角。在含硫氨基酸代谢网络中，半胱氨酸和蛋氨酸可相互转化^［29-31］。蛋氨酸是多胺和乙烯生物合成的重要前体物质^［32］。多胺作为调节植物生长和发育的“第二信使”，能直接激活开花相关基因的表达，促进花芽形成、性别分化、雌雄蕊发育等生殖生长过程^［33］。乙烯作为植物重要的内源激素，通过乙烯受体ETR（ethylene receptor）家族→CTR（constitutive triple response）家族→EIN2（Ethylene insensitive 2）→EIN3（Ethylene insensitive 3）/EILs（Ethylene insensitive 3-like1）→ERF（ethylene response factor）→乙烯反应相关基因表达^［34］，调控植物生长发育的多个环节^［35］。近年研究发现，乙烯信号通路通过多层次的分子机制调控植物开花时间。Xu等^［36］在拟南芥中的研究表明，乙烯信号转导关键因子EIN3及其同源蛋白EIL1能够特异性地与组蛋白去甲基化酶FLD（flowering locus d）相互作用，通过表观遗传调控方式抑制FLC（Flowering locus c）基因的表达，从而促进开花进程。这一发现揭示了乙烯信号与表观遗传调控的交叉作用机制。与此同时，Chen等^［37］的研究则发现乙烯响应因子ERF1（ethylene response factor 1）可直接结合FT（Flowering locus t）基因启动子区域，抑制其转录活性，导致开花延迟。这两项研究共同阐明了乙烯信号通路在开花时间调控中的双重作用机制。在生殖发育的细胞学层面，同源重组作为减数分裂的核心生物学过程，通过确保染色体精确分离和遗传物质稳定传递，对植物抽穗和结实等生殖生长过程具有决定性作用^［38-39］。最新研究表明，这一过程与植物内源激素网络存在复杂的互作关系。例如，赤霉素等植物激素能够特异性调节同源重组相关基因的表达，进而影响植物的生长发育和抽穗过程^［40］。这种激素-减数分裂协同调控机制为深入理解植物抽穗的分子基础提供了新的研究方向。

本研究鉴定出的关键候选基因在稗属牧草抽穗期调控中展现出多种生物学功能。其中，EcRCS3、EcCYSK和EcP0710H01.9基因主要参与氨基酸代谢途径，在抽穗前期的特定发育阶段调控开花相关基因的表达网络，影响关键调控蛋白的合成与修饰，从而促进花芽分化的启动。而EcNBA1基因通过维持基因组稳定性（DNA损伤修复）和整合植物激素信号转导途径，在抽穗进程中发挥重要的调控作用。这些发现为阐明稗草抽穗期的分子调控网络提供了重要的理论依据和实践指导。

尽管已有研究证实EcRCS3和EcP0710H01.9在水稻中的同源基因参与抽穗期调控，但其他候选基因在植物开花时间调控中的具体功能仍缺乏直接证据。基于此，将来应开展以下研究：首先，通过全转录组测序（RNA-Seq）分析候选基因的时空表达特征；其次，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建功能缺失突变体进行表型验证；再次，利用酵母双杂交系统解析候选基因编码蛋白的相互作用网络；最后，通过荧光蛋白标记技术确定其亚细胞定位特征。这一系统的研究将有助于全面解析稗属植物抽穗期的分子调控机制，不仅可为禾本科植物开花时间的进化研究提供新视角，也将为稗属牧草的分子设计育种奠定重要的理论基础。

4 结论

1）抽穗期性状分析表明，双亲间存在显著差异（P<0.05），亲本表型值位于F_2：3群体分布区间内，该杂交群体出现明显的超亲分离现象。

2）通过BSA-Seq分析，在稗草基因组中共定位到3个与抽穗期显著相关的QTL区间，分别为qHD-6-2，位于6号染色体6.91~16.81 Mb区间，跨度9.9 Mb，包含944个候选基因；qHD-6-1，位于6号染色体16.80~16.81 Mb区间，跨度11.05 kb，包含2个候选基因；qHD-16-1，位于16号染色体2.30~2.49 Mb区间，跨度193.14 kb，包含17个候选基因。

3）候选QTL筛选结果为：将qHD-16-1（16号染色体，2.30~2.49 Mb）确定为候选区间，qHD-6-1（6号染色体，16.80~16.81 Mb）推测为候选区间。

4）通过PPI分析，从上述两个QTL区间的19个候选基因中筛选出6个关键候选基因EcRCS3、EcCYSK、EcP0710H01.9、EcAPG、EcCFAT和EcNBA1，其中EcCYSK存在错义突变。GO/KEGG富集分析表明，这些基因主要参与硫代谢、氨基酸代谢通路（半胱氨酸和蛋氨酸代谢），DNA损伤修复途径（同源重组）。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2024AAC03133)