旱生植物霸王ZxCER6的基因克隆及功能分析

Cloning and functional analysis of ZxCER6 from the xerophyte Zygophyllum xanthoxylum

摘要

角质层蜡质在旱生植物霸王抵御不良生境中发挥着重要作用。β-酮脂酰辅酶A合成酶（KCS）是催化蜡质前体物质合成的关键酶。本研究克隆得到霸王ZxKCS6/CER6的cDNA全长1548 bp，具有2个决定底物选择性的高度保守跨膜区和3个酶催化位点，属于缩合酶超家族成员。与其他高等植物同源蛋白的氨基酸序列比对发现，ZxCER6属于KCS家族中CER6亚家族，具有第224位的半胱氨酸高度保守激活位点。系统进化树分析发现，ZxCER6与拟南芥AtCER6的亲缘关系最近。表达模式分析表明，ZxCER6主要在地上部组织中表达，尤其在叶表皮中表达丰度最高；且受50 mmol·L^-1 NaCl处理的强烈诱导，其表达丰度在36 h时达到峰值。利用表皮特异性启动子驱动ZxCER6在拟南芥中表达发现，干旱处理后转基因拟南芥的地上部干鲜重、叶绿素含量、净光合速率和水分利用效率均显著高于野生型，而离体叶片失水率、叶绿素浸出率和叶片相对质膜透性均低于野生型；转基因植株地上部角质层蜡质含量，尤其是烷烃含量显著增加。表明ZxCER6的超表达可增加转基因植株表皮中烷烃的含量，减少水分散失，从而提高其抗旱性。本研究初步揭示了ZxCER6介导的蜡质积累在荒漠植物霸王抗旱性中的作用，为优良牧草及农作物抗旱性的遗传改良提供了优异的基因资源。

Abstract

Cuticular wax plays an important role in resistance to environmental stresses in the xerophyte Zygophyllum xanthoxylum. β-ketoacyl-CoA synthase （KCS） is the key enzyme catalyzing the synthesis of wax precursors. In this study， the full-length cDNA of ZxKCS6/CER6 was cloned. The 1548-bp sequence encoded a polypeptide with two highly conserved transmembrane regions that determine substrate selectivity and three enzyme catalytic sites， and it belongs to the condensation enzyme superfamily. Comparison with homologous protein sequences of other higher plants revealed that ZxCER6 belongs to the CER6 subfamily of the KCS family and has a highly conserved cysteine activation site at amino acid position 224. A phylogenetic analysis revealed a close relationship between ZxCER6 and AtCER6 of Arabidopsis thaliana. Transcript profile analysis revealed that ZxCER6 transcript levels were much higher in aboveground tissues， especially in the leaf epidermis， than in below-ground organs. Expression of ZxCER6 was strongly induced by 50 mmol·L^-1 NaCl treatment and its transcript level peaked at 36 hours of this treatment. ZxCER6 was expressed in A. thaliana under the control of an epidermal-specific promoter， and the performance of the transgenic plants was compared with that of wild type plants. Upon drought treatment， the shoot dry and fresh weight， total chlorophyll content， net photosynthetic rate， and water use efficiency of transgenic Arabidopsis were significantly higher than those of the wild type， and the water loss rate， chlorophyll leaching rate， and relative membrane permeability of detached leaves were lower than those of the wild type. The wax content， especially the alkane content， in the aboveground cuticle was significantly higher in the transgenic plants than in the wild type plants. These findings indicate that ZxCER6 can increase the proportion of alkanes in the cuticular wax on the epidermis of transgenic plants leading to reduced water loss， and consequently， improved drought resistance. The results of this study reveal that ZxCER6 mediates the accumulation of epicuticular waxes that play an important role in the drought resistance of the desert plant Z. xanthoxylum. Our findings highlight an excellent genetic resource that can be used for the genetic improvement of drought resistance in forage and crop plants.

Graphical abstract

关键词

霸王 / 角质层蜡质 / β-酮脂酰辅酶A合成酶 / 抗旱性

Key words

Zygophyllum xanthoxylum / cuticular wax / β-ketoacyl-CoA synthase / drought tolerance

超长链脂肪酸（very-long-chain fatty acids，VLCFAs）是合成植物角质层蜡质的前体物质。在VLCFAs生物合成过程中β-酮脂酰辅酶A合成酶（β-ketoacyl-CoA synthase，KCS）是催化脂肪酸延伸的关键限速酶^［1］。目前，已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中鉴定到21个KCS基因，根据氨基酸序列同源性可划分为4个亚族，分别是FAE1-like、KCS1-like、FDH-like和CER6^［2］。其中单一缩合酶FAE1催化种子中VLCFAs的合成；KCS1、FDH、CER6已被证明参与了蜡质成分的合成^［3］。到目前为止，有关拟南芥KCS1、KCS2、KCS6 （CER6/CUT1）、KCS10（FDH）、KCS13（HIC）和KCS20在表皮蜡质合成中的功能已有详细报道^［3-7］。Todd等^［4］首先在拟南芥中分离鉴定到KCS1，发现其与FAE1的同源性为53%，负责催化蜡质前体VLCFAs的合成；但kcs1-1茎、叶和角果中的醇、醛、烷烃和酮的含量有不同程度的减少，这表明KCS1可能在蜡质合成的脱羰基和酰基还原中起作用。Lee等^［5］在拟南芥中克隆到KCS2/DAISY和KCS20，并且发现KCS20和KCS2/DAISY的拟南芥单突变体与野生型相比表皮角质层蜡质含量无显著差异，但是在双突变体中蜡质含量明显减少，表明这两个基因存在功能冗余。Pruitt等^［6］克隆得到拟南芥KCS10（FDH），该基因编码的蛋白能够催化脂肪族化合物的延长，其缺失突变体表现出叶片、花器官融合；其超表达导致植株生长发育迟缓，植株矮化。拟南芥KCS13（HIC）缺失后，在hic突变体中叶片上的气孔密度增加了42%，表明该基因负调控气孔发育^［7］。CER6（KCS6/CUT1）是目前为止在拟南芥中发现的唯一专门催化角质层蜡质合成的缩合酶，与野生型相比，cer6叶角质层蜡质含量减少了48%，而茎中减少80%以上^［8-9］，且发现其功能丧失导致C24的蜡质衍生物大量积累，表明该基因参与C26及以上碳链的超长链脂肪酸的生物合成，在拟南芥的蜡质合成中发挥着关键作用^［10］。近年来，已经在番茄（Lycopersicon esculentum）^［11］、大麦（Hordeum vulgare）^［12］、棉花（Gossypium hirsutum）^［13］、小盐芥（Thellungiella halophila）^［14］、甘蓝型油菜（Brassica napus）^［15］等多种植物中鉴定到CER6基因家族成员。

角质层蜡质是覆盖在陆生植物表面的天然保护屏障，在植物抵御生物和非生物胁迫中起着重要作用^［16-17］。将拟南芥的CER1、CER6、WAX2和SHINE1分别转入番茄中，发现转基因植株的抗旱能力较野生型显著提高^［18］；将上述4个蜡质合成相关基因的转基因番茄自交后代进行苗期抗旱耐盐性评价，并接种灰霉（Botrytis cinera）和晚疫（Phytophthora infestans）病病菌，验证了这些基因对生物胁迫的响应^［19］。用35S强启动子驱动AtCER6基因过表达，与野生型相比，转基因植株中AtCER6基因表达量显著增加，但蜡质并没有积累。利用拟南芥CER6自身启动子过表达AtCER6，转基因植株茎表皮蜡质含量增加^［10］。超表达蒺藜苜蓿（Medicago truncatula） WXP1能够促进紫花苜蓿（Medicago sativa）叶表皮蜡质积累、增强保水能力，从而提高其抗旱性^［20］。利用CER6启动子驱动WXP1在紫花苜蓿中表达，发现干旱条件下转基因植株较野生型有更高的相对含水量和叶片水势，蜡质含量增加，提高了植株的抗旱性^［21］。在水稻（Oryza sativa）中过表达OsWRKY89，使植物蜡质成分改变，不仅提高了转基因水稻的抗旱性，而且增强了其抵御紫外线和抗病能力^［22］。过表达OsGL1-2增加了水稻叶片的蜡质晶体数量，从而提高了转基因水稻植株的抗旱性^［23］。过表达DRF2水稻植株叶表面蜡质含量增加，失水速率降低，耐旱性提高，同时蜡质合成和胁迫相关的基因表达上调^［24］。R2R3 MYB转录因子MdMYB30通过调节表皮蜡质生物合成来调节植物对病原体的抗性^［25］。过表达BnKCS1-1、BnKCS1-2和BnCER1-2甘蓝型油菜的叶表皮蜡质晶体密度增加，水分散失率降低，抗旱性增强^［26］。以上研究表明，角质层蜡质合成基因是提高植物抗性的候选基因。

霸王（Zygophyllum xanthoxylum）是一种多浆旱生植物，主要分布在我国西北部和中亚的沙漠地区，具有极强的抗旱和耐盐能力^［27］。前期研究发现发达的叶表皮角质层是霸王适应荒漠生境的重要特征^［28-30］。然而，有关霸王角质层蜡质生物合成分子机制的研究至今尚未见报道。本研究从霸王中分离得到ZxCER6，并成功构建了拟南芥AtCER6表皮特异性启动子驱动的ZxCER6植物表达载体，分析其在角质层蜡质合成及抗旱中的功能，可揭示ZxCER6介导的蜡质积累在荒漠植物霸王抗旱性中的作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料培养与处理

霸王种子于2018年8月采自内蒙古阿拉善左旗北部至阿右旗拉腾敖包苏木（39°05′ N，105°34′ E；海拔1360 m）。挑选籽粒饱满且大小均匀的无损种子，用自来水漂洗除去杂质，再用10%的次氯酸钠浸泡7~10 min，期间间隔摇晃3~5次，然后用蒸馏水冲洗4~5次后移至4 ℃冰箱内避光浸泡2 d，随后25 ℃黑暗催芽2 d。发芽后，将长势良好且较为一致的种子移栽至装有石英砂的营养钵（5 cm×5 cm×5 cm）中，浇灌1/2 Hoagland营养液［2 mmol·L^-1 KNO₃，0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₄，0.5 mmol·L^-1 MgSO₄·7H₂O，0.5 mmol·L^-1 Ca（NO₃）₂·4H₂O，60 μmol·L^-1 Fe-citrate·3H₂O，50 μmol·L^-1 H₃BO₃，10 μmol·L^-1 MnCl₂·4H₂O，1.6 μmol·L^-1 ZnSO₄·7H₂O，0.6 μmol·L^-1 CuSO₄·5H₂O，0.05 μmol·L^-1 Na₂MoO₄·2H₂O］进行培养。每2 d更换一次营养液，温室的昼夜温度为（28±2） ℃/（23±2） ℃，光照16 h·d^-1，光照强度8000 lx（150 μmol·m^-2·s^-1），相对湿度为50%。

对3周龄霸王幼苗的不同叶位叶片：上层叶（由上向下数的第2层）、中层叶（由下向上数的第3层）和下层叶（子叶），以及根和中层叶表皮分别进行取样，用于基因的表达模式分析。

同时对3周龄的霸王幼苗进行50 mmol·L^-1 NaCl处理下的表达模式分析：用含有50 mmol·L^-1 NaCl的营养液处理 0、1、3、6、12、36和48 h；处理液每天更换，从而保证处理条件相对恒定。处理结束后，取样时将中层叶剪下，蒸馏水冲洗后用滤纸吸干表面水分，快速冷冻于液氮中，放置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续RNA提取。

拟南芥野生型Col-0（兰州大学草地农业科技学院草类植物逆境生理与遗传改良研究所实验室保存）和转AtCER6pro：：ZxCER6拟南芥纯合系种子用75%乙醇和5%次氯酸钠（NaClO）分别消毒3 min，期间不断晃动以保证种子表面被充分消毒，然后用灭菌的蒸馏水冲洗5~7遍，随后将种子浸泡于蒸馏水中放置在4 ℃春化2~3 d。将春化后的拟南芥种子播种于装有草炭土的小花盆（5株·盆^-1）中进行培养，每2 d使用蒸馏水浇灌一次。培养条件：温度22~23 ℃，光照120~150 μmol·m^-2·s^-1、16 h（昼）/8 h（夜），相对湿度50%~60%。对生长于草炭土中的4周龄野生型Col-0 （wild type，WT）及4个纯合系转基因拟南芥OE5、OE8、OE12和OE19植株进行2个干旱周期性间歇处理（每个干旱周期为处理7 d后复水1 d，每个处理5个重复，每个重复5株苗），进行后续生理指标和角质层蜡质含量的测定。

1.2 方法

1.2.1 特异性引物设计及基因克隆

按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）的操作说明书提取不同器官和不同处理下各个时间点的霸王总RNA。Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR反转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）进行cDNA合成。参照Clone-tech SMARTer^TM RACE cDNA扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）说明书的具体操作流程进行3′和5′ cDNA末端扩增。利用WF-CER6和WR-CER6 PCR扩增出该基因全序列，反应体系为：正反向引物（表1）各0.5 μL，PrimeSTAR Buffer 2 μL，dNTP Mixture （2 mmol·L^-1） 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，加dd H₂O定容至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2 生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0软件对序列进行拼接、比对和翻译。利用在线软件TMHMM Server v.2.0、Compute pI/MW、NCBI网站CDD search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）以及在线软件Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行蛋白质跨膜区、等电点、分子量、保守结构域预测。利用Clustal X 2.1和MEGA 6软件进行比对并构建系统进化树。

1.2.3 RT-qPCR分析

采用SYBR Premix Ex Taq TMII qPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）进行荧光定量PCR。PCR反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq TMII Buffer 10 μL，ROX Refernce Dye 0.4 μL，Forward primer（QF） 0.8 μL，Reverse Primer（QR） 0.8 μL，cDNA模板3 μL，加dd H₂O定容至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。溶解曲线程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每个样品重复3次，采用2^-ΔΔCt法^［15］计算ZxCER6的相对表达量。

1.2.4 拟南芥遗传转化及转基因植株分子鉴定

将构建好的pBIB-BASTA-pAtCER6：：ZxCER6植物表达载体通过热激法^［31］转入根癌农杆菌GV3101菌株感受态细胞，在含50 μg·mL^-1 Kana和50 μg·mL^-1 Rif的LB固体培养基（5 g·L^-1 NaCl，5 g·L^-1酵母粉，10 g·L^-1胰蛋白胨，10 g·L^-1琼脂粉）上进行阳性克隆筛选，经菌落 PCR 验证后将转化成功的农杆菌菌液保存于-80 ℃冰箱。通过根癌农杆菌介导的花序浸染法^［31］转化野生型拟南芥，喷施0.01% Basta对侵染的拟南芥植株进行抗性筛选，分株收获抗性植株的种子。筛选至T₃代后，获得转基因拟南芥纯合系。并提取转基因拟南芥幼苗叶片总RNA及合成cDNA，以AtActin2为内参，对ZxCER6进行RT-PCR检测。

1.2.5 生理指标测定

转基因拟南芥经周期性干旱处理后测定如下生理指标：1）株高：用直尺测量^［31］；2）地上部干鲜重：用称重法^［31］测定；3）光合相关参数：用GFS-3000便携式光合仪（德国WALZ公司）测定净光合速率（net photosynthetic rate，P_n）、蒸腾速率（transpiration rate，T_r）和气孔导度（stomatal conductance，G_s），并计算水分利用效率（water use efficiency，WUE=P_n/T_r）^［31］。叶面积采用EPSON V750数字化扫描仪［爱普生（中国）有限公司］扫描和Digimizer software图像分析软件统计计算；4）叶绿素含量：采用80%乙醇提取法^［32］测定；5）叶片相对含水量：用饱和鲜重法^［31］测定；6）叶片相对质膜透性：参照田野^［31］的方法测定；7）离体叶片失水率和8）叶绿素浸出率在测定前需将待测植株黑暗处理6 h，使气孔闭合，然后参照Kosma等^［33］的方法称重并计算。

1.2.6 角质层蜡质含量的测定

剪取干旱处理组及其对应的对照组拟南芥植株莲座叶5片和整个花序茎，每个材料3个重复。在10 mL色谱纯氯仿中浸泡30 s，同时每个样品中加入25 μL正二十四烷烃（1 μg·μL^-1）作为内标，之后用NDK200-2N氮吹仪（杭州米欧仪器有限公司）将浸提液吹干，往试管中加入100 µL BSTFA和100 µL吡啶，100 ℃下孵育30 min进行烷基化，待孵育结束后再次用氮吹仪在37 ℃下吹干，随后加入100 µL色谱纯正己烷溶解。参照Li等^［30］的方法利用气相色谱-质谱联用仪（GC：7890B；MS：7000D，安捷伦科技有限公司）对烷基化后的样品进行测定及分析。以内标的峰面积为参照，对蜡质样品进行定量及定性分析，蜡质含量用μg·cm^-2表示。

1.3 数据处理

通过Excel 2019软件整理数据，利用SPSS 19.1软件进行统计分析，使用Origin 9.1作图。不同处理间的差异显著性采用单因素方差分析（One-way ANOVA），显著水平为P<0.05（LSD检验）。

2 结果与分析

2.1 霸王ZxCER6基因的克隆与生物信息学分析

利用霸王已有的转录组中CL6403.Contig1_All序列为核心片段，经3′和5′端PCR扩增和测序，获得了ZxCER6 3′、5′端长度，分别为1230和1025 bp。将ZxCER6的转录组片段序列、3′及5′端序列用DNAMAN 6.0软件进行比对拼接，得到这个基因的全长序列。为了下一步研究的可靠性，对拼接序列进行引物设计，用高保真酶进行PCR扩增，通过测序得到一个全长1548 bp的cDNA序列，包含1491 bp的开放阅读框（open reading fram，ORF），编码496个氨基酸残基，将其命名为ZxCER6 （图1）。推测其分子量为55.9 kDa，等电点为9.22。该序列翻译到的氨基酸含有6个跨膜区，其中有2个高度保守的完全跨膜区（TM1、TM2），分别位于第23~45，58~90氨基酸残基之间 （图2A），其决定底物选择性。同时发现该蛋白属于缩合酶超家族，包含3个酶催化位点（Cys224、His391和Asn424），其中第224位的半胱氨酸是高度保守的催化基序，11个产物结合位点，8个丙二酰基-CoA结合位点以及若干个二聚体识别位点（图2B），这些结构均与脂肪酸的合成和降解有关。

2.2 ZxCER6蛋白序列比对及进化树分析

通过在线比对，发现ZxCER6与高等植物的CER6蛋白同源性较高，与相似性较高的7种植物CER6蛋白进行多重比对。结果显示，ZxCER6与其他高等植物CER6蛋白序列具有较高的同源性，包括2个高度保守的完全跨膜区（TM1、TM2），且第224位的半胱氨酸（Cys224）是高度保守的激活位点（图3）。利用MEGA 6软件构建了植物CER6蛋白的系统发育树。结果表明，ZxCER6蛋白与拟南芥、大豆、甜瓜、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）等双子叶植物的CER6蛋白形成一个大的分支，且ZxCER6蛋白与拟南芥AtCER6蛋白的亲缘关系最近，并聚集在同一个小分支上，表明它们的氨基酸序列差异较小，具有较高的相似性，亲缘关系较近，在功能上可能也存在相似性。而单子叶植物小果野芭蕉（Musa acuminate）、海枣（Phoenix dactylifera）等的CER6蛋白被归类为另一个大分支（图4）。

2.3 ZxCER6组织特异性表达及盐处理下的表达模式分析

组织特异性分析发现，ZxCER6在植株地上部组织的表达量较高，尤其在叶表皮中表达丰度较高，在根中的表达丰度极低（图5A）。50 mmol·L^-1 NaCl处理下，霸王叶中ZxCER6的表达被强烈诱导，并在36 h时达到峰值，为对照的14倍，随后急剧下降，但在48 h时的表达丰度仍显著高于对照（图5B）。结果表明，ZxCER6可能参与超长链脂肪酸的合成，且其表达受盐处理的显著诱导。

2.4 植物表达载体的构建

经Hind Ⅲ和Sac Ⅰ双酶切将AtCER6启动子和ZxCER6构建于植物表达载体pBIB-BASTA-35S-GWR-FLAG中 （图6A~C）。菌液PCR检测得到1239和1506 bp左右的目标条带 （图6D）。

2.5 转ZxCER6拟南芥的鉴定

对4个转基因拟南芥株系OE5、OE8、OE12、OE19中ZxCER6的表达量进行检测，分别得到两个表达量较高（OE12和OE19）和两个表达量较低（OE5和OE8）的转基因株系（图7），并用于后续生理试验。

2.6 转ZxCER6拟南芥的抗旱性分析

2.6.1 干旱处理对转基因拟南芥生长的影响

将4周龄野生型及转基因拟南芥进行周期性干旱处理，对不同干旱周期下的转基因及野生型植株的生长状况进行比较发现，正常条件下，转基因拟南芥与野生型长势基本一致；在第1个干旱周期后，野生型拟南芥发生明显萎蔫，而转基因拟南芥生长状态良好，且转基因和野生型植株的株高较对照组明显降低（图8）。经过第2个干旱周期后，野生型叶片发黄和萎蔫程度较转基因植株明显，对株高（图9）、地上部干鲜重（图10）进行测量及称重统计发现，在第2个干旱周期结束时，转基因株系OE12和OE19的株高与对照组相比并无显著差异，均显著高于野生型（P<0.05）。在第2个干旱周期结束时，与对照组相比，野生型的地上部鲜、干重分别减少了36%、21%，而转基因株系分别平均减少了13%和6%。以上结果表明，在干旱条件下转ZxCER6拟南芥比野生型更能保持较好的长势，从而维持正常生长。

2.6.2 干旱处理对转基因拟南芥叶绿素含量及光合作用参数的影响

与对照组相比，干旱处理后转基因植株叶绿素含量有所下降，净光合速率和气孔导度无显著差异，而水分利用效率显著高于野生型（图11）。以上结果表明干旱处理后转基因株系通过维持较高的叶绿素含量和气孔导度，从而保证了植株光合作用的正常进行。

2.6.3 干旱处理对转基因拟南芥表皮透性的影响

正常条件下，转基因株系的离体叶片失水率和叶绿素浸出率均低于野生型；经过2个周期性干旱处理后，所有转基因株系的离体叶片失水率和叶绿素浸出率相比于对照组均有所下降，但转基因株系仍低于野生型（图12）。以上结果表明，转ZxCER6拟南芥株系表皮透性降低，从而减少了水分散失。

2.6.4 干旱处理对转基因拟南芥叶片相对含水量的影响

植物组织相对含水量反映了植物组织的水分状况和植物的保水能力，是植物抗旱能力的重要依据。正常条件下，各株系之间叶片相对含水量并无显著差异（P>0.05），均维持在72%左右；在干旱处理后，转基因株系的叶片相对含水量仍维持在70%左右，而野生型则降至54%。由此说明转ZxCER6拟南芥在受到干旱胁迫后仍能维持较好的水分状态（图13）。

2.6.5 干旱处理对转基因拟南芥相对质膜透性的影响

正常条件下，转基因与野生型植株的相对质膜透性无显著差异（P>0.05）；而干旱处理后，不论是野生型还是转基因植株的相对质膜透性均高于对照组，野生型植株的增幅高达137%。这说明干旱处理后转ZxCER6拟南芥株系的细胞膜受损程度显著低于野生型（图14）。

2.6.6 ZxCER6对拟南芥角质层蜡质生物合成的影响

为了解析ZxCER6在角质层蜡质合成中的作用，对野生型和OE5、OE8、OE12和OE194个转基因株系的莲座叶和花序茎角质层蜡质的组成和含量进行了分析（图15和图16）。在正常条件下，与野生型相比，OE5、OE8、OE12和OE19转基因植株莲座叶总蜡质含量分别增加了约69%、56%、87%和73%，其中，4个转基因株系的烷烃含量较野生型分别增加了96%、85%、129%和110%（图15A）。同时发现转基因株系中的奇数碳链烷烃含量显著高于野生型（P<0.05），特别是C29烷烃，在OE12转基因植株中的含量与野生型相比增加了1.6倍（图15B）。而在野生型和4个转基因株系的花序茎中则发现烷烃含量较野生型显著增加（P<0.05，图16A）。以上结果表明，ZxCER6的超表达主要影响了蜡质合成中的醛脱羰基合成途径，从而使烷烃大量积累。

在干旱胁迫下，与野生型相比，OE5、OE8、OE12和OE194个转基因株系植株的莲座叶和花序茎中总蜡质含量分别增加了54%、39%、94%、55%和26%、23%、35%、34%。其中转基因株系莲座叶中烷烃含量较野生型增加了81%~114%；而花序茎中增幅较低，为49%~56%（图15C和图16C）。同时，干旱胁迫下，转基因拟南芥较野生型莲座叶中C29烷烃含量分别增加98%、76%、169%和104%；而花序茎中C29烷烃则分别增加了56%、54%、60%和58%（图15D和图16D）。以上结果表明，干旱胁迫诱导了烷烃的大量合成，从而增加了蜡质在地上部的积累。

3 讨论

角质层蜡质在植物应对各种生物和非生物胁迫中起着重要作用。目前对植物角质层的研究主要以角质层并不发达的中生植物为对象，对旱生植物发达的角质层形成机制及其在适应逆境过程中的作用研究尚处于起步阶段。β-酮脂酰辅酶A合成酶（KCS）作为脂肪酸延伸反应的限速酶，在蜡质前体物质VLCFAs的合成过程中发挥着关键作用。到目前为止，KCS6/CER6的功能研究较为清楚。CER6 （CUT1）的拟南芥沉默植株茎中的角质层蜡质含量仅是野生型的6%~7%，蜡质组分分析表明，其脱羰基途径受到严重抑制，C30醛、C29烷烃、C29次级醇和C29酮的含量分别为野生型的3.5%、2.2%、1.4%和2.2%。同时也发现，转基因植株中初级醇含量为野生型的45%^［34］。在番茄LeCER6转座子插入突变体中，叶片和果实缺乏链长超过C30的正构烷烃和醛类 ^{［11，35］}。水稻中分离得到的AtCER6同源基因OsWSL4在水稻中超表达后，转基因植株叶片的蜡质含量比野生型增加了30.3%，其中C30~C34 VLCFAs、C32初级醇和C27~C33烷烃在转基因系中均有增加^［36］。因此，CER6同时影响着蜡质合成的两条途径，尤其对脱羰基途径影响较大。本研究克隆到的霸王ZxCER6与其他植物基因编码的氨基酸序列同源性均在90%以上，属于CER6亚家族。并且具有KCS家族特异的Cys-His-Asn催化基序，高度保守的半胱氨酸（Cys）是第一步缩合的酰基受体，该蛋白通过两个疏水跨膜结构域锚定在内质网膜上发挥作用^［37-38］。系统发育分析显示，ZxCER6与来自双子叶植物物种的其他CER6蛋白聚集在一起，特别与拟南芥AtCER6的亲缘关系最近（图4）。与Hooker等^［10］通过RT-PCR，原位杂交及β-葡萄糖苷酶（GUS）染色分析的组织特异性表达结果一致，ZxCER6在植株地上部组织中高表达，尤其是表皮细胞层。以上对霸王ZxCER6蛋白的结构特征、特异性表达模式及系统发育结果分析表明，ZxCER6属于KCS家族的CER6亚家族，可能参与调节霸王VLCFAs的生物合成。进一步研究发现，与野生型相比，转ZxCER6拟南芥植株莲座叶总蜡质含量增加了56%~87%，烷烃含量增加了85%~129%（图15A，B），其蜡质含量的增加主要是由于C29、C31、C33的超长链烷烃的显著变化使角质层蜡质总量显著增加，因此本研究推测ZxCER6可能参与了超长链烷烃的生物合成。ZxCER6在拟南芥中超表达，主要影响了蜡质合成中的醛脱羰基合成途径，从而使烷烃大量积累，这与拟南芥AtCER6的表达介导了蜡质中脂肪酸向烷烃的转变一致^［39］。

外源基因在植物体内的表达受启动子的影响，对目的基因的靶向表达和功能发挥起重要作用。早期研究发现，p35S：：AtCER6的过表达使CER6 mRNA水平升高，但未能促进蜡质积累或组分的改变^［14］。但在AtCER6启动子的驱动下，CER6/CUT1过表达导致拟南芥茎中蜡质增加，并且通过荧光定量分析比较了35S启动子和CER6启动子的活性，发现CER6启动子在转基因拟南芥中高度活跃^［40］。Jiang等^［21］在拟南芥AtCER6启动子驱动MtWXP1表达的转基因紫花苜蓿植株中发现，CER6启动子驱动的转基因株系与CaMV35S启动子驱动的转基因株系之间总蜡质含量没有显著差异，但生长发育正常。同样，本研究利用拟南芥AtCER6启动子驱动ZxCER6在拟南芥中表达，发现4个转基因拟南芥株系莲座叶和花序茎中角质层蜡质含量均显著高于野生型，分别增加了56%~87%和32%~47%（图15A和图16A）；但与野生型相比生长并无明显差异 （图8）。因此，利用表皮特异性启动子驱动蜡质合成相关基因在植物中的表达以增加其蜡质含量，从而提高植物抗旱性，是一种非常有效的转基因手段。

众多研究表明，角质层蜡质在植物抵御环境胁迫中发挥重要作用。角质层蜡质含量增加可以增强抗旱性已在转基因拟南芥^［41-42］、紫花苜蓿^{［20， 43］}、亚麻芥（Camelina sativa） ^［44］和落花生（Arachis hypogaea）^［45］等中得到了验证。本研究表明，在干旱处理后，4个转ZxCER6拟南芥株系莲座叶和花序茎中角质层蜡质含量均较野生型分别增加了39%~94%，23%~35%（图15C和图16C）。ZxCER6转基因株系OE5、OE8、OE12和OE19的烷烃含量显著高于野生型，其中转基因株系莲座叶中烷烃含量较野生型增加了81%~114%，C29烷烃含量分别增加了98%、76%、169%和104%。同时转ZxCER6拟南芥植株角质层的水分散失和叶绿素浸出比野生型更慢（图12）。这表明ZxCER6的超表达增加了转基因拟南芥烷烃的大量合成和积累，从而更加有效地阻止水分流失，增强了植株的抗旱性。

4 结论

本研究克隆得到霸王β-酮脂酰辅酶A合成酶编码基因ZxCER6，该基因cDNA全长1548 bp，编码496个氨基酸，属于缩合酶超家族。与双子叶植物的CER6蛋白同源性较高，均包含2个高度保守的跨膜区，具有KCS家族特异的Cys-His-Asn催化基序，其中Cys224是高度保守的酶催化位点。ZxCER6在植株地上部组织的表达量较高，尤其在叶表皮中高丰度表达，且受50 mmol·L^-1 NaCl处理的强烈诱导。干旱处理后，转ZxCER6拟南芥表皮烷烃的大量合成促进了角质层蜡质积累，降低了表皮透性，从而增强了转基因拟南芥的保水性，进而提高其抗旱性。

参考文献

[1] Rossak M， Smith M， Kunst L. Expression of the FAE1 gene and FAE1 promoter activity in development seeds of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology， 2001， 46（6）： 717-725.

[2] Costaglioli P， Joubès J， Garcia C， et al. Profiling candidate genes involved in wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana by microarray analysis. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2005， 1734（3）： 247-258.

[3] Joubès J， Raffaele S， Bourdenx B， et al. The VLCFA elongase gene family in Arabidopsis thaliana： Phylogenetic analysis， 3D modeling and expression profiling. Plant Molecular Biology， 2008， 67（5）： 547-566.

[4] Todd J， Post-Beittenmiller D， Jaworski J G. KCS1 encodes a fatty acid elongase 3-ketoacyl-CoA synthase affecting wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal， 1999， 17（2）： 119-130.

[5] Lee S B， Jung S J， Go Y S， et al. Two Arabidopsis 3-ketoacyl CoA synthase genes， KCS20 and KCS2/DAISY， are functionally redundant in cuticular wax and root suberin biosynthesis， but differentially controlled by osmotic stress. The Plant Journal， 2009， 60（3）： 462-475.

[6] Pruitt R E， Vielle-Calzada J P， Ploense S E， et al. FIDDLEHEAD， a gene required to suppress epidermal cell interaction in Arabidopsis， encodes a putative lipid biosynthetic enzyme. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America， 2000， 97（3）： 1311-1316.

[7] Gray J E， Holroyd G H， van der Lee F M， et al. The HIC signalling pathway links CO₂ perception to stomatal development. Nature， 2000， 408（6813）： 713-716.

[8] Fiebig A， Mayfield J A， Chau S， et al. Alterations in CER6， a gene identical to CUT1， differentially affect long chain lipid content on the surface of pollen and stems. Plant Cell， 2000， 12（10）： 2001-2008.

[9] Jenks M A， Tuttle H A， Eigenbrode S D， et al. Leaf epicuticular waxes of the eceriferum mutants in Arabidopsis. Plant Physiology， 1995， 108（1）： 369-377.

[10] Hooker T S， Millar A A， Kunst L. Significance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production in Arabidopsis. Plant Physiology， 2002， 129（4）： 1568-1580.

[11] Leide J， Hildebrandt U， Reussing K， et al. The developmental pattern of tomato fruit wax accumulation and its impact on cuticular transpiration barrier properties： Effects of a deficiency in a β-ketoacyl-coenzyme A synthase （LeCER6）. Plant Physiology， 2007， 144（3）： 1667-1679.

[12] Richardson A， Boscari A， Schreiber L， et al. Cloning and expression analysis of candidate genes involved in wax deposition along the growing barley （Hordeum vulgare） leaf. Planta， 2007， 226（6）： 1459-1473.

[13] Qin Y M， Pujol F M， Hu C Y， et al. Genetic and biochemical studies in yeast reveal that the cotton fibre-specific GhCER6 gene functions in fatty acid enlongation. Journal of Experimental Botany， 2007， 58（3）： 473-481.

[14] Li H T. Cloning and characterization of the ThCER6 gene from Thellungiella halophila. Jinan： Shandong Normal University， 2004.

[15] 李宏韬. 小盐芥（Thellungiella halophila）ThCER6基因的克隆与功能研究. 济南： 山东师范大学， 2004.

[16] Wu Y H， Cao Y L， Luo J L， et al. Cloning and functional characterization of KCS6 genes from Brassica napus. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2012， 34（6）： 567-574.

[17] 武玉花， 曹应龙， 罗军玲， 甘蓝型油菜中KCS6基因的克隆和功能分析. 中国油料作物学报， 2012， 34（6）： 567-574.

[18] Krauss P， Markstädter C， Riederer M. Attenuation of UV radiation by plant cuticles from woody species. Plant Cell Environment， 1997， 20（8）： 1079-1085.

[19] Sieber P， Schorderet M， Ryser U， et al. Transgenic Arabidopsis plants expressing a fungal cutinase show alterations in the structure and properties of the cuticle and postgenital organ fusions. The Plant Cell， 2000， 12（5）： 721-737.

[20] Karaba A. Improvement of water use efficiency in rice and tomato using Arabidopsis wax biosynthetic genes and transcription factors. Wageningen： Wageningen University & Research， 2007.

[21] Sun Y Y. Improvement of drought and salt tolerance using Arabidopsis BOUNTIFUL and HARDY gene and epicuticular wax synthesis genes in tomato. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2012.

[22] 孙玉燕. 利用拟南芥BOUNTIFUL和HARDY基因以及表皮蜡质合成基因提高番茄耐旱和耐盐性. 北京： 中国农业科学院， 2012.

[23] Zhang J Y， Broeckling C D， Blancaflor E B， et al. Overexpression of WXP1， a putative Medicago truncatula AP2 domain-containing transcription factor gene， increases cuticular wax accumulation and enhances drought tolerance in transgenic alfalfa （Medicago sativa）. The Plant Journal， 2005， 42（5）： 689-707.

[24] Jiang Q， Zhang J Y， Guo X， et al. Physiological characterization of transgenic alfalfa （Medicago sativa） plant for improved drought tolerance. International Journal of Plant Sciences， 2009， 170（8）： 969-978.

[25] Wang H H， Hao J J， Chen X J， et al. Overexpression of rice WRKY89 enhances ultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants. Plant Molecular Biology， 2007， 65（6）： 799-815.

[26] Islam M A， Du H， Ning J， et al. Characterization of Glossy1-homologous genes in rice involved in leaf wax accumulation and drought resistance. Plant Molecular Biology， 2009， 70（4）： 443-456.

[27] Wang Y H. Rice DRF2， a transcriptional activator， is involved in leaf wax synthesis. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010.

[28] 王友华. 水稻ERF转录激活子DRF2调控叶表蜡质合成. 北京： 中国农业科学院， 2010.

[29] Zhang Y L， Zhang C L， Wang G L， et al. The R2R3 MYB transcription factor MdMYB30 modulates plant resistance against pathogens by regulating cuticular wax biosynthesis. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 362.

[30] Wang Y M， Jin S R， Xu Y， et al. Overexpression of BnKCS1-1， BnKCS1-2， and BnCER1-2 promotes cuticular wax production and increases drought tolerance in Brassica napus. Crop Journal， 2020， 8（1）： 26-37.

[31] Ma Q， Yue L J， Zhang J L， et al. Sodium chloride improves photosynthesis and water status in the succulent xerophyte Zygophyllum xanthoxylum. Tree Physiology， 2012， 32（1）： 4-13.

[32] Zhao C X， Huang Z C. A preliminary study of xeromorphism of some important xerophytes growing in Tungeli Desert. Acta Botanica Sinica， 1981， 23（4）： 278-283.

[33] 赵翠仙， 黄子琛. 腾格里沙漠主要旱生植物旱性结构的初步研究. 植物学报， 1981， 23（4）： 278-283.

[34] Ma Y L， Wang L， Liu Y X， et al. Updates on stress tolerance of main accessory structures and their synergetic interaction in desert plants. Plant Physiology Journal， 2015， 51（11）： 1821-1836.

[35] 马亚丽， 王璐， 刘艳霞， 荒漠植物几种主要附属结构的抗逆功能及其协同调控的研究进展. 植物生理学报， 2015， 51（11）： 1821-1836.

[36] Li H J， Bai W P， Liu L B， et al. Massive increases in C31 alkane on Zygophyllum xanthoxylum leaves contribute to its excellent abiotic stress tolerance. Annals of Botany， 2023， 131（4）： 723-736.

[37] Tian Y. Functional verification of ZxABCG11 from Zygophyllum xanthoxylum and genetic transformation to alfalfa （Medicago sativa L.）. Lanzhou： Lanzhou University， 2017.

[38] 田野. 霸王ZxABCG11的功能验证及其对紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的遗传转化. 兰州： 兰州大学， 2017.

[39] Lolle S J， Berlyn G P， Engstrom E M， et al. Developmental regulation of cell interactions in the Arabidopsis fiddlehead-1 mutant： a role for the epidermal cell wall and cuticle. Development Biology， 1997， 189（2）： 311-321.

[40] Kosma D K， Bourdenx B， Bernard A， et al. The impact of water deficiency on leaf cuticle lipids of Arabidopsis. Plant Physiology， 2009， 151（4）： 1918-1929.

[41] Millar A A， Clemens S， Zachgo S， et al. CUT1， an Arabidopsis gene required for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility， encodes a very-long-chain fatty acid condensing enzyme. Plant Cell， 1999， 11（5）： 825-838.

[42] Vogg G， Fischer S， Leide J， et al. Tomato fruit cuticular waxes and the effects on transpiration barrier properties： functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（401）： 1401-1410.

[43] Wang X C， Guan Y Y， Zhang D， et al. A beta-ketoacyl-CoA synthase is involved in rice leaf cuticular wax synthesis and requires a CER2-LIKE protein as a cofactor. Plant Physiology， 2017， 173（2）： 944-955.

[44] Lassner M W， Lardizabal K， Metz J G. A jojoba beta-ketoacyl-CoA synthase cDNA complements the canola fatty acid elongation mutant in transgenic plants. Plant Cell， 1996， 8（2）： 281-292.

[45] Ghanevati M， Jaworski J G. Active-site residues of a plant membrane-bound fatty acid elongase β-ketoacyl-CoA synthase， FAE1 KCS. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2001， 1530（1）： 77-85.

[46] Busta L， Budke J M， Jetter R. Identification of β-hydroxy fatty acid esters and primary， secondary-alkanediol esters in cuticular waxes of the moss Funaria hygrometrica. Phytochemistry， 2016， 121（1）： 38-49.

[47] Suh M C， Samuels A L， Jetter R， et al. Cuticular lipid composition， surface structure， and gene expression in Arabidopsis stem epidermis. Plant Physiology， 2005， 139（4）： 1649-1665.

[48] Aharoni A， Dixit S， Jetter R， et al. The SHINE clade of AP2 domain transcription factors activates wax biosynthesis， alters cuticle properties， and confers drought tolerance when overexpressed in Arabidopsis. The Plant Cell， 2004， 16（9）： 2463-2480.

[49] Bourdenx B， Bernard A， Domergue F， et al. Overexpression of Arabidopsis ECERIFERUM1 promotes wax very-long-chain alkane biosynthesis and influences plant response to biotic and abiotic stresses. Plant Physiology， 2011， 156（1）： 29-45.

[50] Zhang J Y， Broeckling C D， Sumner L W， et al. Heterologous expression of two Medicago truncatula putative ERF transcription factor genes， WXP1 and WXP2， in Arabidopsis led to increased leaf wax accumulation and improved drought tolerance， but differential response in freezing tolerance. Plant Molecular Biology， 2007， 64（3）： 265-278.

[51] Lee S B， Kim H， Kim R J， et al. Overexpression of Arabidopsis MYB96 confers drought resistance in Camelina sativa via cuticular wax accumulation. Plant Cell Reports， 2014， 33（9）： 1535-1546.

[52] Lokesh U， Venkatesh B， Kiranmai K， et al. Overexpression of β-ketoacyl-CoA synthase1 gene improves tolerance of drought susceptible groundnut （Arachis hypogaea L.） cultivar K-6 by increased leaf epicuticular wax accumulation. Frontiers in Plant Science， 2019， 9（11）： 1869.

基金资助

国家自然科学基金(32271749)

阿拉善盟国家级公益林二十年（2004-2023）生态效益评估项目(AMKJZC2024-01)