紫花苜蓿非组培遗传转化体系创建及在耐盐基因功能鉴定与基因编辑中的应用

Establishment of a tissue culture-free genetic transformation system for alfalfa and its applications in salt-tolerance gene functional characterization and gene editing

摘要

针对紫花苜蓿传统遗传转化技术存在的周期长、效率低、基因型依赖性强的技术瓶颈，本研究创新性地建立了基于发根农杆菌介导的高效非组培遗传转化体系。以‘龙牧806’苜蓿枝条为材料，采用优化的节下穿刺浸染法，构建无需组织培养的高效遗传转化体系。该方法可在14 d内获得转基因苜蓿嵌合体，生根率达72%~82%，毛状根遗传转化率达90.24%~94.59%。在应用验证方面，本研究取得两项重要突破：首先，利用该体系快速鉴定了耐盐基因MsRCI2D的功能，获得的转基因苜蓿嵌合体在200 mmol·L^-1 NaCl胁迫下抗氧化酶活性显著提高、活性氧的积累显著下降、离子稳态调节能力增强；其次，结合可视化报告基因RUBY，建立了苜蓿基因编辑gRNA快速筛选技术，编辑效率达到23.07%。本研究建立的体系大幅缩短了转基因苜蓿嵌合体的获得周期，提高了转化效率。该技术不仅为紫花苜蓿基因功能研究提供了高效平台，同时为牧草分子设计育种提供了可靠的技术支撑，对其他饲草的遗传改良也具有重要参考价值。

Abstract

There are substantial challenges in the genetic improvement of alfalfa （Medicago sativa）， a globally important forage crop， because of the limitations of conventional transformation methods. These methods are time-consuming， genotype-dependent， and reliant on labor-intensive tissue culture processes. To address these issues， we developed a rapid， tissue culture-free transformation system for alfalfa. This system was developed and optimized using the alfalfa cultivar Longmu 806. The system employs Agrobacterium rhizogenes-mediated infection combined with a simple stem-pricking infiltration method. This innovative approach eliminates the need for callus induction and somatic embryogenesis， enabling the generation of transgenic chimeric alfalfa within just 14 days-a dramatic reduction compared with the 3-6 months typically required with traditional protocols. We used this system in two applications： 1） Rapid functional analysis of the MsRCI2D gene， which conferred enhanced salt tolerance in transgenic chimeric plants， as evidenced by increased antioxidant enzyme activities， decreased reactive oxygen species accumulation， and improved ion homeostasis under 200 mmol·L^-1 NaCl stress； and 2） Establishment of an efficient guide RNA screening platform using the RUBY reporter system， which achieved a 23.07% editing efficiency in transformed roots， providing a robust and visual tool for optimizing CRISPR gRNAs. This breakthrough transformation strategy addresses major bottlenecks in alfalfa genetic engineering-namely genotype dependence and prolonged timelines—and offers a powerful platform for high-throughput gene function studies， abiotic stress tolerance improvement， and precision genome editing. By integrating simplicity， speed， and high efficiency， our system holds transformative potential for both fundamental research and molecular breeding in alfalfa and other recalcitrant forage crops.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / 非组培转化 / 转基因嵌合体 / 耐盐基因 / gRNA筛选

Key words

Medicago sativa / tissue culture-free transformation / transgenic chimeras / salt tolerance / gRNA screening

紫花苜蓿（Medicago sativa）作为世界上最早栽培且最广泛种植的豆科牧草，被誉为“牧草之王”^［1］。随着畜牧业的快速发展，针对不同地区环境需求培育新品系成为亟待解决的问题^［2］。生物育种技术在苜蓿新品种培育领域已发挥巨大的推动作用^［3］。建立高效、便捷的遗传转化体系，加速苜蓿的基因功能研究和品种改良是扩大苜蓿种质资源的有效途径。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化体系是苜蓿转化的主要方法。该方法需经过复杂的组织培养过程，其转化率较低，具有基因型依赖性，受环境和操作手法的差异，方法的可重复性差^［4］。植物组织培养技术通常依赖外源激素^［5-6］，这些激素的使用会引起副作用^［7］；在培养过程中加入筛选剂，对植株会造成额外压力^［8］。目前，只有少数基因型能够成功进行遗传转化，这使得直接改良优良底盘品种在实践中具有挑战性^［9］。随着转化体系不断地优化，个别紫花苜蓿品种转化效率得以提高，如‘中苜1号’转化效率最高可达31%^［10］；‘WL-525HQL’的转化效率为59.7%~67.9%^［4］；‘公农1号’的转化效率可达到50%^［11］；‘龙牧’系列苜蓿的转化率约20%^［12］。

毛状根遗传转化体系［由发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导］在一些植物中的应用已取得进展^［13-15］。在紫花苜蓿中，旦真措等^［16］建立毛状根转化‘无棣苜蓿’的效率可达到98.3%，但该体系需要严格的无菌操作，且转基因苜蓿嵌合体转化周期通常为3~6个月。在大豆（Glycine max）中，已成功利用发根农杆菌，无需组织培养途径获得转基因大豆嵌合体和毛状根^［17］。朱健康团队开发的“切割浸泡萌芽（cut-dip-budding， CDB）”技术是一种高效的无需组织培养的转基因技术^［18］，在多个植物中成功实现了转化，包括草本植物、块根植物和木本植物，并且在叶肉植物和根蘖型植物中也有很大的应用前景。然而，这两种方法并不适用于苜蓿。对于苜蓿而言，其下胚轴较细，下胚轴注射法和切割的方法都难以操作获得植株。

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展，科学家们已开始尝试在苜蓿中进行精准的基因功能验证与育种改良^［19-22］。然而，由于苜蓿的四倍体特性和基因组的复杂性，CRISPR技术在苜蓿中的应用进展较为缓慢，转化效率低是问题的症结所在^［11］。因此，发展一种高效且简便的转化体系对推动苜蓿基因编辑技术的应用至关重要。

本研究提出一种基于苜蓿枝条的无组织培养的毛状根遗传转化方法。通过在苜蓿枝条的节下进行穿刺发根农杆菌，之后直接插入松软土壤中，14 d内即可获得转基因苜蓿嵌合体。这一方法相较于传统方法具有简便、快捷、低错误率和低感染风险的优势，且能大幅缩短转化周期。此方法不仅可用于耐盐基因功能的快速验证，还能作为基因编辑中gRNA有效性的快速鉴定，为苜蓿耐盐基因功能研究和生物育种提供了有力支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苜蓿材料为‘龙牧806’，种子由实验室保存备用。发根农杆菌菌株MSU440、DH5α 大肠杆菌感受态购自上海唯地生物技术有限公司；过表达MsRCI2D基因植物表达载体pMDC123-RCI2D由实验室保存；CRISPR/Cas9基因编辑载体pGTR、pRGEB31R由中国科学院青岛能源所付春祥教授馈赠。

1.2 试验方法

1.2.1 穿刺转化及方法优化

菌液制备：活化发根农杆菌MSU440，涂布在含50 mg·L^-1卡那霉素和50 mg·L^-1链霉素的LB固体培养基（NaCl 10 g·L^-1、酵母粉5 g·L^-1、蛋白胨10 g·L^-1、琼脂15 g·L^-1）上，28 ℃培养约2 d，菌板表面布满菌落。

材料准备：选择田间种植的‘龙牧806’苜蓿作为转化材料，选取茎秆紧实、叶片健康、无萎蔫黄化的株系。苜蓿枝条剪成约含两节的段，每节下方保留约1 cm，剪成45°斜面并去除多余侧叶，仅保留1个侧芽。

穿刺方式优化：设计蘸菌和穿刺转化方式。穿刺位置设置在节上和节下，节下的穿刺位置设置为0~0.5 cm、0.5~1.0 cm和1.0~1.5 cm这3个区间，穿刺次数设置为1、2、3和4次4个组别。每组试验设置3个重复，每个重复5株。

毛状根培养：穿刺后的苜蓿材料移栽到预先浸润过霍格兰营养液的蛭石与土壤（2∶1）混合基质中，26 ℃、3000~5000 lx、8 h黑暗及16 h光照的条件下进行培养。培养过程中定期浇灌霍格兰营养液和清水。穿刺后14 d内观察到毛状根在切口处生长；20 d后，计算毛状根生根率：生根植株数/总侵染株数×100%。

1.2.2 转基因毛状根检测及转化率

基因表达检测：利用GFP报告基因，通过荧光显微镜（ECHO-Revolve， RVL-100-G，瑞士）观察根中绿色荧光，确认外源基因成功转入苜蓿根部。提取毛状根的基因组DNA，使用特异性引物（S： ATGAGCCCAGAACGACGC； AS： TCAAATCTCGGTGACGGGC）进行PCR检测。

实时定量RT-PCR（qPCR）：提取PCR阳性毛状根RNA，反转录为cDNA。qPCR以目的基因MsRCI2D的特异性引物（F： 5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′；R： 5′-TCAAATCTCGGTGACGGGC-3′）进行定量分析，同时以GAPDH基因作为内参基因。所有样品均进行3次生物学重复和3次技术重复。

转化率：qPCR阳性毛状根数量/毛状根总数×100%。

1.3 利用转基因苜蓿嵌合体快速验证基因功能

转基因苜蓿嵌合体和野生型苜蓿通过1/5 Hoagland溶液在温室中培养约2个月，选择长势一致的植株进行盐胁迫处理。根据每盆植物的吸水量计算，将200 mmol·L^-1 NaCl溶液倒入托盘中进行盐胁迫。分别在处理前、处理后6和12 h进行根部RNA提取。

在盐胁迫处理前及处理后5和10 d，使用叶绿素测定仪（TYS-B型，浙江）测定苜蓿叶片的相对叶绿素含量。此外，通过电导率仪（米科EC8.0，浙江）测定叶片在去离子水中浸泡12 h后的初始电导率R₁，随后沸水浴30 min，再次测定电导率R₂。计算相对电导率（relative conductivity，REC）：（R₁/R₂）×100%。

在盐胁迫处理前及处理后的第5和10天，每个株系、每个时间点分别取600 mg毛状根样品，进行3次生物学重复。使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒，测定过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（superoxide radical， OFR）含量，以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）、过氧化物酶（peroxidase， POD）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase， GR）活性。

将野生型及转基因苜蓿根部于105 ℃杀青，80 ℃烘干至恒重，研磨后称取0.05 g样品，加入一定量的硝化液（1.0 mL 60%三氯乙酸，5.0 mL浓硝酸和0.5 mL浓硫酸混合而成），于90 ℃恒温水浴中提取，过滤后待测。钾离子标准溶液的配制：称取105 ℃烘干4~6 h的分析纯KCl 0.1907 g溶于去离子水中，定容至1 L，即得到100 μg·mL^-1的钾离子标准溶液。钠离子标准溶液的配制：称取105 ℃烘干4~6 h的分析纯NaCl 2.542 g溶于去离子水中，定容至1 L，吸取此液250 mL定容至1 L，即得到250 μg·mL^-1的钠离子标准溶液。将钾钠两标准溶液等量混合，吸取混合标准溶液0， 2， 5， 10， 20和40 mL，分别移入50 mL容量瓶中，加入1 mL硝化液，用去离子水定容，则获得分别含钾0， 2， 5， 10， 20和40 μg·mL^-1和含钠0， 5.0， 12.5， 25.0， 50.0， 100 μg·mL^-1的混合标准溶液。用配制好的混合标准溶液在火焰光度计（上海昕瑞仪器，FP6410，上海）上制作标准曲线后，对样品进行测定。

1.4 可视化gRNA快速筛选鉴定体系建立

1.4.1 Cas9系统靶位点设计及载体构建

克隆MsPALM-1基因，并确定其PAM序列为NGG。根据gRNA设计原则，靶位点序列应符合5′-20 bp+NGG-3′的形式，同时确保GC含量不低于40%，避免覆盖品种的SNP突变位点，并尽可能选择靠近读码框5′端的靶位点。通过在线工具分析gRNA目标序列的二级结构，筛选适合MsPALM-1基因编辑的靶位点（图1）。

以含有tRNA和gRNA序列的pGTR载体作为模板，设计带靶位点的特异性引物，并参考付春祥团队^{［19，23］}的方法进行扩增和连接靶点片段。所设计的引物如下：S-1： GCTAACTCTGGATAACAAAGCACCAGTG， AS-1： GCGGTCTCAGTGCTCGTCTCCTGCACCAGCCGGGAA； S-2：TAGGTCTCATCAAGCTCTTGG GTTTTAGAGCTAGAA， AS-2： GCGGTCTCAGCGGTCTCATTGAGCTGACCGTGCACCAGCCGGGAA； S-3： TAGGTCTCATCAAGCTCTTGGGTTTTAGAGCTAGAA， AS-3：TAGGTCTCAATATAAAAA AAGCACCGACTCGGTGCC。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取抗性克隆进行菌落PCR鉴定，并测序验证靶点序列的正确性。

1.4.2 RUBY基因克隆和载体的构建

以35S：RUBY载体为模板，根据35S：RUBY基因的全长序列以及pRGEB31R-MsPALM载体序列设计同源臂引物（35S：RUBY-S： CACATTATTATGGAGAAACTCGAG ATGGATCATGCGACCCTC； 35S：RUBY-AS： CAAATCTATCTCTCTCGACTCGAGTCACTATCA CTGGAGGCT），PCR扩增并回收目的片段。载体pRGEB31R-MsPALM采用Xho I进行单酶切，随后利用无缝克隆技术进行连接、转化、PCR鉴定、测序。将测序正确的菌液储存于-80 ℃冰箱以备后续试验。

1.4.3 可视化快速筛选鉴定

按照1.2.2中的方法，将含pRGEB31R-MsPALM-35S：：RUBY质粒的发根农杆菌通过穿刺方法侵染紫花苜蓿枝条。在毛状根生长后，通过根的颜色进行可视化筛选：由于RUBY基因可使转基因组织呈红色，因此直接筛选红色毛状根作为阳性样本。

随后，从红色毛状根中提取基因组DNA进行PCR检测，并进一步测序以确认gRNA介导的基因编辑是否成功。通过测序峰图分析gRNA靶点的突变情况，并评估基因编辑类型（碱基缺失、插入或替换），以判断gRNA靶点的有效性^［23］。

1.5 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行标准差计算、方差分析（ANOVA）和T检验。P<0.01为差异极显著（**），0.01<P<0.05为差异显著（*），P>0.05为差异不显著。所有试验数据来源于3次生物学重复和3次技术重复计算得到的平均值。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿穿刺法遗传转化体系的建立

2.1.1 穿刺方式的优化

为提高遗传转化效率，本研究对影响毛状根转化的关键因素进行了系统优化。首先比较了蘸菌与穿刺两种方法，结果发现，穿刺法处理的苜蓿枝条其毛状根生根率达100%，而蘸菌的枝条并未长出毛状根，表明穿刺处理对毛状根诱导具有必要性（图2b）。

进一步探讨穿刺部位对转化效率的影响，结果显示节上穿刺平均根长为0.41 cm，节下穿刺根长为节上穿刺的13.85倍，毛状根数量节上穿刺平均为0.93根，节下穿刺平均为6.27根，由此可知节下穿刺转化显著提高毛状根的数量和根长（P<0.001，图2c和图3a）。在此基础上，对节下不同位置的穿刺效果进行比较，在节下0.5~1.0 cm处穿刺的枝条，其根长分别为0~0.5 cm、1.0~1.5 cm的1.58、1.56倍，根数量分别为0~0.5 cm、1.0~1.5 cm的1.56、1.08倍（图2d和图3b）。

穿刺次数对转化效果的评估影响结果表明，穿刺3次时，毛状根的数量和根长均达到最佳（图2e和图3c），其中毛状根根长约为其他试验组的9.73、3.32、5.76倍，毛状根数量为其他试验组的3.08、1.69、3.48倍。尽管增加穿刺次数可提高发根农杆菌的侵染率，但过多穿刺可能影响枝条的生长，因此需根据苜蓿枝条的粗度进行适当调整。

基于上述结果，确定最佳穿刺转化操作流程如下：使用1 mL注射器的针头，经适当弯曲后刮取发根农杆菌，在苜蓿枝条节下0.5~1.0 cm处进行3次穿刺（图2a）。处理后的枝条移栽至蛭石∶土（2∶1）的基质中，保持湿润，在适宜光照条件下培养，14 d后可观察到毛状根的产生。培养过程中定期补充水分或霍格兰营养液。

2.1.2 穿刺法遗传转化效率评估

优化的穿刺遗传转化法，毛状根的生根率达82%。由于pMDC123载体携带的GFP报告基因，因此在荧光显微镜下检测根中的荧光信号，结果显示新生毛状根具有明显的绿色荧光（图4a），表明外源基因成功整合并在根部表达。

此外，利用Bar基因毛状根进行PCR检测，阳性率达到90.24%（图4b）。进一步通过MsRCI2D基因的qPCR分析，结果显示，该方法可实现外源基因在毛状根中的超量表达，并在不同株系间表现出表达的差异（图4c）。

2.2 MsRCI2D 基因耐盐的快速鉴定

2.2.1 转基因苜蓿嵌合体耐盐性增强

转基因苜蓿嵌合体（D₁、D₂）与野生型（WT）植株在200 mmol·L^-1 NaCl溶液中处理10 d后，叶绿素含量和叶片的相对电导率如图5a和b所示。与WT相比，5和10 d时转MsRCI2D基因苜蓿嵌合体叶绿素含量分别是WT株系的1.62、1.64倍，差异显著（P<0.01）。相应的，WT株系电导率显著高于嵌合体，盐胁迫5和10 d时分别是嵌合体的2.14和2.03倍，嵌合体电导率显著降低（P<0.01）。尽管转基因嵌合体仅在根部超量表达MsRCI2D，但盐胁迫造成的损伤具有系统性，其耐盐效应可扩展至地上部。

2.2.2 盐胁迫下活性氧积累及抗氧化酶活性的变化

未处理时，各株系间毛状根中MDA、H₂O₂和OFR含量的差异不显著（图5c~e）。然而，在盐胁迫5 d后，WT植株MDA、H₂O₂、OFR含量为转基因植株的2.95、6.14、6.8倍；盐处理10 d时，WT植株3种活性氧的含量为转基因植株的1.70、2.85、4.40倍，差异极显著（P<0.01）。

进一步测定毛状根中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性（图5f~i）。在未处理条件下，转基因植株SOD活性显著高于WT（P<0.05）。盐胁迫后，4种抗氧化酶活性均显著上调，尤其是POD，在盐处理 5 d时活性达到WT的2.07倍。CAT、SOD 及 GR活性在盐处理 10 d时显著高于WT（P<0.05），分别为WT的1.97、1.79、1.04倍。由此表明，MsRCI2D通过增强抗氧化酶活性，提高了苜蓿的抗氧化能力，对应地降低了活性氧积累，减轻盐胁迫引起的氧化损伤。

2.2.3 盐胁迫下钠钾离子含量的变化

为探讨MsRCI2D对离子稳态的调控作用，测定WT和转基因株系毛状根中Na⁺、K⁺含量（图5j~l）。在200 mmol·L^-1 NaCl胁迫下，转基因株系根部Na⁺含量升高，K⁺含量降低，Na⁺/K⁺显著升高，且均与WT形成显著差异（P<0.01）。这一结果表明，MsRCI2D的超量表达有助于降低盐胁迫下Na⁺的毒害作用，维持较高的K⁺含量和较低的Na⁺/K⁺。

2.3 利用RUBY报告基因建立可视化gRNA快速筛选体系

2.3.1 可视化鉴定的准确性

基于2.1建立的遗传转化体系，进行了gRNA靶点有效性的快速筛选。先利用转化的材料统计了RUBY可视化筛选鉴定的准确性。50株转化植株中，有36株在切口处长出毛状根，毛状根的生根率为72%（图6a）。其中，26株毛状根呈红色，对其进行Bar基因PCR鉴定（图6b），PCR阳性率达到100%。因此，在无需组织培养的快速遗传转化体系中，RUBY报告基因可实现阳性转基因植株的可视化筛选，避免了PCR检测的繁琐操作，并具有较高的检出率和准确性。

2.3.2 gRNA有效性的快速鉴定

在确认26株转基因阳性毛状根后，对MsPALM基因编辑的效率进行评估，验证gRNA靶点的有效性。测序结果显示，其中4个样品检测到双峰信号，即基因编辑效率为15.38%（图6c）。由此可见，该可视化转化体系可用于gRNA的快速筛选和有效性验证，为基因编辑提供了便捷的筛选策略。

3 讨论

3.1 影响毛状根发生率的因素

毛状根的诱导受多个因素影响，主要包括发根农杆菌菌株的选择和受体植物的结构特性。目前常见的发根农杆菌菌株包括K599、MSU440、LBA9402等，不同菌株在不同植物中的诱导效率存在差异。例如，LBA9402在苜蓿中的诱导效率较高^［24］，ATCC15834在OD₆₀₀=0.6时可有效诱导茶树‘福云6号’（Camellia sinensis）的毛状根形成^［25］，而在番茄（Solanum lycopersicum）转化中，Ar Qual具有最佳转化效率^［26］。本研究采用的MSU440是应用广泛的菌株，在苜蓿转基因研究中已有成功报道^［27］，但并非发根率最高。因此，筛选不同菌株，也是提升生根率的途径。

此外，毛状根诱导的成功率与接种方式密切相关。CDB（切割-浸泡-萌发）的转化方法，在草本、块根和木本植物都有成功的报道，但也有局限性^［18］。本试验也尝试了CDB的方法（图3b），但未能成功诱导毛状根。这可能与苜蓿的茎组织结构、激素平衡及伤口愈合机制相关^［28-29］。为了提高毛状根的诱导率，本研究结合穿刺法，可以有效地诱导毛状根，并发现穿刺的操作是毛状根形成的关键因素。而穿刺的位置和穿刺的次数也会影响毛状根的发根率和根长。经试验确定，对于2 mm直径的苜蓿枝条，在节下0.5~1.0 cm处穿刺3次，毛状根的发根率最高。由于苜蓿可扦插，该方法可能适用于其他可扦插繁殖的木本和草本植物，但具体参数需结合不同植物的茎秆结构进一步优化。

3.2 应用毛状根转化体系进行基因功能的快速鉴定

转化体系的效率与精准度直接决定了基因功能研究的深度和应用价值。高效的遗传转化体系可实现对目标基因的定向操作（如沉默、过表达或基因编辑），从而在体内验证基因的生物学功能。植物发根农杆菌介导的遗传转化体系是许多与植物根相关的理论研究的理想系统，通过缩短转化周期，可以加快抗盐碱、抗旱、根瘤和根部相关病害的研究进程^［30-31］。本研究建立的穿刺遗传转化体系，过表达 MsRCI2D基因，获得转基因苜蓿的嵌合体，通过对盐胁迫下苜蓿根中各项生理指标的检测，确定该基因具有增强苜蓿耐盐性的功能，主要表现为抗氧化酶活性升高，活性氧积累减少，离子调控能力增强（图5）。本试验方法14 d内即可得到转化毛状根，利用该转基因嵌合体，进行基因功能研究，大大缩短了试验周期。

3.3 RUBY报告基因在转基因筛选中的应用

RUBY报告基因是将CYP76AD1、DODA和GT这3个基因偶联一个开放读码框的基因。以酪氨酸为底物，在CYP76AD1、DODA和GT这3种酶的催化下可合成甜菜红素，因此，RUBY是一种可视的报告基因^［32］。与传统GUS报告基因相比，RUBY具有无需外源底物、无需染色处理、可直接观察阳性植株的优点。此外，生长素响应启动子DR5介导的RUBY表达已成功应用于愈伤组织诱导筛选^［32］，可在组织培养阶段直接通过颜色筛选转化植株。本研究采用组成型启动子驱动RUBY，以增强显色效果。在转化的毛状根中，红色根的阳性检测率达100%（图6a，c），证明RUBY可作为可靠的可视化筛选标记，免去PCR检测，提高了筛选效率，有助于活体快速筛选阳性转化植株。

3.4 可视化gRNA快速筛选体系

自2020年新疆大叶四倍体基因组重测序后，国内已经有5个团队成功实现了紫花苜蓿的基因组编辑，基因编辑的效率也由1.72%提升到49.00%^［33-36］。Zhao等^［11］和Wolabu等^［36］基因编辑的成功案例提示高的遗传转化效率是底盘，而串联多靶点可以有效提升基因编辑的效率。由此可见，gRNA的选择是决定紫花苜蓿基因编辑成功与否的另一个关键。由于毛状根诱导和生长都较为迅速，因此毛状根体系可作为平台快速验证紫花苜蓿基因编辑gRNA的有效性，在筛选中加上可视化的报告基因，也使得筛选工作更为便捷简单。本研究结合无组培毛状根遗传转化和RUBY报告基因，在26株阳性毛状根中获得4株基因编辑的毛状根，较为高效地实现了gRNA的筛选和基因编辑载体的验证。后续基因编辑苜蓿植株的获得，可以利用毛状根诱导愈伤组织获得再生植株，也可以用已经构建的Cas9-sgRNA-RUBY载体转化苜蓿的叶片，借助RUBY报告基因的筛选也可以获得稳定的基因编辑苜蓿材料。

4 结论

本研究建立了一套无需组织培养获得转基因苜蓿嵌合体的方法，即苜蓿茎节下0.5~1.0 cm处穿刺发根农杆菌MSU440，14 d后长出毛状根，生根率达72%~82%，毛状根遗传转化率达90.24%~94.59%。利用该体系快速鉴定了耐盐基因MsRCI2D的功能，获得的转基因嵌合体在200 mmol·L^-1 NaCl胁迫下抗氧化酶活性显著提高、活性氧的积累显著下降，离子调控能力增强。结合可视化报告基因RUBY，建立了苜蓿基因编辑gRNA快速筛选技术，编辑效率达到23.07%，为CRISPR/Cas9系统在苜蓿中的应用提供了新策略。

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基金资助

农业生物育种国家科技重大专项(2022ZD040120401)