谷子SiCCoAOMT基因家族的鉴定及表达分析

Identification and expression analysis of the SiCCoAOMT gene family in Setaria italica

摘要

CCoAOMT蛋白家族属于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶，在植物木质素合成和生长发育中具有关键作用，但在谷子中的功能尚未被系统研究。本研究以谷子基因组数据为基础，鉴定SiCCoAOMT家族成员，并进行生物信息学分析及非生物胁迫响应验证。结果表明：在谷子SiCCoAOMT基因家族中鉴定出5个SiCCoAOMT基因：Si2g25370、Si4g06670、Si6g06400、Si6g19790和Si6g19800，定位于第2、4和6号染色体，编码蛋白的理化性质差异明显。通过系统发育分析，将谷子SiCCoAOMT基因与拟南芥、水稻和狗尾草的同源基因划分为两个亚族，且同一亚族内的成员保守序列和基因结构高度相似。CCoAOMT基因家族成员均包含相同的蛋白保守结构域（motif 1、motif 2、motif 4、motif 5和motif 6），同一亚族的成员具有相似的motif。顺式作用元件预测中，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4中含有大量关于光响应（Sp1）、植物激素（ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif）和非生物胁迫（ARE）的作用元件。谷子与水稻、狗尾草共线性基因对分析发现，谷子和狗尾草CCoAOMT受到中性选择的同时，还存在纯化选择；谷子与水稻CCoAOMT之间存在正选择效应。加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4被划分在yellowgreen模块中。对‘晋谷21’幼苗进行干旱和低温胁迫处理，利用qRT-PCR对SiCCoAOMT家族基因进行表达模式分析发现，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4表达量明显上调。基于360份谷子和38份狗尾草种质资源的单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失变异（InDels）基因型信息分析发现，SiCCoAOMT5有利于谷子籽粒的生长发育，对谷子的产量提高和抵抗胁迫有一定的作用。综上所述，本研究对谷子SiCCoAOMT基因家族进行了系统地分析，鉴定出SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4是谷子响应干旱及寒冷胁迫的关键基因，为谷子抗逆境胁迫和生长调控机制的深入研究提供了一定的依据。

Abstract

The caffeoyl-CoA O-methyltransferase （CCoAOMT） protein family belongs to the S-adenosyl-L-methionine （SAM）-dependent methyltransferase superfamily. Members of the CCoAOMT family are known to play key roles in plant lignin synthesis， as well as in growth and development. However， their function in Setaria italica has not been systematically studied. In this study， members of the SiCCoAOMT gene family were identified from S. italica genomic data， and bioinformatics analysis was conducted. In addition， the expression patterns of these genes under abiotic stress were determined. Five SiCCoAOMT genes in the SiCCoAOMT gene family were identified in the S. italica genome， and were located on chromosomes 2， 4， and 6. The physical and chemical properties differed among the five encoded putative proteins. In a phylogenetic analysis， the SiCCoAOMT genes of S. italica were divided into two subfamilies with homologous genes from Arabidopsis thaliana， Oryza sativa， and Setaria viridis. Members of the same subfamily shared high similarity in terms of conserved sequences and gene structures. All members of the CCoAOMT gene family contained the same conserved protein structure domains （motif 1， motif 2， motif 4， motif 5， and motif 6）， and members of the same subfamily had similar motifs. Prediction of cis-acting elements showed that SiCCoAOMT2 and SiCCoAOMT4 contained many elements responsive to light （Sp1）， plant hormones （ABRE， CGTCA-motif， and TGACG-motif） and abiotic stresses （ARE）. Collinearity analysis among S. italica， O. sativa， and S. viridis revealed that the CCoAOMT orthologs in S. italica and S. viridis have been subject to neutral selection and purifying selection， and the CCoAOMT orthologs in S. italica and O. sativa have been subject to positive selection. In a weighted gene co-expression network analysis， SiCCoAOMT2 and SiCCoAOMT4 were grouped in the yellowgreen module. To further verify the roles of SiCCoAOMT genes in stress responses， seedlings of the cultivar ‘Jingu 21’ were subjected to drought and low-temperature stresses， and the SiCCoAOMT transcript levels were analyzed by qRT-PCR. The results showed that the transcript levels of SiCCoAOMT2 and SiCCoAOMT4 were significantly up-regulated under both stress conditions. Based on single nucleotide polymorphism and insertion/deletion genotype information for 360 S. italica and 38 S.viridis germplasm resources， haplotype analysis showed that SiCCoAOMT5 was beneficial for the growth and development of S. italica grains， and contributed to the yield and stress resistance of S. italica. Overall， this study systematically characterized the SiCCoAOMT gene family in S. italica， identifying SiCCoAOMT2 and SiCCoAOMT4 as key genes involved in drought and cold stress responses. These findings provide a foundation for further exploration of the stress resistance and growth regulation mechanisms of S. italica.

Graphical abstract

关键词

谷子 / CCoAOMT基因家族 / 非生物胁迫 / 系统进化 / 单倍型

Key words

Setaria italica / CCoAOMT gene family / abiotic stress / phylogenetic evolution / haplotype

CCoAOMT（caffeoyl-CoA O-methyltransferase）蛋白家族属于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶^［1］，其通过催化G型木质素前体咖啡酰辅酶A（caffeoyl-CoA）3-羟基位点的甲基化反应^［2］，驱动木质部中木质素的生物合成，从而增强植物茎秆机械强度、维持细胞壁结构完整性、提高病原体抗性及水分运输效率，最终赋予植株高硬度和抗腐烂特性^［3-4］。自1989年Kuhnl与Pakusch团队分别在胡萝卜（Daucus carota）和欧芹（Petroselinum crispum）悬浮细胞中发现CCoAOMT活性以来^［5-6］，该基因功能研究逐步深入：Schmitt等^［7］于1991年首次在欧芹中克隆到CCoAOMT的cDNA，但没有确定其功能。1994年Ye等^［8］在百日草（Zinnia elegans）中发现了5~10种CCoAOMT，确定了CCoAOMT参与植物木质素的生物合成。除上述植物外，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［9-10］、水稻（Oryza sativa）^［11］、狗尾草（Setaria viridis）^［12］、黄麻（Corchorus capsularis）^［1］等植物中先后发现了多种CCoAOMT基因。例如，甜菜（Beta vulgaris）BvCCoAOMT基因可以提高作物的抗旱和耐盐特性^［13］；玉米（Zea mays）ZmCCoAOMT在干旱胁迫下活性显著上调^［14］；盐诱导可以使水稻OsCCoAOMT基因显著表达^［15］，表明CCoAOMT促使木质素合成增加，以应对干旱和盐碱等非生物胁迫。

谷子（Setaria italica）为二倍体禾本科作物，起源于我国黄河流域，由狗尾草驯化而来^［16］。其具有抗寒抗旱性强、生育期短、适应性广等特性，是我国北方传统主栽作物，亦适宜中国中南部地区种植^［17］。在长期驯化过程中，谷子形成丰富的抗逆种质资源，对干旱、高温等胁迫表现出显著适应性^［18］。值得注意的是，全球气候变暖引发的“种植带北移”现象^［19］，加剧了我国北方干旱、洪涝等极端气候事件，进一步显示谷子抗逆研究的必要性。作为最早完成基因组测序的杂粮作物，谷子基因组精简（约515 Mb），遗传操作便捷；山西农业大学培育的‘晋谷21’超早熟突变种‘xiaomi’兼具C₄植物高效光合特性与抗逆遗传潜力^［20］，为解析禾本科抗逆机制及基因挖掘提供了理想模型，本研究选择此变种进行研究。

我国北方农业区受水资源短缺与极端气候叠加影响^［21］，作物减产问题严峻。CCoAOMT基因家族在植物抗逆中的作用已被广泛报道，但目前谷子SiCCoAOMT的研究较少，仅在研究狗尾草SevirCCoAOMT时，联合谷子SiCCoAOMT，构建了系统进化树^［22］。本研究基于全基因组鉴定谷子SiCCoAOMT家族成员，联合狗尾草、水稻、拟南芥进行跨物种进化比较，分析CCoAOMT家族在禾本科物种间的进化关系；系统分析SiCCoAOMT家族的结构特征、功能多样性，结合qRT-PCR验证SiCCoAOMT在非生物胁迫下的动态表达模式；通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis， WGCNA）构建了高表达SiCCoAOMT基因的共表达网络，筛选出模块中的核心基因及候选基因、并对其进行富集分析，系统解析谷子SiCCoAOMT基因家族的分子特征与抗逆调控网络，为其在谷子抗逆育种中的进一步研究奠定基础，助力应对“温带北移”引发的生态适应性挑战，对保障区域粮食安全具有重要战略意义。

1 材料与方法

1.1 SiCCoAOMT基因家族成员的鉴定及理化性质分析

在国家水稻数据中心（https：//www.ricedata.cn/）检索已报道的水稻OsCCoAOMT家族成员作为参考序列，从MDSi数据库（http：//foxtail-millet.biocloud.net/home）进行序列同源比对（E-value<10^-5），并下载‘xiaomi’基因组和注释文件。在Pfam数据库检索CCoAOMT蛋白序列的HMM特征文件（PF01596），通过TBtools （v 1.127）^［23］对‘xiaomi’蛋白序列进行同源比对，在蛋白数据库中寻找序列相似的基因（Expect=10）。通过同源比对结果和HMM结果，查找SiCCoAOMT基因家族成员，利用SMART（http：//smart.embl.de/）和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）数据库进行蛋白保守结构域分析，鉴定出含相同保守结构域的基因。

从Phytozome数据库（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov）中下载水稻、狗尾草和拟南芥的基因组和注释信息，利用MEGA 11（v 11.0.13）^［24］对谷子、水稻、狗尾草和拟南芥的CCoAOMT家族蛋白进行多序列比对，采用近邻相接法构建系统发育树。

1.2 SiCCoAOMT家族成员基因结构、motif分布、启动子顺式作用元件及共线性分析

使用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）工具^［25］对谷子、拟南芥、水稻和狗尾草的CCoAOMT蛋白序列进行motif分析。利用CELLO （v 2.5）^［26］进行亚细胞定位预测。利用TBtools中的Gene Structure View （advanced）功能进行进化树、保守基序和基因结构可视化。

取启动子序列起始密码子上游2000 bp，将其上传到PlantCARE数据库（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），对谷子、拟南芥、水稻和狗尾草CCoAOMT家族启动子顺式作用元件进行分析。对结果进行筛选整理后，通过R （4.1.2）软件（https：//www.r-project.org/）对其作用元件分类和可视化。利用TBtools中的One Step MCScanX工具对谷子、狗尾草和水稻的CCoAOMT蛋白序列进行共线性关系分析。并使用dnaSP 6软件计算谷子、狗尾草和水稻的共线性基因对的非同义替换率（K_a ）与同义替换率（K_s ），分析选择压力（K_a/K_s ）。

1.3 WGCNA分析构建谷子SiCCoAOMT家族基因共表达网络

加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis， WGCNA）是一种分析多个样本基因表达模式的方法。本研究采用优质谷种‘晋谷21’^［27］，与谷子模式品种‘xiaomi’对比，分析‘晋谷21’和‘xiaomi’不同组织和发育时期SiCCoAOMT基因的表达量，并利用R 4.1.2软件绘制热图，依据基因表达模式进行聚类。

利用R的WGCNA包剔除缺失值过多的样本，用hclust函数进行样本聚类并过滤离群样本，之后用函数pick Soft Threshold确定合适的软阈值（power），构建符合无尺度网络分布的基因网络。基于基因之间相关性power次幂，构建TOM矩阵和邻接矩阵，划分并挑选出含SiCCoAOMT基因的模块。

1.4 谷子SiCCoAOMT家族基因非生物胁迫的表达模式分析及验证

2024年10月，以‘晋谷21’为试验材料，将种子种入栽培基质，置于恒温培养箱（BIC-300，中国上海）中培养。培养条件：16 h光照/8 h黑暗、温度25 ℃、相对湿度80%。培养至两叶一心时，取长势一致的谷子幼苗，分别进行干旱［20% （w/v）聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG-6000）］和低温（4 ℃）处理。分别在处理0、3、6、12和24 h时采集叶片，每个处理时间点3次生物学重复，经液氮速冻后，存于-80 ℃冰箱。

利用孙蓉等^［27］的方法，对上述取样和已有的‘晋谷21’灌浆S3期籽粒样品，进行总RNA提取，并进行反转录生成cDNA。使用NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站中的Primer-BLAST工具设计引物，以谷子Actin7基因作为内参基因（表1），使用HiScript III U+One Step qRT-PCR Probe 5×Master Mix（诺唯赞）试剂盒，进行qRT-PCR。反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸50 s，40个循环。每个样本设置3个机械重复，使用2^-ΔΔCT法^［28］计算SiCCoAOMT基因相对表达量，使用R绘图。

1.5 单倍型分析

基于前期研究所得360份谷子和38份狗尾草种质资源的单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失变异（InDels）基因型信息^［29］，取谷子SiCCoAOMT1~5上下游编码区2000 bp，通过CandiHap软件^［30］进行单倍型分析。

2 结果与分析

2.1 谷子SiCCoAOMT家族成员鉴定及系统进化分析

在国家水稻数据中心检索到已报道的水稻OsCCoAOMT基因LOC_Os08g38910^［31］，将其作为种子序列，与‘xiaomi’基因组blast序列比对。从Pfam数据库利用HMM（PF01596）检索CCoAOMT相关蛋白序列，筛选出谷子中含CCoAOMT基序的基因，其中包含blast比对得到的基因。通过Swiss-Prot和SMART数据库对这些基因的保守结构域进行比对分析，发现5个基因的编码蛋白含有CCoAOMT域（Swiss-Prot：Q43095）。最终确定5个谷子CCoAOMT基因，将其分别命名为SiCCoAOMT1~5。

将谷子SiCCoAOMT基因与7个拟南芥、6个水稻和6个狗尾草的CCoAOMT基因构建系统发育树（图1），探究CCoAOMT蛋白家族的系统进化关系。根据系统发育树，这些蛋白被划分成2个亚家族。

2.2 谷子SiCCoAOMT家族理化性质分析、染色体定位及共线性分析

将拟南芥、水稻、狗尾草和谷子4个物种的CCoAOMT家族蛋白进行理化性质及亚细胞定位分析（表2）。5个谷子SiCCoAOMT家族成员定位于2、4和6号染色体上（图2），其中，6号染色体分布最多，有3个SiCCoAOMT成员。染色体定位表明，SiCCoAOMT家族成员在谷子染色体两端分布，与狗尾草SevirCCoAOMT基因在染色体上的分布类似；在6号染色体上，SiCCoAOMT的个数比SevirCCoAOMT少1个。分析谷子SiCCoAOMT基因编码蛋白的理化性质发现，SiCCoAOMT蛋白由202~544个氨基酸残基组成，分子量（molecular weight， MW）为22591.96~58335.97 Da，理论等电点（pI）为4.93~9.01，不稳定指数为26.21~50.34（表2）。通过亚细胞定位预测，5个SiCCoAOMT被定位于叶绿体、细胞质中，只有SiCCoAOMT3可能存在于线粒体中。

将谷子SiCCoAOMT序列与水稻、狗尾草进行比对及共线性分析，发现SiCCoAOMT1~4基因与水稻、狗尾草的CCoAOMT成员具有共线性关系，仅SiCCoAOMT5与水稻、狗尾草基因组没有共线性关系（图2）。其中SiCCoAOMT1和SiCCoAOMT4基因在水稻、狗尾草CCoAOMT家族中均有2个同源基因。进一步计算谷子、水稻和狗尾草的CCoAOMT共线性基因对的K_a /K_s 值（表3），发现谷子与狗尾草共线性基因对的K_a /K_s 值大部分趋近于1，但是SiCCoAOMT3与Sevir.6G056900的K_a/K_s 值小于1 （K_a/K_s =0.725）。这说明谷子和狗尾草CCoAOMT受到中性选择的同时，还存在纯化选择，由此可能造成CCoAOMT-like的减少，使CCoAOMT的功能更加集中，但是会使SiCCoAOMT的抗逆能力弱于SevirCCoAOMT。谷子与水稻共线性基因对的K_a /K_s >1，说明谷子和水稻之间存在正选择效应，SiCCoAOMT可能进化出比OsCCoAOMT更适应环境的抗逆防御功能，使谷子更易在干旱、低温等逆境胁迫中生存。

2.3 谷子SiCCoAOMT家族基因结构和保守序列分析

对谷子、拟南芥、水稻和狗尾草的CCoAOMT家族基因结构进行分析，结果表明CCoAOMT基因包含4~9个外显子，3~8个内含子（图3A）。分析保守序列发现，4个物种所有CCoAOMT成员均包含motif 1、motif 2、motif 4、motif 5和motif 6 （图3B）。其中拟南芥AtCCoAOMT4含有的motif最少（6个）。与其他成员相比，SiCCoAOMT5蛋白序列明显较长。通过对4个物种的CCoAOMT成员保守序列分析发现，motif 1、motif 2、motif 4~6在CCoAOMT家族中广泛分布，4个物种同一亚族的CCoAOMT成员中的motif组成具有相似性。

2.4 谷子SiCCoAOMT家族启动子顺式作用元件预测

取谷子、拟南芥、水稻和狗尾草CCoAOMT家族启动子序列起始密码子上游2000 bp，将其上传到PlantCARE数据库，进行启动子顺式作用元件分析。对结果进行筛选整理后，通过R 对其作用元件分类和可视化，以研究谷子SiCCoAOMT基因在生物和非生物胁迫的应答及植物激素信号可能的机理（图4）。谷子SiCCoAOMT家族成员的功能响应元件包括：1）植物生长发育元件：ACE、Box 4、G-box、GATA-motif、Sp1、TCCC-motif、A-box、CAT-box、G-Box、I-box、ATCT-motif、AE-box、GT1-motif、RY-element、TCT-motif等；其中，光响应元件G-box在SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4中分布较多，SiCCoAOMT2中的光响应元件Sp1分布较多，大量的光响应元件可以增强对光胁迫的应答，协调昼夜节律，有效应对昼夜较大的温差。2）植物激素应答元件：ABRE（参与脱落酸响应），CGTCA-motif 和TGACG-motif（参与茉莉酸甲酯响应）、GARE-motif（参与赤霉素响应）、TGA-element和AuxRR-core（参与生长素响应）、TCA-element（参与水杨酸响应）；其中，ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif在SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4中分布较多，ABRE可以在干旱或盐胁迫条件下激活ABA应答基因的表达^［32］，MeJA响应元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）在遇到病虫害时，可激活防御基因表达^［33］。3）非生物和生物胁迫应答元件：LTR（参与低温响应）、ARE（参与无氧响应）、MBS（MYB结合位点参与干旱诱导）、TC-rich repeats（参与防御和应激响应）；其中，ARE（参与无氧响应）在SiCCoAOMT3中分布最多，可以在洪涝、水淹等无氧条件下，促使植物产生能量，支持植物在低氧环境中的生存。

2.5 谷子SiCCoAOMT家族共表达网络分析

对谷子RNA-Seq数据进行WGCNA分析，设置R²为0.9，软阈值为10，构建基因间的TOM矩阵，获得66个模块。从中筛选出含有SiCCoAOMT基因的模块，发现5个SiCCoAOMT分布在blue、yellow和yellowgreen模块中。通过Cytoscape （v 3.10.2），对blue、yellow和yellowgreen模块进行网络可视化。选取谷子SiCCoAOMT基因家族成员基因作为网络模块的核心基因，yellowgreen模块的核心基因为SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4，yellow模块的核心基因为SiCCoAOMT5，blue模块的核心基因为SiCCoAOMT1，3个模块共含有5个转录因子（图5）。对核心基因和候选基因进行GO、KEGG富集分析，结果注释到黄酮类物质生物合成和金属离子跨膜运输。SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4被聚类到一个模块，SiCCoAOMT2被注释到细胞质中（GO：0005829），可以对物理损伤或其他形式的组织破坏所做出的生物学反应（GO：0009611），激活SiCCoAOMT的酶活性，催化木质素生物合成；而SiCCoAOMT4被注释到细胞核中（GO：0005634），催化甲基从SAM转移到木质素（GO：0008757），SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4共同完成对木质素生物合成的调控。SiCCoAOMT5存在于线粒体中（GO：0005739），可以在细胞质中形成囊泡（GO：0016023），参与金属离子转运，辅助酶催化木质素的合成，在遇到盐胁迫时，会显著上调^［34］。SiCCoAOMT1只起到对甲基化的催化作用。由此可见，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4是木质素合成过程中的重要候选基因。

2.6 谷子SiCCoAOMT家族特异性表达分析

对谷子SiCCoAOMT家族成员特异性表达量进行分析，发现SiCCoAOMT在谷子的不同组织和发育时期中呈偏好性表达。SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4表达模式相似，在谷子组织中有很高的表达量，尤其是在‘xiaomi’的穗和茎中高度表达，与狗尾草SevirCCoAOMT表达模式相似^［22］；在‘晋谷21’的籽粒和根中也有较高的表达量。SiCCoAOMT5在‘晋谷21’的根和籽粒中有较高的表达。SiCCoAOMT1和SiCCoAOMT3在各部位的表达量均小于100，没有显著的表达活性，表明其可能不参与木质素的合成。综上，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4是谷子中木质素生物合成途径最佳的候选基因。

为更直观地体现SiCCoAOMT家族成员在谷子不同组织、发育时期的表达差异，对SiCCoAOMT基因的时空表达模式进行可视化（图6A）。可以发现，在干旱和低温等逆境条件下，谷子SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4对木质素生物合成的调节主要存在于茎秆、根和穗中，这与Ferreira等^［22］对狗尾草SevirCCoAOMT的研究结果一致。谷子根、茎中的木质素合成增加，可以强化其细胞壁，增强其机械强度和抗逆性；谷子穗部木质素合成增加，可以提高籽粒外壳的硬度，有助于抵御真菌等病原体的侵袭，在恶劣环境下保护种子的完整和质量^［35］。因此，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4在谷子木质素生物合成过程中起到关键性作用。

为了验证SiCCoAOMT基因表达数据的准确性，对‘晋谷21’灌浆期S3的籽粒进行了qRT-PCR检测（图6B）。分析显示，在‘晋谷21’灌浆期S3的籽粒中，SiCCoAOMT4基因相对表达量最高（6.1），SiCCoAOMT3相对表达量最低（0.7）。这与转录组分析结果基本一致，qRT-PCR相对定量结果验证了转录组数据分析的可靠性。

2.7 谷子SiCCoAOMT家族非生物胁迫表达分析

为了进一步验证谷子SiCCoAOMT基因抵御非生物胁迫的功能表达，本研究选取‘晋谷21’两叶一心期的幼苗，进行干旱和低温胁迫处理，经3次生物学重复，分析SiCCoAOMT成员受胁迫响应变化情况（图7）。分析发现，干旱胁迫下，SiCCoAOMT2在处理12 h时达到表达峰值（13.8），SiCCoAOMT4也表现出明显上调（图7A）。低温胁迫24 h中，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4表达均逐步上调，其他基因表达则有下调趋势（图7B）。这与上文对SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4特异性表达分析相符。表明SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4受到干旱和低温的诱导表达，在作物抵御非生物胁迫的过程中起到关键作用。SiCCoAOMT5在谷子两叶一心期有较高的表达量，且在干旱胁迫中也有上调趋势，表明SiCCoAOMT5也可能参与非生物胁迫的响应。

2.8 谷子SiCCoAOMT家族单倍型分析

通过对谷子SiCCoAOMT单倍型分析，挖掘其抗逆的自然变异类型^［36］，发现只有在SiCCoAOMT3和SiCCoAOMT5中存在显著的变异差异（图8）。SiCCoAOMT3中，Hap 1、Hap 3和Hap 4与参考基因组一致（图8A）；Hap 2和Hap 5是在4939166 bp处发生A/C变异，在4939482和4940070 bp处发生C/T变异（图8C）。SiCCoAOMT5中，Hap 1和Hap 3与参考基因组一致（图8B），Hap 2和Hap 5在31085051、31085052和31091199 bp处发生C/T变异（图8D），Hap1是主要的单倍型类型，占62.3%。SiCCoAOMT5在‘晋谷21’的根和籽粒中有较高的表达，通过比较不同SiCCoAOMT5单倍型间的籽粒数量、籽粒重量、籽粒硬度表型发现，Hap 1在3种关于籽粒产量相关表型的表现上都显著高于其他表型。qRT-PCR的结果也显示，SiCCoAOMT5在灌浆期S3的籽粒中有较高的表达（图6B）；由此，可推断SiCCoAOMT5可能促进谷子籽粒的生长发育，使其适应在逆境中的成熟与传播。

3 讨论

CCoAOMT基因家族是一种起到催化甲基化作用的甲基转移酶，参与G型木质素甲基化，调节木质素生物合成中的相关基因表达，能够使植物的韧性和机械强度增强，进而在植物相应非生物胁迫过程中起重要作用^［37］。本研究对谷子SiCCoAOMT基因家族进行系统分析，共鉴定到5个SiCCoAOMT基因。将谷子SiCCoAOMT与已报道的水稻、狗尾草和拟南芥中的CCoAOMT家族进行比较分析，各物种中CCoAOMT家族成员数目相近，构建进化树被分为2个亚族，这与Ferreira等^［22］的研究结果一致。理化性质分析显示，除了SiCCoAOMT5外，各物种CCoAOMT家族序列氨基酸数目接近（202~352），等电点范围为4.93~9.08。亚细胞定位分析结果显示，CCoAOMT家族成员大部分分布在细胞质、叶绿体中，只有个别成员也分布在线粒体和细胞核，这与前人的研究一致，例如刺梨（Rosa roxburghii）RrCCoAOMT^［38］、紫花苜蓿（Medicago sativa）MsCCoAOMT^［39］均定位在细胞质、叶绿体。染色体定位显示，SiCCoAOMT家族成员在谷子染色体两端分布，与狗尾草SevirCCoAOMT基因在染色体上的分布类似；不同的是，在6号染色体上，SiCCoAOMT的个数比SevirCCoAOMT少1个。在计算谷子、水稻和狗尾草CCoAOMT家族的共线性基因对K_a/K_s 值时，发现SiCCoAOMT3与Sevir.6G056900的K_a/K_s 值小于1（K_a/K_s =0.725），谷子与狗尾草之间存在纯化选择，由此可能造成SiCCoAOMT的个数比SevirCCoAOMT少1个；谷子和水稻共线性基因对K_a/K_s >1，说明SiCCoAOMT受到正选择效应，SiCCoAOMT比OsCCoAOMT更加适应抗逆的调控。

CCoAOMT基因家族成员均包含相同的蛋白保守结构域（motif 1、motif 2、motif 4、motif 5和motif 6），同一亚族的成员具有相似的motif，且排列顺序也接近。顺式作用元件预测中，ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif在SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4中分布较多，这3种植物激素应答元件可以间接影响SiCCoAOMT的表达，促进木质素合成，以增强植物对非生物胁迫的防御；谷子、水稻、狗尾草和拟南芥CCoAOMT家族的顺式作用元件组成相似，这些基因可能在功能调控上也具有相似性：Ferreira等^［22］对狗尾草的研究结果表明，狗尾草SevirCCoAOMT2和SevirCCoAOMT4在非生物胁迫应答中起到关键作用，说明SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4是抵御非生物胁迫的重要候选基因。

谷子SiCCoAOMT基因家族KEGG分析结果注释到黄酮类物质生物合成途径等过程，这与彭赛男等^［40］的研究结果一致：CCoAOMT在O-甲基化类黄酮的生物合成中起到重要作用。通过特异性表达分析发现，SiCCoAOMT2、SiCCoAOMT4在谷子的叶、茎和穗中高度表达。在已有的研究中，水稻OsCCoAOMT家族基因OsCCoAOMT1在水稻的茎和叶中均高度表达，在促进茎的伸长、营养运输方面发挥重要作用^［41］，狗尾草SevirCCoAOMT2和SevirCCoAOMT4在茎和节间中高度表达，在木质素合成过程中起到关键作用^［22］，而SiCCoAOMT2、SiCCoAOMT4与其表达模式相似且有共线性关系，支持了它们在木质素生物合成中的潜在作用。

‘晋谷21’非生物胁迫下的转录组数据表明，SiCCoAOMT家族基因能响应干旱和低温等非生物胁迫，尤其是SiCCoAOMT2、SiCCoAOMT4在非生物胁迫诱导下表达量显著提高，说明谷子在干旱和低温胁迫的响应中，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4起到了主要作用，这与Rakoczy等^［42］对高粱（Sorghum bicolor）SbCCoAOMT的研究一致。另外，在拟南芥AtCCoAOMT基因家族的研究中发现，病原体或激发因子可以诱导AtCCoAOMT1基因，其在抗逆功能中起到重要作用^［43］。因此，今后可以对谷子SiCCoAOMT基因家族的抗逆作用进行进一步研究。

4 结论

对谷子SiCCoAOMT基因家族进行鉴定和分析，共鉴定到5个SiCCoAOMT基因，定位于第2、4和6号染色体，编码蛋白的理化性质差异明显；系统发育分析将谷子SiCCoAOMT基因与拟南芥、水稻和狗尾草的同源基因划分为2个亚族，且4个物种的CCoAOMT基因家族成员均包含相同的蛋白结构保守域（motif 1、motif 2、motif 4、motif 5和motif 6）。谷子与水稻、狗尾草共线性基因对分析中发现，谷子和狗尾草CCoAOMT受到中性选择的同时，还存在纯化选择；谷子与水稻CCoAOMT之间存在正选择效应。加权基因共表达网络分析发现，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4被划分在yellowgreen模块中。进一步研究其表达模式，发现SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4可能在调节茎秆生长、籽粒大小和谷穗发育中具有重要作用。非生物胁迫研究中，SiCCoAOMT2和SiCCoAOMT4在干旱和低温胁迫下，表达量明显上调，是谷子响应干旱和低温胁迫的关键基因。单倍型分析发现SiCCoAOMT5有利于谷子籽粒的生长发育，对谷子产量提高和抵抗胁迫起到一定的作用，还需要后续试验对其抗逆作用进行进一步验证。本研究揭示了SiCCoAOMT家族基因在调节谷子茎秆结构强度、逆境响应中的潜在作用，丰富了对谷子基因组的理解。然而，仍需进行进一步的功能验证，如在不同环境条件下SiCCoAOMT家族基因的抗逆功能和其在木质素合成中的分子作用机制^［44］。

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基金资助

国家自然科学基金联合基金项目(U21A20216)

山西省研究生教育创新计划科研创新项目(2024KY699)