不同龄级瑞香狼毒根系周围微生物群落结构的空间差异研究

Spatial differences in microbial communities around the root system of Stellera chamaejasme plants of different ages

摘要

瑞香狼毒是青藏高原草地生态系统中具有双重特性的关键物种。为了探究不同龄级瑞香狼毒对根际及其周围土壤微生物的多样性及群落结构的影响，本研究于2024年8月在青海省海南藏族自治州高寒草甸进行野外采样。选择Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ这3个龄级瑞香狼毒，在水平距离0（根际）、30（近根区）、50 cm（远根区）和垂直深度10和20 cm处采集土壤样品，每处理3个生物学重复，共54份样品。采用宏基因组测序技术分别对16S rRNA和ITS区域进行细菌和真菌群落分析。结果表明：随着瑞香狼毒龄级提高，根际及周围土壤的细菌和真菌物种数量及潜在物种丰富度显著增加（P<0.05）；采样位点和植物龄级极显著影响土壤微生物群落结构（P<0.001），其中细菌群落对空间变化的响应尤为显著。水平维度上，10 cm深度时Ⅲ龄级根际细菌多样性显著高于近根区和远根区（P<0.05）；真菌多样性受采样距离影响不显著。垂直维度上，20 cm时根际细菌α多样性指数极显著低于10 cm深度（P<0.01），但在近根区和远根区，不同深度的细菌和真菌多样性差异不明显。此外，各空间差异下优势菌门稳定，优势细菌门类包括变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门等，优势真菌门为子囊菌门、担子菌门等，但优势菌属的相对丰度存在明显差异。由此可见，瑞香狼毒对土壤中细菌丰度和多样性的影响根据其龄级、土壤深度、水平距离而表现不同，瑞香狼毒对土壤中真菌多样性无显著影响。在根际区域，土壤深度对细菌多样性具有显著影响，表明瑞香狼毒与土壤环境因子共同调控微生物群落结构。研究通过整合瑞香狼毒根际及周围土壤微生物多样性数据，首次构建了瑞香狼毒与土壤微生物互作的三维空间模型，为解析毒害植物-微生物协同进化机制提供了新的理论框架。

Abstract

Stellera chamaejasme is a keystone species with dual ecological characteristics in the Qinghai-Tibet Plateau grassland ecosystem. The aim of this study was to investigate the effects of the age of S. chamaejasme on the diversity and community structure of microorganisms in its rhizosphere and surrounding soil. Field sampling was conducted in alpine meadows in Hainan Tibetan Autonomous Prefecture， Qinghai Province， in August 2024. Three age classes （III， IV， and V） of S. chamaejasme were selected， with soil samples collected at horizontal distances of 0 cm （rhizosphere）， 30 cm （near-root zone）， and 50 cm （far-root zone）， and at vertical depths of 10 and 20 cm. Each treatment included three biological replicates， totaling 54 samples. Metagenomic sequencing targeting 16S rRNA and ITS regions was conducted to analyze bacterial and fungal communities， respectively. The results show that the bacterial and fungal species richness and potential diversity in rhizosphere and surrounding soils significantly increased as the age of S. chamaejasme increased （P<0.05）. Both sampling location and plant age class significantly influenced soil microbial community structures （P<0.001）， with bacterial communities exhibiting particularly pronounced responses to spatial variations. Within the horizontal plane at 10 cm depth， bacterial diversity in the soil of age class III S. chamaejasme was significantly higher in the rhizosphere than in the near-root and far-root zones （P<0.05）， while fungal diversity was unaffected by sampling distance. On the vertical plane， bacterial α-diversity indices in the rhizosphere were significantly lower at 20 cm depth than at 10 cm depth （P<0.01）， whereas in near-root and far-root zones， neither bacterial diversity nor fungal diversity showed marked differences between depths. The dominant phyla remained stable across spatial gradients， with Proteobacteria， Chloroflexi， and Acidobacteria as the predominant bacterial phyla， and Ascomycota and Basidiomycota as the dominant fungal phyla， although the relative abundance of dominant genera varied considerably among sampling positions. Consequently， the effects of S. chamaejasme on soil bacterial abundance and diversity varied according to the age class of the plant， soil depth， and horizontal distance， whereas fungal diversity remained largely unaffected by these factors. In the rhizosphere zone， soil depth significantly influenced bacterial diversity， indicating that S. chamaejasme and soil environmental factors jointly regulate microbial community structure. By integrating data on the microbial diversity in the rhizosphere and surrounding soil， this study pioneers the construction of a three-dimensional spatial model of S. chamaejasme-soil microorganism interactions. This provides a novel theoretical framework for elucidating co-evolutionary mechanisms between poisonous plants and soil microorganisms.

Graphical abstract

关键词

瑞香狼毒 / 龄级 / 根际微生物 / 宏基因组 / 多样性

Key words

Stellera chamaejasme / age class / rhizosphere microorganisms / metagenomic / diversity

作为瑞香科瑞香狼毒属（Stellera）的多年生草本植物，瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）主要分布于我国东北、华北、青藏高原及内蒙古高原等海拔2600~4200 m的高山草甸生态系统^［1-2］。该植物具有独特的生态双重性：其根部分泌的化感物质（如黄酮类、萜类化合物）能显著抑制黑麦草（Lolium perenne）等伴生植物的生长，导致草地生产力下降^［3］；同时通过形成肥力岛效应^［4］，使根际土壤有机质含量提升18%~23%，微生物生物量碳、氮分别增加31.5%和27.8%，显著改变土壤养分循环格局^［5］。

土壤微生物作为土壤生态系统的核心成员，在矿质养分循环、有机质分解、土壤结构构建及毒害物质清除等方面发挥着至关重要的作用，是维护土壤肥力和生态系统健康的关键^［6］。这些微生物种类繁多，包括细菌、真菌、放线菌及藻类等，其分布与数量随土壤深度的变化而有所差异，并受到气候、植被类型及土壤湿度等环境因素的共同调节^［7］。土壤微生物群落由原核生物（细菌）和真核生物（真菌）组成，它们在生态系统功能中扮演不同角色。细菌具有快速生长和对环境变化敏感的特点，主要参与养分循环的初级过程；而真菌通过菌丝网络进行养分传输，在有机质分解中发挥主导作用^［7］。比较这两类微生物对瑞香狼毒的响应差异，有助于理解植物如何通过不同机制调控土壤生态系统功能。前期研究表明，毒害植物可能对细菌和真菌产生差异化影响，但瑞香狼毒对这两类微生物的具体调控机制尚不清楚^［8-9］。瑞香狼毒对土壤微生物群落的影响显著且复杂。研究指出，它能通过增加土壤有机质和微生物生物量、加速氮循环、提高微生物呼吸速率等途径，促进微生物群落和土壤真菌的多样性^［10-11］。尽管瑞香狼毒对重金属降解的直接作用尚不明朗，但其对微生物群落和养分循环的影响可能与重金属的迁移和转化存在间接联系^［12］。然而，也有研究认为瑞香狼毒的生长可能减缓根际土壤营养元素的循环，导致土壤肥力下降，微生物数量减少且活性降低，这被视为瑞香狼毒草地土壤退化的一个潜在原因^［4，13］。目前，关于瑞香狼毒对土壤及土壤微生物的影响，学界尚未达成共识。

鉴于此，本研究选择青藏高原地区不同龄级的野生瑞香狼毒，采用宏基因组测序技术，对其根际及周围不同深度土壤中的微生物种类、分布及多样性进行系统而深入的分析，旨在揭示瑞香狼毒对土壤微生物的潜在影响，这些发现可能为阐释毒害植物-微生物协同进化机制提供新的理论框架。

1 材料与方法

1.1 土壤样本采集

本研究在青藏高原高寒草甸生态系统典型区域（青海省海南藏族自治州青海湖东南侧，36°32′13.87″ N，100°36′32.57″ E，海拔3250 m）开展系统性采样。具体采样时间为2024年8月18-20日。采样前一周内有较少雨水，采样地为瑞香狼毒旺盛草地，附近无动物迁移。于晴天上午10：00-12：00取样。为确保样本代表性，本研究选择地势平坦、植被均匀、无明显干扰的样地，每个龄级选择3株长势一致的植株，株间距离大于10 m。试验采用三维空间采样矩阵设计：以Ⅲ、Ⅳ和V龄级（年龄结构划分方法参考郭丽珠等^［14］的方法）瑞香狼毒植株为采样核心，建立0（根际区）、30（近根区）和50 cm（远根区）的水平梯度，结合10和20 cm的垂直梯度，构成3龄级×3距离×2深度的立体采样网络（图1）。每个样点设置3个生物学重复，共获取54份土壤样本用于微生物分析，具体采样分组见表1。土壤为高寒草甸土，采样工具为不锈钢取土器。土壤采样严格按照国家土壤质量标准进行，采用多点混合采样法，采集后装入自封袋备用。所有样本于采集后立即放入液氮速冻，24 h内转移至实验室-80 ℃冰箱保存。

1.2 土壤样本处理和微生物总DNA提取

土壤样本进行前处理包括过滤、压碎、加水润湿。之后称取0.4 g使用PowerSoil DNA提取试剂盒（MOBIO DNeasy PowerSoil Kit， #47014， MoBio Laboratories， Inc.，美国）按照说明书进行DNA提取。

1.3 宏基因组测序及分析

土壤微生物提取的总DNA经过浓度测定，加上测序接头，在Illumina NovaSeq测序平台进行宏基因组测序。测序得到的原始序列利用Trimmomatic进行质控，去除长度小于50 bp和平均碱基质量值低于20的序列，利用

Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体。利用Usearch（vsesion 10http：//drive5.com/uparse/）软件进行操作分类单元（operational taxonomic unit， OTU）聚类分析。采用线性判别分析效应大小（linear discriminant analysis effect size， LefSe）分析识别各组间差异显著的生物标志类群，以线性判别分析（linear discriminant analysis， LDA）得分>2.0作为筛选标准。

1.4 数据分析

使用SPSS 23.0对数据进行方差分析、多重比较分析（Tukey HSD检验）。根据群落组成数据，分别计算Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指数、ACE指数和Chao1多样性指数。使用R语言工具进行绘图和主成分分析（principal component analysis， PCA）。

2 结果与分析

2.1 不同龄级瑞香狼毒根际及周围微生物群落结构差异分析

2.1.1 扩增子测序数据统计

本研究以不同龄级的瑞香狼毒根际及周围土壤为试验材料，通过宏基因组测序分析土壤微生物群落特征及其差异。结果获得细菌有效序列平均值为456036.29条，真菌有效序列平均值为485070条。经质量控制与聚类分析，各处理下平均得到19224.23个细菌OTU以及5436.24个真菌OTU（表1）。

2.1.2 不同龄级瑞香狼毒根际及周围微生物群落α多样性及组成分析

对于细菌，从图2a中OTU数目、ACE指数、Chao1指数3个指标来看，随着取样距离与深度的改变，不同龄级瑞香狼毒根际土壤微生物细菌多样性表现出显著的差异。对于根际微生物（ABC₁₂₃-1，图2a），Ⅴ龄级细菌OTU数目与Chao1指数显著高于Ⅲ龄级。在近根区、深度20 cm的点位下（ABC₁₂₃-4，图2a），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ龄级间的OTU数目、ACE以及Chao1指数均差异显著，而Shannon-Wiener指数在不同龄级间无显著差异。真菌的OTU数目、ACE指数、Chao1指数和Shannon-Wiener指数4个指标结果显示（图2b），Ⅳ龄级与Ⅴ龄级根际微生物（ABC₁₂₃-1，图2b）以及在远根区深度10 cm点位下（ABC₁₂₃-5，图2b）的真菌α多样性显著高于Ⅲ龄级。以上结果说明，随着龄级提高，根际及周围环境中的细菌和真菌物种数量和潜在物种丰富度随之提升。

2.1.3 不同龄级瑞香狼毒根际及周围微生物菌属组成分析

不同龄级瑞香狼毒根际及周围细菌与真菌组成如图3和图4所示。不同龄级瑞香狼毒根际及周围细菌菌属间，相对丰度排名前5的优势菌属均为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Acidobacteria_norank、RB41、Anaerolineaceae_uncultured、Gemmatimonadaceae_uncultured，各龄级瑞香狼毒根际及周围的优势细菌菌属种类相似，相对丰度差异不明显（图3）。而在真菌菌属中，相对丰度排名前5的优势菌属均为Ascomycota_unclassified、被孢霉属（Mortierella）、Fungi_unclassified、湿伞菌属（Hygrocybe）、古根菌属（Archaeorhizomyces）。随着龄级的提高，10 cm深度下的根际微生物细菌丰度差异不明显，真菌菌属拟珊瑚菌属（Ramariopsis）和毛孢菌属（Chaetospermum）在Ⅲ龄级瑞香狼毒中占比较高，Agaricomycetes_unclassified在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4a）。随着采样深度的加深，不同龄级间真菌菌属发生变化，20 cm深度下，根际真菌菌属Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified和拟珊瑚菌属（Ramariopsis）在Ⅲ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高，Agaricomycetes_unclassified在Ⅳ龄级瑞香狼毒中丰度较高，而古根菌属（Archaeorhizomyces）和瓶霉属（Phialophora）在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4b）。近根区、深度10 cm的点位下，Pyronemataceae_unidentified和Agaricaceae_unclassified在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4c）。近根区、深度20 cm的点位下，赤霉菌属（Gibberella）在Ⅲ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高，湿伞菌属（Hygrocybe）在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4d）。远根区、深度10 cm的点位下，Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified在Ⅲ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高，湿伞菌属（Hygrocybe）和杯伞菌属（Cuphophyllus）在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4e）。远根区、深度20 cm的点位下，Fungi_unclassified在Ⅳ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高，湿伞菌属（Hygrocybe）在Ⅴ龄级瑞香狼毒中相对丰度较高（图4f）。

总体来看，各采样位点的瑞香狼毒根际及周围细菌和真菌优势物种种类无明显差异，优势细菌门类为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等；优势真菌门类为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、Fungi_unclassified。优势门和种属的相对丰度存在差异。10和20 cm深度对比，瑞香狼毒根际相对丰度最高的细菌菌属由鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）变为Gemmatimonadaceae_uncultured，分属不同菌门（图5a，b），真菌菌属相对丰度差异不大（图6）；在近根区，10和20 cm深度对比，相对丰度最高的细菌菌属由鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）变为RB41，分属不同菌门，真菌菌属相对丰度差异不大（图6）；在远根区，10和20 cm深度对比，相对丰度最高的细菌和真菌菌属没有变化（图6）。相同采样深度下，对不同采样水平距离的瑞香狼毒根际和周围优势菌属对比发现：10 cm采样深度下，根际区和近根区相对丰度最高的细菌菌属均为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），而远根区为Anaerolineaceae_uncultured，分属不同菌门；20 cm采样深度下，根际区、近根区、远根区相对丰度最高的细菌菌属分别为Gemmatimonadaceae_uncultured、RB41和Anaerolineaceae_uncultured，三者分属不同菌门。相同采样深度下，不同采样水平距离的瑞香狼毒根际和周围优势真菌菌属没有明显差异。

2.1.4 不同龄级瑞香狼毒根际及周围微生物LefSe分析

如图7所示，LDA>2条件下不同龄级瑞香狼毒根际及周围细菌和真菌构成均存在差异。在根际区，深度10 cm采样位点下，细菌在Ⅲ龄级和Ⅳ龄级间存在差异（图7a），真菌在Ⅳ龄级和Ⅴ龄级间存在差异（图7g）；在根际区，深度20 cm采样位点下（Group2），3个龄级间细菌均存在差异（图7b），真菌只在Ⅲ龄级和Ⅴ龄级间存在差异（图7h）；在近根区，深度10和20 cm，远根区，深度20 cm下，细菌和真菌在3个龄级间均存在差异；在远根区，深度10 cm下，细菌在Ⅲ龄级和Ⅳ龄级间存在差异，真菌在3个龄级间均存在差异。各龄级瑞香狼毒在不同采样位点下的差异细菌和真菌菌属完全不同，说明采样位点和瑞香狼毒龄级对细菌和真菌间的差异均带来了明显影响。

2.2 不同采样深度和水平距离下各龄级瑞香狼毒根际及周围微生物群落结构的差异分析

2.2.1 不同采样水平距离下各龄级瑞香狼毒根际及周围微生物群落α多样性及组成分析

对于细菌群落，从图8中OTU数目、ACE指数、Chao1指数3个指标来看，采样深度为10 cm，Ⅳ龄级瑞香狼毒根际区、近根区、远根区的细菌多样性差异显著，根际区和远根区的细菌多样性显著高于近根区采样点（图8）。另外，即采样深度为10 cm，Ⅲ龄级瑞香狼毒根际区、近根区、远根区间Chao1指数差异显著，近根区和远根区的Chao1指数显著高于根际区（图8）。对于Ⅴ龄级瑞香狼毒，采样距离对细菌多样性无显著影响。采样深度为20 cm时，采样距离对各龄级瑞香狼毒周围细菌多样性也无显著影响。而各深度下，采样距离对各龄级瑞香狼毒周围真菌的多样性均无显著影响。

不同采样水平距离各龄级瑞香狼毒根际及周围细菌与真菌组成如图9和图10所示。不同龄级瑞香狼毒根际及周围细菌菌属间，相对丰度排名前5的优势菌属均为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Acidobacteria_norank、RB41、Anaerolineaceae_uncultured、Gemmatimonadaceae_uncultured，各采样地点下不同龄级瑞香狼毒间细菌菌属差异不大（图9）。而在真菌菌属中，相对丰度排名前5的优势菌属均为Ascomycota_unclassified、被孢霉属（Mortierella）、Fungi_unclassified、湿伞菌属（Hygrocybe）、古根菌属（Archaeorhizomyces）（图10）。在10 cm深度下，古根菌属在Ⅲ龄级瑞香狼毒根际区占比较高，Agaricomycetes_unclassified、Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified和毛孢菌属（Chaetospermum）在近根区占比较高，而被孢霉属（Mortierella）和Fungi_unclassified在远根区占比较高（图10a）；10 cm深度下，Ⅳ龄级瑞香狼毒真菌菌属相对丰度在不同水平采样位点无差异（图10b）；在10 cm深度下，Pyronemataceae_unidentified菌属在Ⅴ龄级瑞香狼毒根际处占比较高，Agaricomycetes_unclassified在近根区占比较高（图10c）。在20 cm深度下，古根菌属在Ⅲ龄级瑞香狼毒根际处占比较高，赤霉菌属（Gibberella）和Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified在近根区占比较高，而Agaricales_unclassified在远根区占比较高（图10d）；20 cm深度下，Agaricomycetes_unclassified在近根区占比较高，而古根菌属在远根区占比较高（图10e）；20 cm深度下，瓶霉属（Phialophora）在Ⅴ龄级瑞香狼毒远根区占比较高，其他无明显差异（图10f）。

2.2.2 不同龄级瑞香狼毒根际及周围优势物种群落组成差异分析

总体来看（图11和图12），不同深度下各龄级瑞香狼毒根际及周围细菌和真菌优势物种种类无明显差异，优势细菌门类为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等；优势真菌门类为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、Fungi_unclassified。而优势门和种属的相对丰度存在差异。10 cm深度下，Ⅲ龄级和Ⅳ龄级瑞香狼毒相对丰度最高的细菌菌属均为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），而Ⅴ龄级为RB41，分属不同菌门（图11a~c），真菌菌属相对丰度最高的均为Ascomycota_unclassified（图12a~c）；20 cm深度下，Ⅲ龄级和Ⅴ龄级瑞香狼毒相对丰度最高的细菌菌属均为RB41，而Ⅳ龄级为Gemmatimonadaceae_uncultured，分属不同菌门（图11d~f），真菌菌属相对丰度最高的均为Ascomycota_unclassified（图12d~f）。

2.2.3 不同水平距离下LefSe分析

LDA>2条件下不同水平距离下土壤细菌和真菌均存在差异。由图13可以看出，近根区和远根区的细菌在各深度和各龄级下均存在差异；而根际区只在部分深度和龄级下存在差异菌属，具体为10 cm深度下的Ⅳ龄级土壤（图13b）和20 cm深度下的Ⅴ龄级土壤（图13l）。对于真菌，基本上各水平距离在不同深度和不同龄级下均存在差异，除了10 cm深度下，只有近根区和远根区存在差异真菌菌属（图13i）。该结果表明不同采样水平距离下存在明显差异的细菌和真菌菌属，且近根区和远根区间差异更为明显。

2.2.4 不同采样深度下各龄级瑞香狼毒根际及周围微生物群落α多样性及组成分析

图14显示了具有显著差异的细菌α多样性指标。从OTU数目、ACE指数、Chao1指数和Shannon-Wiener指数4个指标来看，分组13~15中即根际区，各龄级瑞香狼毒土壤10和20 cm深度的细菌多样性存在显著差异，20 cm深度的细菌α多样性显著低于10 cm深度（图14a）。而分组16~18中即近根区，各龄级瑞香狼毒根际土壤10和20 cm深度的细菌多样性没有显著差异。分组19~21中即远根区，只有Ⅴ龄级瑞香狼毒根际土壤10和20 cm深度的细菌多样性存在显著差异（Chao1指数、ACE指数和Shannon-Wiener指数），20 cm深度的细菌α多样性显著低于10 cm深度（图14b）。

不同采样深度下各龄级瑞香狼毒根际及周围细菌与真菌组成如图15和图16所示。不同龄级瑞香狼毒根际及周围细菌菌属间，相对丰度排名前5的优势菌属均为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Acidobacteria_norank、RB41、Anaerolineaceae_uncultured、Gemmatimonadaceae_uncultured（图15）。而在真菌菌属中，相对丰度排名前5的优势菌属均为Ascomycota_unclassified、被孢霉属（Mortierella）、Fungi_unclassified、湿伞菌属（Hygrocybe）、古根菌属（Archaeorhizomyces）（图16）。对于细菌菌属，除Ⅴ龄级瑞香狼毒在根际区和近根区，与10 cm深度相比，RB41菌属在20 cm深度下丰度降低（图15c），Acidobacteria_norank在20 cm深度下丰度升高外（图15f），其余均无明显变化（图15）。对于真菌菌属，不同深度下差异较大。在Ⅲ龄级瑞香狼毒根际区，古根菌属和毛孢菌属（Chaetospermum）在10 cm深度下占比较高，Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified在20 cm深度下占比较高（图16a）；在近根区，古根菌属和Fungi_unclassified在10 cm深度下占比较高，而Geoglossales_unidentified和Xylariaceae_unclassified在20 cm深度下占比较高（图16d）；在远根区，Pleosporales_fam_Incertae_sedis_unclassified在10 cm深度下占比高于20 cm（图16g）。对于Ⅳ龄级瑞香狼毒，深度对真菌菌属的相对丰度没有明显影响（图16b，e，h）。对于Ⅴ龄级瑞香狼毒根际区，Agaricomycetes_unclassified在10 cm深度下占比较高，瓶霉属（Phialophora）在20 cm深度下占比较高（图16c）；在近根区，Agaricaceae_unclassified和Pyronemataceae_unidentified在10 cm深度下占比高于20 cm（图16f）；在远根区，Agaricomycetes_unclassified和杯伞菌属（Cuphophyllus）在10 cm深度下占比高于20 cm（图16i）。

2.2.5 不同采样深度下LefSe分析

LDA>2条件下不同采样深度土壤细菌和真菌无差异菌属（图17）。该结果表明不同采样深度只影响细菌和真菌的相对丰度，而不影响菌属的种类。

3 讨论

瑞香狼毒作为青藏高原草地生态系统的关键毒害植物，展现出显著的生态双重性：其生物活性成分在杀虫灭菌领域具有开发潜力^［15］，但过度扩散会威胁草地畜牧业的可持续性。另外有研究表明瑞香狼毒对土壤有机质和土壤微生物多样性造成影响^［16］。本研究通过多尺度分析揭示了该植物对土壤微生物的复杂调控机制。

3.1 瑞香狼毒龄级对根际及周围微生物的影响

本研究结果表明，随着瑞香狼毒龄级增长，根际及周围环境中的细菌和真菌物种数量和潜在物种丰富度随之提升。这一现象可能与瑞香狼毒随龄级增长的根系发育状况密切相关。瑞香狼毒根系能够渗透到土壤中7~30 cm，根系长度随着龄级的增长而增加。高龄级植物拥有更发达的根系结构，能够产生更多的根系分泌物和化感物质，从而影响更大范围的土壤环境^［17-18］。同时，瑞香狼毒的“肥力岛效应”使根际土壤有机质含量提升18%~23%，微生物生物量碳、氮分别增加31.5%和27.8%^［5］。这种土壤养分的富集为微生物生长提供了物质基础，因此，高龄级植物由于根系更发达，根系分泌物更丰富，能够为土壤微生物提供更多的碳源和能源，从而支持更高的微生物多样性。当然，不同龄级植物的代谢特征和根系分泌物成分差异可能导致土壤pH、有效氮、有效磷等理化性质的变化，进而选择性地促进或抑制特定微生物类群的生长。

LefSe分析进一步证实，各龄级瑞香狼毒在不同采样位点下的差异细菌和真菌菌属完全不同，说明瑞香狼毒龄级对微生物群落构成具有特异性调控作用。与崔雪等^［10］关于高密度瑞香狼毒根际土壤中微生物多样性高于低密度的结果一致，表明瑞香狼毒不仅通过密度，还可能通过龄级结构调控土壤微生物多样性，这种调控机制可能涉及植物次生代谢产物的定量和定性变化。

3.2 水平距离对瑞香狼毒根际及周围微生物的影响

本研究发现10 cm深度下，Ⅲ龄级和Ⅳ龄级瑞香狼毒根际区和近根区、远根区的细菌多样性存在显著差异，而Ⅴ龄级瑞香狼毒不同采样距离间细菌多样性无显著差异。这表明植物龄级与水平距离之间存在交互作用，龄级越高，微生物群落的根际效应空间范围可能越广。这种空间格局与土壤特性的梯度变化密切相关。根际区土壤由于直接接受根系分泌物，有机质含量高，C/N适宜，为微生物生长提供了良好的条件。随着与根系距离的增加，根系分泌物浓度降低，土壤有机质含量下降，导致微生物群落结构发生梯度变化。Ⅴ龄级植株由于根系更发达，根系分泌物的影响范围更广，可能导致不同水平距离间土壤性质差异减小，从而使微生物多样性差异不显著。

本研究发现Ⅲ龄级和Ⅳ龄级瑞香狼毒根际与非根际土壤微生物中细菌差异显著，而Ⅴ龄级差异不显著；各龄级真菌差异均不显著，这与周攀^［19］的研究结果相反。这种差异可能反映了不同地区瑞香狼毒种群的生化特性存在变异，或者与环境因素如气候、土壤理化性质等交互作用有关。根际区细菌群落对瑞香狼毒的响应程度高于真菌，这可能是由于细菌生长周期短，对环境变化的响应更为敏感。而真菌菌丝体网络分布广泛，对局部干扰的抵抗力可能更强。

LefSe分析表明不同采样水平距离下存在差异显著的细菌和真菌菌属，且近根区和远根区间差异更明显。这可能反映了根系分泌物的“浓度梯度效应”，即随着与根系距离的增加，化感物质和营养物质的浓度逐渐降低，导致微生物群落结构发生梯度变化。这种空间异质性对理解瑞香狼毒的扩散机制和生态影响具有重要意义。

3.3 垂直深度对瑞香狼毒根际及周围微生物的影响

研究结果显示，各龄级瑞香狼毒根际土壤10 cm深度的细菌α多样性显著高于20 cm，而在近根区和远根区，土壤深度对细菌和真菌的多样性影响较小。这种空间异质性提示土壤深度对微生物群落的调控强度在根际区最为显著，可能是因为表层土壤氧气充足、养分丰富，微生物活性更高。这一发现与Banerjee等^［20］的研究结果一致，即土壤细菌和真菌的丰度和多样性随土壤深度提高显著下降，深度为10 cm处微生物多样性最高。土壤深度对微生物丰度、多样性、分类组成和群落结构的影响在某些情况下可能超越植物本身。Tao等^［21］的研究也发现种植豆科作物处理组的固氮基因和固氮微生物相对丰度仅在表层土中显著高于种植非豆科作物处理组，进一步证明了土壤深度的主导作用。

不同深度下优势菌属种类没有明显差异，但菌属丰度存在差异，尤以真菌菌属丰度差异较大。这可能反映了不同功能菌群对土壤垂直梯度的生态位分化，如氧气浓度、水分含量和营养物质分布的垂直差异导致的微生物功能群组分化^［22］。

3.4 微生物群落组成特征及其与土壤特性的关系

本研究发现，各采样点土壤中变形菌门占据优势地位，其次是酸杆菌门，这一发现与其他研究结论相吻合^［4］。变形菌门因其能够产生次生代谢物，有效抑制病原微生物的生长，从而成为土壤中的优势菌群。在真菌方面，子囊菌门为各采样点的优势菌群，担子菌门次之。子囊菌门在酸碱度各异的土壤环境中均能广泛生存，是土壤中最为丰富的真菌类群，本研究结果也证实了这一点。瑞香狼毒通过改变土壤理化性质，如提高有机质含量、改变pH、增加有效养分等，创造了有利于特定微生物类群生长的环境条件。这些优势菌群在土壤有机质分解和养分循环中扮演重要角色^［22］，进一步影响土壤肥力和生态系统功能。

朱文琰等^［23］前期研究表明，瑞香狼毒对土壤化学计量特征具有显著影响。随着瑞香狼毒龄级的增长，狼毒斑块内土壤的全碳含量呈逐渐上升的趋势，土壤全氮含量先上升后下降，而土壤全磷含量则呈逐渐降低的趋势；土壤的碳氮比呈先降低后上升的趋势，而碳磷比和氮磷比则呈持续上升的趋势。本研究发现的微生物群落结构变化与这些土壤理化性质的变化存在密切联系。土壤养分状况是影响微生物群落组成的关键因素，瑞香狼毒通过改变土壤碳氮磷比例，可能影响土壤微生物的营养供给，进而导致微生物群落结构的改变。特别是土壤氮磷比的增加可能反映了土壤磷素限制的加剧，这可能是导致不同龄级瑞香狼毒根际微生物群落结构差异的重要原因之一。

本研究存在一定局限性：1）采样仅在8月进行，未考虑季节变化；2）研究地点局限于单一生态系统。未来研究应结合土壤理化性质的同步测定、多季节采样和多生态系统比较，深入探讨土壤养分与微生物群落的互作机制，以提高结论的普适性。

4 结论

本研究采用高通量测序技术探究了瑞香狼毒根际土壤微生物群落特征，经严格质控后获得了充足的细菌和真菌有效序列数据。OTU聚类与分析结果显示样本微生物多样性覆盖全面，数据质量可靠。基于此，得出以下结论：

1）随着取样距离与深度的改变，瑞香狼毒根际及周围环境中的细菌和真菌物种数量和潜在物种丰富度随着龄级增长而提升，采样位点和瑞香狼毒龄级对细菌和真菌的差异均有显著影响。

2）采样深度为10 cm，Ⅲ和Ⅳ龄级瑞香狼毒根际区、近根区和远根区的细菌多样性差异显著，而Ⅴ龄级瑞香狼毒不同采样距离对细菌多样性无显著影响。各采样深度下，采样距离对各龄级瑞香狼毒周围真菌的多样性均无显著影响。在各采样深度下各龄级瑞香狼毒根际及周围细菌和真菌优势物种种类无明显差异，但优势门和种属的相对丰度存在差异。

3）根际区，相同龄级不同深度土壤中细菌多样性存在显著差异；而在近根区和远根区，土壤深度对细菌和真菌的多样性影响较小。不同深度下优势菌属种类没有明显差异，但菌属丰度存在差异，特别是真菌菌属丰度差异较大。

本研究揭示了瑞香狼毒通过多维调控机制影响其根际土壤微生物群落的分布格局与功能特征。研究表明，植株龄级、根系水平距离及土壤垂直深度构成了一个复杂的空间异质性框架，共同塑造了微生物群落的组成与多样性。这种多尺度的调控效应呈现出显著的龄级特异性，反映了植物-微生物互作系统长期协同演化的结果。本研究为理解瑞香狼毒在草地生态系统中的入侵与扩散机制提供了微生物学视角的解释。未来研究应着重探究：瑞香狼毒根系分泌物的化学组成与土壤微生物功能之间的因果关系；微生物群落结构变化如何反馈调节瑞香狼毒的生长动态与扩散潜力；不同环境因子如何调节这一植物-微生物互作网络，这将为草地生态系统的可持续管理与生物多样性保护提供重要的科学依据。

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基金资助

省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室开放研究项目(2022-KF-10)

青海省重点研发与转化计划项目(219-NK-173)

青海省帅才科学家项目(2024-SF-102)