新疆大叶苜蓿PYL-PP2C-SnRK2基因家族鉴定及对干旱胁迫的响应分析

Genome-wide identification of PYL-PP2C-SnRK2 gene family members in Medicago sativa ‘Xinjiangdaye’ and their transcript profiles under drought stress

摘要

全球气候变暖导致干旱加剧，严重影响着牧草产业的可持续发展。PYL-PP2C-SnRK2是ABA信号转导通路的核心模块，在植物适应干旱胁迫的过程中发挥重要作用。本研究利用生物信息学和分子生物学的研究方法对新疆大叶苜蓿PYL-PP2C-SnRK2基因家族成员进行全基因组鉴定和干旱胁迫下的调控模式分析。结果表明：新疆大叶苜蓿基因组共包含40个MsPYLs、216个MsPP2Cs和36个MsSnRK2s基因，3个基因家族成员分别分布在22、21和24条染色体上。系统进化分析将MsPYL-PP2C-SnRK2分为3、13和3个亚家族。MsPYLs均包含PYR-PYL-RCAR-like结构域；大多数MsPP2Cs都包含PP2Cc结构域；MsSnRK2s均包含STKc结构域。在启动子区域发现了多个与胁迫反应和植物生长相关的顺式作用元件。在不同程度干旱胁迫下，MsPYL-PP2C-SnRK2s基因家族成员的表达模式存在显著差异。加权基因共表达网络分析将干旱胁迫下新疆大叶苜蓿内源ABA含量与基因表达量相关联，进一步筛选出核心调控基因。分子对接结果验证表明，MsSnRK2-14.1/14.2/1.2和MsPP2C88.4可能在干旱逆境中起关键的正向调控作用。本研究为深入探究MsPYL-PP2C-SnRK2基因在干旱胁迫响应中的功能机制提供了重要理论依据，为优良牧草抗旱性的遗传改良提供了优异的基因资源。

Abstract

Global climate change has led to the intensification of drought， which has had a serious impact on the sustainability of the forage industry. Among the various physiological and molecular mechanisms that plants employ to adapt to drought， the PYL-PP2C-SnRK2 module stands out because it constitutes the core components of the abscisic acid （ABA） signaling pathway， which plays an essential role in mediating plant adaptation to drought. In this study， genome-wide identification of PYL-PP2C-SnRK2 gene family members in Medicago sativa ‘Xinjiangdaye’ and analysis of their regulatory patterns under drought stress were conducted using bioinformatics and molecular biological methods. Searches of the M. sativa ‘Xinjiangdaye’ genome revealed 40 MsPYL， 216 MsPP2C， and 36 MsSnRK2 genes. The members of these three gene families were distributed across different chromosomes： MsPYLs across 22 chromosomes； MsPP2Cs across 21 chromosomes； and MsSnRK2s across 24 chromosomes. Domain architecture analysis of the putative proteins encoded by these genes confirmed the presence of the PYR-PYL-RCAR-like structural domain in all of the MsPYLs； the PP2Cc structural domain in most of the MsPP2Cs； and the STKc structural domain in all the MsSnRK2s. Analyses of gene promoter regions identified multiple stress-responsive and growth-related cis-regulatory elements. Under progressive drought stress， the MsPYL-PP2C-SnRK2 genes exhibited significantly divergent transcript profiles. A weighted gene co-expression network analysis established robust correlations between endogenous ABA accumulation and the transcript levels of specific genes， which allowed us to identify candidate core regulatory factors involved in the drought adaptation process. Molecular docking analyses demonstrated that MsSnRK2-14.1/14.2/1.2 and MsPP2C88.4 had functional predominance as key positive regulators during the drought adaptation of M. sativa ‘Xinjiangdaye’. The results of this study provide a foundational theoretical framework for further studies on the functional mechanisms of the MsPYL-PP2C-SnRK2 module and its components in the response to drought stress. Furthermore， it offers an excellent set of genetic resources for breeding new varieties of drought-resistant pasture grasses.

Graphical abstract

关键词

干旱胁迫 / PYL-PP2C-SnRK2 / 脱落酸 / 加权基因共表达网络分析 / 新疆大叶苜蓿

Key words

drought stress / PYL-PP2C-SnRK2 / abscisic acid / weighted gene co-expression network analysis / Medicago sativa ‘Xinjiangdaye’

全球气候变暖导致干旱加剧，干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一^［1-2］。在自然状态下，植物组织含水量占组织鲜重的75%~90%，是植物生长、发育、代谢等多种生理过程的重要参与者，水分的亏缺会严重影响植物的生长发育和形态建成^［3］。经过长期的自然进化与选择，植物进化出了干旱信号感知-信号转导-下游功能基因响应的多层次干旱适应策略^［4］。脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物激素中的核心成员^［5］，在非生物胁迫信号转导过程中起重要的信号传递作用^［6］。干旱胁迫会激发植物器官中ABA产生和积累，然后通过磷酸化依赖的信号级联介导胁迫反应^［7-8］。大量研究表明ABA依赖的信号通路在渗透胁迫引起的ABA信号转导中是必不可少的，并且在介导植物干旱反应中起中心调节作用^［9-10］。

ABA信号通路包括3个主要组分，即 ABA受体家族蛋白（pyrabatin resistance/pyrabactin resistance 1-like/regular component of ABA receptors，PYR/PYL/RCAR，PYL）、蛋白磷酸酶2C（protein phosphatase 2C，PP2C）、蔗糖非酵解型蛋白激酶2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SnRK2）^［9］。在缺乏ABA的情况下，PP2C结合并抑制SnRK2s，从而阻断ABA信号通路^［10］。研究发现，PYL-PP2C-SnRK2组成的核心信号模块构成ABA信号转导的分子枢纽，其功能调控网络解析已成为植物逆境生物学研究的前沿领域^［11］。在ABA存在下，ABA与PYL受体结合，诱导构象变化形成PYL-ABA-PP2C三元复合物，解除PP2C对SnRK2的抑制作用，导致自磷酸化和SnRK2的激活，活化的SnRK2通过磷酸化下游转录因子，启动胁迫响应基因的表达调控程序，以ABA依赖的方式修饰一系列基因的转录并刺激ABA反应^［11-12］。因此，ABA信号通路的核心成分如何响应ABA信号对逆境下植物维持生长就至关重要。研究发现，拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组包含14个PYL的基因，其中过表达AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因可以提高干旱胁迫的耐受性^［13-14］。研究发现，在禾本科中PP2C家族成员在ABA信号转导中呈现功能异质性^［15-18］。玉米（Zea mays）ZmPP2C-A10通过负向调控SnRK2活性参与渗透胁迫应答^［15］，而小麦（Triticum aestivum）TaPP2C1则通过调控活性氧代谢增强耐旱性^［16-17］。

新疆大叶苜蓿（Medicago sativa ‘Xinjiangdaye’）是西北地区种植较为广泛的四倍体紫花苜蓿品种，具有较强的抗旱性^［19］。但是由于我国西北地区水资源匮乏，干旱成为限制新疆大叶苜蓿产量和地理分布的主要因素之一^［2］。因此，提高新疆大叶苜蓿的干旱适应性对西北畜牧业的发展具有重要意义。研究发现，干旱能诱导多个紫花苜蓿品种根叶中ABA含量的积累^［20］，说明ABA介导的干旱胁迫信号转导是紫花苜蓿适应干旱胁迫的主要策略，但目前有关紫花苜蓿ABA信号转导的分子基础报道较少。因此，本研究结合基因组和转录组数据对新疆大叶苜蓿PYL-PP2C-SnRK2基因家族成员进行系统鉴定和干旱胁迫下的响应模式分析，并结合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis， WGCNA）筛选了ABA信号转导途径中的关键基因，为进一步揭示ABA信号通路在紫花苜蓿中的功能和抗旱分子机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从FigShare（https：//figshare.com/）数据库下载新疆大叶苜蓿的基因组相关文件（包含基因组和其注释文件）。拟南芥全基因组数据下载自TAIR（https：//www. arabidopsis.org/）数据库^［21］。干旱胁迫下的转录组数据来源于甘肃农业大学林学院罗永忠课题组2023年的抗旱性试验^［22］。

1.2 基因家族的生物信息学分析

1.2.1 基因家族的鉴定

从Pfam（https：//pfam.xfam.org/）数据库下载PYL、PP2C和SnRK2蛋白质的结构域文件，其中PYL和SnRK2蛋白质的Pfam模型分别为PF10604和PF00069，PP2C的为PF07714和PF00036。使用HMMER 3.0软件在蛋白质文件中搜索获得包含PYR-PYL-RCAR-like结构域、PP2Cc 结构域、STKc结构域的序列，参数设置为E-value<1e-5。利用蛋白序列在Interpro、SMART、NCBI在线网站鉴定其包含的结构域，并去除冗余序列。拟南芥的PYL-PP2C-SnRK2s基因及蛋白序列来自拟南芥TAIR数据库。

1.2.2 蛋白理化性质分析

利用ExPAsy^［23］（https：//web.expasy.org/protparam/）网站对新疆大叶苜蓿MsPYL-PP2C-SnRK2家族的氨基酸长度、分子量、等电点、不稳定指数、平均疏水性进行预测。利用WoLF PSORT^［24］（https：//wolfpsort.hgc.jp/）网站对新疆大叶苜蓿MsPYL-PP2C-SnRK2家族进行亚细胞定位预测。

1.2.3 染色体定位及共线性分析

使用TBtools^［25］软件对其在染色体上的位置定位，在MG2C网站（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）进行结果可视化。利用TBtools软件分析PYL-PP2C-SnRK2s基因家族成员的共线性关系。

1.2.4 系统进化树的构建与分析

利用基于最大似然法的Treefinder软件构建拟南芥和新疆大叶苜蓿PYL-PP2C-SnRK2s基因家族的系统发育树。分别使用 Jones、Taylor 和 Thornton 氨基酸替换模型（JTT 模型）执行 1000 次重复的 bootstrap 值，其他参数默认。利用iTOL^［26］（https：//itol.embl.de/）美化进化树。

1.2.5 基因结构和保守基序、保守结构域分析

从新疆大叶苜蓿基因组注释文件中获取MsPYL-PP2C-SnRK2基因的内含子和外显子信息，用于绘制基因结构图，运用在线网站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析PYL-PP2C-SnRK2基因家族成员保守基序。利用TBtools分析基因结构，对MsPYL-PP2C-SnRK2基因结构保守基序、保守结构域进行可视化。

1.2.6 顺式作用元件预测

利用在线网站PlantCARE^［27］（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对启动子区域的顺式作用元件进行预测，预测结果由TBtools软件可视化。

1.2.7 WGCNA分析、GO注释及KEGG富集

利用基于 R version 4.2.2的WGCNA 1.71函数包完成共表达模块分析，使用甘肃农业大学林学院罗永忠课题组前期检测的ABA含量作为表型数据进行模块相关性分析。使用STRING^［28］（https：//cn.string-db.org）网站进行GO注释和KEGG富集。

1.2.8 分子对接

蛋白质三级结构构建使用AlphaFold 3（https：//alphafoldserver.com/）完成。ABA结构文件下载自Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）网站，CID号为5280896。蛋白质与ABA对接使用AutoDockTools-1.5.6完成，蛋白质-蛋白质对接使用HDOCK SERVER^［29］（http：//hdock.phys.hust.edu.cn/）完成。利用PDBePISA^［30］（https：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver）分析接触界面的作用力。使用PyMOL 2.4完成蛋白质结构和对接结果的可视化。

1.3 干旱胁迫下的转录组分析

1.3.1 材料处理与转录组测序

以甘肃农业大学草业学院提供的新疆大叶苜蓿种子为试验材料，室外自然条件下进行盆栽试验。每个花盆（上底直径29.5 cm、下底直径20.0 cm、高23.0 cm）装8.0 kg过筛（筛孔为0.5 cm）壤土，在装土前，每盆增施7.2 g氮肥，按1 g尿素∶5 g（NH₄）₂HPO₄的比例混合均匀，测得田间持水量为18.25%。2023年3月16日播种，每盆播种50粒，出苗后定苗至20株，统一防治病虫害。试验共设4个不同的土壤水分梯度，CK为对照（田间最大持水量的85%±5%），D₁为轻度胁迫（田间最大持水量的65%±5%），D₂为中度胁迫（田间最大持水量的45%±5%），D₃为重度胁迫（田间最大持水量的20%±5%），用盆栽称重法控制土壤含水量。于2023年6月21日开花初期开始控水，用感量5.0 g电子秤于每天18：00对各处理进行称重补水，架设塑料防雨棚，控制土壤水分含量范围。干旱胁迫第14天时D₂和D₃处理叶片出现明显萎蔫，此时对CK、D₁、D₂、D₃处理下植株的完整健康叶片进行采样。每个干旱梯度设置3次重复。取样后，立即将样品快速冷冻在液氮中，并在-80 ℃保存以供后续进行转录组测序和qRT-PCR检测。

RNA 的提取和质量控制、文库的制备和定量、测序和质量控制分析均参考Qi等^［22］的方法。使用Hisat2（2.2.1）^［31］将Clean reads比对到新疆大叶苜蓿的参考基因组上，使用featureCounts（2.0.3）^［21］对基因比对情况进行计算，然后根据reads的覆盖度计算每个基因的FPKM（fragments per kilobase million）值。

1.3.2 基因表达量和qRT-PCR分析

从干旱胁迫下的新疆大叶苜蓿转录组中获取MsPYL-PP2C-SnRK2家族基因的表达量数据，以log₂（FPKM+1）进行标准化处理^［22］，使用CNSknowall平台（https：//cnsknowall.com）绘制表达量热图。利用SPSS 26的单因素方差（one-way ANOVA）分析检测主要表达基因在干旱胁迫下的差异水平，并在Origin 2021中绘制差异性分析图。qRT-PCR的样品收集方法与转录组的取样方法一致。使用CTAB方法^［22］从叶中提取总RNA，随后使用逆转录试剂盒（SweScript All-in-One RT SuperMix， G3337）逆转录成cDNA。根据目的基因序列，qRT-PCR引物（表1）用NCBI Primer-BLAST设计。qRT-PCR反应体系为15 μL，反应程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸20 s，然后40个循环，qRT-PCR引物是针对表1中列出的靶基因单独设计，选取紫花苜蓿Actin基因（MS.gene001874）为内参，每组处理重复3次，利用2^{-∆∆CT［32］}法进行相对表达量计算。

2 结果与分析

2.1 基因家族的鉴定和蛋白质理化性质分析

基因鉴定结果显示（表2），新疆大叶苜蓿基因组中包含40个PYL基因、216个PP2C基因和36个SnRK2基因家族成员，按染色体位置依次命名为MsPYL1~MsPYL13、MsPP2C1~MsPP2C111、MsSnRK2-1~MsSnRK2-15。蛋白质理化性质分析显示，MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s蛋白质分别由561~696、186~4110和822~3459个氨基酸组成。MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s等电点（isoelectric point，PI）值均小于7.0，属酸性蛋白。MsPYLs和MsPP2Cs蛋白质疏水性指数（grand average of hydropathicity，GRAVY）均大于0，均为疏水性蛋白，MsSnRK2s蛋白质均为亲水性蛋白（GRAVY<0）。MsPP2Cs和MsSnRK2s蛋白稳定指数（instability index，II）均小于40，属稳定性蛋白，大部分MsPYLs蛋白稳定指数均大于40，稳定性较差。亚细胞定位预测结果表明（图1），MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s主要在细胞核中表达。

2.2 染色体定位和共线性分析

染色体定位分析结果显示（图2），MsPYL/PP2C/SnRK2s除在chr2.2上无分布之外，在其余染色体上均有分布，但主要分布在Chr1/4/5/7上，其他染色体分布的基因成员仅占全部成员的4.37%（51∶292）。说明MsPYL/PP2C/SnRK2s在染色体上的分布具有明显的特异性。另外，由于新疆大叶苜蓿基因组是同源四倍体，因此MsPYL/PP2C/SnRK2s在大部分同源染色体上的分布具有相似性，例如chr8.1~8.4上均分布1个MsSnRK2和1个MsPYL基因，并且MsSnRK2和MsPYL在4条同源染色体上的相对位置接近一致。在MsPYLs、MsPP2Cs、MsSnRK2s基因家族中，分别存在93、473和73个共线性基因对（图2），并且发现新疆大叶苜蓿基因组中存在大量的重复片段（图3）。

2.3 系统进化分析

为了探究紫花苜蓿MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s基因家族成员的进化关系，本研究基于最大似然法分别构建了包含紫花苜蓿和拟南芥的PYLs、PP2Cs和SnRK2s系统发育树（图4）。在PYL进化树中，10个MsPYL根据亲缘关系被划分为3个亚组（A~C），A亚组4个MsPYLs、B亚组2个MsPYLs、C亚组4个MsPYLs。将111个MsPP2Cs和80个拟南芥PP2C基因根据亲缘关系被划分为13个亚组（A~E、F1、F2、G~L）。其中亚组B中MsPP2C数量最多，有18个；亚组E次之，有16个；而亚族H、I、L中MsPP2C数量较少，只有2个。可将15个MsSnRK2根据亲缘关系划分为3个亚组（A~C），A亚组2个MsSnRK2s、B亚组5个MsSnRK2s、C亚组8个MsSnRK2s。

2.4 基因家族结构特征

MsPYLs家族成员共包含10个Motif，其中MsPYL2仅有6个Motif，而在进化树中位于A分支的MsPYL1/6/8/9均包含10个Motif，其余MsPYLs包含8~9个，造成Motif数量差异的原因是是否含有Motif8和Motif10（图5）。基因结构显示，MsPYL1/6/8/9均由3个外显子组成，其余MsPYLs基因均仅有1个外显子。值得关注的是，所有MsPYLs基因均只包含PYR_PYL_CRAR_like结构域。

MsSnRK2s家族成员共包含15个Motif，除MsSnRK2-11/12/5外，其余MsSnRK2含有的Motif数量和Motif的相对位置均一致（图6）。均含有2个Motif1，MsSnRK2-15含有2个Motif4和Motif8。基因结构分析显示，除MsSnRK2-4/5/6/11/12外，大部分MsSnRK2s基因由9个外显子构成，MsSnRK2-11含有的外显子数目最多，为23个。结构域分析结果显示，MsSnRK2s含有2个SnRK2家族的特征结构域（STKc_Snrk2-3和STKc_Snrk2），除MsSnRK2-1/7包含的是STKc_Snrk2-3结构域外，其余MsSnRK2包含结构域STKc_Snrk2。值得关注的是，MsSnRK2-11/12还含有1个PLN02449家族的结构域，MsSnRK2-5还含有1个RsmB superfamliy结构域，提示它们可能具有其他生物功能。

MsPP2Cs家族成员共包含10个Motif，其中MsPP2C67只含有1个Motif，而其余的MsPP2Cs成员均含有2~11个Motif，其中MsPP2C95包含2个Motif10，因此含有11个Motif（图7）。与Motif分布情况相似的是，MsPP2Cs的基因结构也存在较大差异，有4个MsPP2Cs仅有1个外显子，而含有外显子最多的成员MsPP2C22有22个外显子，其余MsPP2Cs基因含有的外显子数量在2~20个。与MsPYLs相比，MsPP2Cs含有的结构域在不同家族成员之间具有明显的差异。值得关注的是，所有的MsPP2Cs均含有PP2Cc结构域，但除此之外，在不同的家族成员中还含有蛋白激酶C样家族结构域（PKC_like superfamliy）和糖苷水解酶第20家族（GH20_hexosaminidase superfamliy glycohydro）等23个具有其他功能的结构域。以上结果说明，MsPP2Cs的进化并不保守，这种进化方式可能使得MsPP2Cs具有新的基因功能。

2.5 顺式作用元件分析

为进一步了解MsPYL、MsPP2C和MsSnRK2s的功能，本研究分析了其基因家族成员启动子区域的顺式作用元件。结果表明，其基因家族在应对非生物胁迫方面具有广泛的潜在机制，其基因家族的启动子区主要包含与胁迫、生长发育、植物激素相关的顺式作用元件（图8~10），有光响应元件（light responsiveness）、低温响应元件（low temperature responsiveness）、厌氧诱导响应元件（anaerobic induction）和MYB结合位点相关的响应元件（MYB binding site involved）。除此之外，还包含6类激素应答元件，包括脱落酸响应元件（abscisic acid responsiveness）、水杨酸响应元件（salicylic acid responsiveness）、赤霉素响应元件（gibberellin responsiveness）、生长素响应元件（auxin responsiveness）、茉莉酸甲酯响应元件（MeJA-responsiveness）和乙烯响应元件（dehydration-responsive element，DRE）。以上结果表明，MsPYL、MsPP2C、MsSnRK2s在调节紫花苜蓿生长发育及应对非生物胁迫中可能发挥着重要作用。

2.6 干旱胁迫下的表达模式分析

干旱胁迫下的表达量分析结果（图11）显示，紫花苜蓿叶片中分别表达了32个MsPYLs、179个MsPP2Cs和27个MsSnRK2s基因（FPKM>1）。在MsPYLs家族中，有10个主要表达成员，其中4个MsPYL8的表达水平明显高于其他成员。在MsPP2Cs家族中，有70个成员表达水平较高，其中MsPP2C66.2/31/66.4/66.3/95.4/13.2/99表达水平显著高于其他成员。在MsSnRK2s家族中，有8个成员的表达水平较高，包括MsSnRK2-15.4/3/14.2/7.1/15.2/14.1/1.2/9。为了探索3个基因家族成员对干旱胁迫的响应模式，使用单因素方差分析了FPKM>1的基因在干旱胁迫后的表达差异，结果显示（图12），在MsPYLs家族中，MsPYL4.4/7.3/7.4/8.1在干旱胁迫后表达差异显著（P<0.05），其中MsPYL7.3和MsPYL7.4在干旱胁迫后表达水平均持续下调，在重度胁迫下分别下调了68.75%和82.47%。与之相反，MsPYL4.4和MsPYL8.1的表达水平在轻度和中度干旱胁迫后显著上调，其中MsPYL4.4在中度胁迫下上调了1.52倍，MsPYL8.1在轻度胁迫下上调了1.73倍。值得关注的是，它们均在重度胁迫下显著下调，说明重度干旱胁迫对大部分MsPYLs的基因表达水平有抑制作用。在MsPP2Cs家族中，有6个家族成员在干旱胁迫后差异表达，分别是MsPP2C10.1/13.2/23/25/66.3/88.4。除MsPP2C88.4和MsPP2C23显著下调外，其他4个MsPP2Cs均在干旱胁迫后显著上调，特别是MsPP2C10.1在重度胁迫下上调了15.46倍。在MsSnRK2s家族中，MsSnRK2-1.2/3/14.1/14.2/14.3在干旱胁迫后表达水平具有明显差异，其中MsSnRK2-1.2/14.1/14.2/14.3在干旱胁迫后表达水平持续上调，特别是MsSnRK2-14.1在重度胁迫下上调了3.29倍。

2.7 MsPP2Cs在干旱胁迫下qRT-PCR分析

为进一步确定MsPP2Cs基因在干旱胁迫下的表达模式，本研究选择了4个差异表达的MsPP2C基因进行qRT-PCR试验验证（图13）。结果显示，MsPP2C10.1在D₂处理下开始上调；MsPP2C25、MsPP2C66.3和MsPP2C66.4呈升高的趋势，与对照组相比分别上调了2.88、1.90和1.91倍；4个MsPP2C基因都在D₃处理下表达量达到最大值。对比发现，qRT-PCR试验结果与差异性分析结果一致，进一步确定了这些基因响应干旱胁迫。

2.8 关键调控基因的筛选

2.8.1 基因共表达模块分析

为了筛选MsPYLs/MsPP2Cs/MsSnRK2s家族成员中参与干旱胁迫下ABA信号转导途径的关键基因，本研究使用WGCNA分析了与干旱胁迫下ABA含量共表达的基因模块。结果显示（图14），238个MsPYLs/MsPP2Cs/MsSnRK2s聚类为2个共表达模块，其中“Turquoise”模块包含57个基因，“Blue”模块包含30个基因。相关性分析结果显示，“Turquoise”模块与ABA含量呈显著的正相关（P<0.05），相关性系数为0.69，“Blue”模块与ABA含量呈负相关，相关性系数为0.53。

2.8.2 GO注释

为了进一步探索正向参与ABA信号转导途径的核心基因，本研究对“Turquoise”模块中的基因做了GO注释和KEGG富集分析。结果显示（图15），57个基因主要参与蛋白质去磷酸化等过程，参与植物MAPK信号级联转导通路和植物激素信号转导通路。说明在干旱下上调表达的MsPYLs/MsPP2Cs/MsSnRK2s基因成员主要参与ABA信号转导途径。

2.8.3 核心基因筛选

在Turquoise模块中（图16A），有50个基因被标记为Hub基因，包括34个MsPP2Cs、3个MsPYLs和13个MsSnRK2s基因，其中MsSnRK2-14.1/14.2/1.2和MsPP2C25在干旱胁迫下表达水平存在显著差异，可能是正向参与ABA信号转导的关键基因。在Blue模块中（图16B），有30个基因被标记为Hub基因，包括14个MsPYLs、10个MsPP2Cs和6个MsSnRK2s基因，其中MsPYL7.3/7.4和MsPP2C88.4在干旱胁迫下表达水平存在显著差异，可能是负向参与ABA信号转导的关键基因。

2.9 分子对接

为了探索核心基因是否参与ABA信号转导，本研究对干旱胁迫下差异表达的MsPYL8.1-MsPP2C88.4-MsSnRK2-14.1进行了分子建模和对接分析。分子建模结果显示（图17A~C），MsPYL8.1为同源二聚体结构，MsPP2C88.4和MsSnRK2-14.1为寡聚蛋白。MsPYL8.1与ABA对接构象显示（图17D，E），ABA通过190Phe、118Leu、194Ile和114Leu残基与ABA形成稳定复合物，相互作用方式主要为π-π堆积、疏水作用和范德华力，结合能为-32.292 kJ·mol^-1，表明结合构象稳定。然后使用ABA与MsPYL8.1聚合物（MsPYL8.1/ABA）与MsPP2C88.4进行分子对接，结果显示（图17F），MsPP2C88.4与MsPYL8.1/ABA主要以氢键作用结合，在作用界面发现4个氢键，涉及8个氨基酸残基。最后使用MsPYL8.1/ABA-MsPP2C88.4与MsPYL8.1进行对接，结果显示（图17G），在MsPYL8.1/ABA-MsPP2C88.4-MsSnRK2-14.1三元复合体中，MsSnRK2-14.1与MsPP2C88.4相互作用，MsPYL8.1结构域位于MsSnRK2-14.1与MsPP2C88.4的作用界面。

3 讨论

PYL-PP2C-SnRK2信号模块构成了植物ABA信号通路的中心网络，通过协调气孔关闭、渗透调节物质积累及胁迫响应基因表达等关键生理过程，在植物耐旱性调控中发挥核心作用。随着组学技术的崛起和生物信息学的发展，已在多种植物中完成了PYL-PP2C-SnRK2基因家族的鉴定，包括拟南芥^［14］、水稻（Oryza sativa）^［33］、大豆（Glycine max）^［34］和小麦^［16］等。拟南芥、玉米和水稻基因组中分别包含14、13和13个PYL基因，80、130和90个PP2C基因，10、11和10个SnRK2基因^［14-15］。本研究发现，新疆大叶苜蓿基因组中包含40个PYL基因、216个PP2C基因和36个SnRK2基因。说明PYL-PP2C-SnRK2基因家族成员的组成数量在双子叶植物和单子叶植物中均较为保守，表现为PP2C的成员数量远大于PYL和SnRK2家族，这在大部分植物中得到验证^［34］。新疆大叶苜蓿中PYL-PP2C-SnRK2基因家族成员数量高于拟南芥等其他物种，这可能一方面与同源四倍体紫花苜蓿的全基因组复制事件有关，因为在六倍体小麦^［16］中发现了26个PYL基因。另一方面可能与紫花苜蓿基因组中存在的大片段重复有关，本研究在共线性分析中发现PYL-PP2C-SnRK2基因家族在非同源染色体上均存在大量的共线基因对。新疆大叶苜蓿庞大的基因家族规模提示其可能拥有更为复杂和精细的ABA信号调控网络，这可能是其作为重要牧草具备较强环境适应性的遗传基础之一。因此，基因家族的大规模扩张为新疆大叶苜蓿构建复杂的ABA信号调控网络以应对多变干旱环境提供了重要的基因资源基础。

通过系统发育分析，将MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s家族基因分为3、13和3个类群。在系统发育树中，同一分支的保守基序高度相似，表明同一组基因可能具有相似的功能。例如，拟南芥植物中的AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2、AtPYL3都能促进ABA诱导的气孔关闭^［14］。Motif分析结果显示，不同亚家族之间的Motif种类和数量差异明显，这可能是导致它们功能不同的主要原因之一。所有MsPYLs基因都包含PYR-PYL-RCAR-like结构域，其中，PYR-PYL-RCAR-like为START结构域超家族的成员，它的蛋白质折叠具有保守的配体结合模式^［35］，其结构保守性确保了新疆大叶苜蓿在干旱胁迫下 ABA 信号的高效感知。作为ABA信号传导的核心组成部分，大多数MsPP2Cs基因都包含PP2Cc结构域^［34］；PP2Cc结构域在ABA信号传导中起关键作用，通过与PYL/RCAR结合并调控SnRK2激酶活性，参与植物生长发育和抗逆性的调节^［11］。所有MsSnRK2s都包含STKc结构域，该结构域在应对高渗胁迫、高盐度和脱水发挥重要作用^［34］。结合系统发育关系发现，在MsPYL-PP2C-SnRK2家族中聚类在同一亚族的家族成员具有相似数量的基因结构，不同亚族间基因结构差异明显，表明MsPYL-PP2C-SnRK2家族成员在维持核心功能结构域保守性的同时，通过亚族分化实现了功能的多样性，为响应复杂干旱胁迫提供了分子基础。

顺式作用元件在调控基因表达中发挥着重要作用，在揭示其潜在功能方面尤为重要。对MsPYL-PP2C-SnRK2s启动子的顺式作用元件分析表明，MsPYL-PP2C-SnRK2s启动子区域包含许多与胁迫、生长发育、植物激素相关的顺式作用元件，其中所有MsPYLs、MsPP2Cs和MsSnRK2s基因都含有至少一个植物激素响应元件，植物激素信号是调控干旱或缺水反应的关键^［13］。这一结果与拟南芥^［18］、大豆^［34］和白芨（Bletilla striata）^［36］的研究结果相似。进一步分析发现，68%的MsPYLs基因、72%的MsPP2Cs基因和70%的MsSnRK2s基因含有ABA相关调控元件ABRE，这表明MsPYL-PP2C-SnRK2s家族基因参与ABA应答。值得注意的是，在MsSnRK2s中发现了只存在于MsSnRK2-14中的一类特殊的元件DRE，DRE结合蛋白2A（DREB2A）通过ABA不依赖途径介导转录变化以获得抗逆性^［11］。即MsSnRK2-14可能通过ABA不依赖的途径调控功能蛋白，包括mRNA衰变因子，调节转录稳定性，介导干旱胁迫下植物生长。这些激素响应元件，特别是高比例的ABRE和特异的DRE元件，从转录调控层面证实了MsPYL-PP2C-SnRK2s是新疆大叶苜蓿整合多种信号（尤其是ABA）以调控干旱响应的关键枢纽。

SnRK2是植物ABA响应的核心环节，其表达水平的上调能赋予植物对干旱胁迫的高耐受性。例如，在烟草（Nicotiana tabacum）中过表达甘蔗（Saccharum officinarum）SoSnRK2.1基因，显著增加了过表达植物对干旱胁迫的耐受性^［37］。本研究发现，在干旱胁迫下MsSnRK2-1.2/14.1/14.2/14.3的表达水平显著上调，其中MsSnRK2-14.1/14.2/1.2在共表达模块中与ABA含量显著正相关，可能是MsSnRK2家族中响应干旱胁迫的关键基因。PYL是ABA信号通路中的正调控因子，在干旱胁迫下具有复杂的调控作用，在拟南芥和玉米中发现，PYL存在组织特异性表达，并且受到胁迫时长和胁迫程度的调控^［38］。本研究发现MsPYL4.4和MsPYL8.1在轻度和中度干旱胁迫下表达水平显著上调，可能在新疆大叶苜蓿干旱胁迫下的信号转导过程中起关键作用。其余MsPYLs在叶片中的表达水平较低或不表达，推测它们可能存在时空特异性表达。研究发现，部分PYL亚型（如PYL9/10）在干旱早期快速表达，随后通过PP2C介导的去磷酸化下调SnRK2活性，触发泛素连接酶SDIRIP1降解PYL蛋白，构成ABA信号转导的负反馈调节系统以平衡信号敏感性^［39］。因此，下调表达的MsPYL7.3、MsPYL7.4以及MsPYL4.4和MsPYL8.1在重度胁迫下的下调可能跟ABA信号转导的负反馈有关。PP2C在ABA信号转导过程中具有重要的枢纽作用。有研究发现，PP2C是干旱胁迫的负调控因子，抑制PP2C基因的表达有利于干旱胁迫下的ABA信号传导^［7］。本研究发现，MsPP2C88.4和MsPP2C23在干旱胁迫后显著下调，提示MsPP2C88.4和MsPP2C23可能在ABA依赖型信号转导途径中发挥关键作用。另外有研究发现，一部分PP2C基因通过ABA非依赖性信号通路调节植物胁迫耐受性，例如来自水稻的OsPPO21^［40］。在之前的研究中发现，紫花苜蓿根系中PP2C基因只有少数在干旱胁迫后下调，大部分被干旱胁迫诱导上调^［41］。与之相似，本研究发现新疆大叶苜蓿叶片中MsPP2C10.1/13.2/25/66.3在干旱胁迫后表达水平持续上调，其中MsPP2C25是共表达模块中的核心基因，可能通过ABA非依赖性信号通路调控紫花苜蓿对干旱胁迫的响应过程。综上，本研究发现新疆大叶苜蓿虽然有较多的MsPYL-PP2C-SnRK2s基因家族成员，但是大部分在叶片中呈组成型表达或表达水平较低，只有少数参与了干旱胁迫下ABA的信号转导，包括MsPYL4.4/7.3/7.4/8.1、MsPP2C10.1/13.2/23/25/66.3/88.4和MsSnRK2-1.2/3/14.1/14.2/14.3，其中MsSnRK2-14.1/14.2/1.2和MsPP2C88.4在此过程中起核心作用。最后，本研究利用计算生物学方法辅助证明了差异表达的MsPYL8.1、MsPP2C88.4和MsSnRK2-14.1能够形成三元复合体，并且MsSnRK2-14.1的功能结构域位于与MsPP2C88.4的作用界面上，说明MsPP2C88.4能够去磷酸化MsSnRK2-14.1，完成干旱胁迫下的ABA信号转导过程。

4 结论

本研究在新疆大叶苜蓿中发现40个PYL基因家族成员、216个PP2C基因家族成员和36个SnRK2基因家族成员，对它们的基本理化性质、系统进化关系、分布、基因结构和顺式作用元件进行了详细研究。在启动子区域发现了多个与胁迫反应和植物生长相关的顺式作用元件。在不同程度干旱胁迫下，新疆大叶苜蓿叶片MsPYL-PP2C-SnRK2s基因家族的表达模式存在明显差异。WGCNA筛选出与ABA含量显著相关的枢纽基因，（MsPYL8.1，MsPP2C88.4，MsSnRK2-14.1）。后续GO注释和KEGG富集分析、蛋白互作网络分析和分子对接，进一步证实了所筛选核心基因在植物生长发育、ABA信号转导以及逆境适应等方面的核心作用。本研究首次对新疆大叶苜蓿PYL-PP2C-SnRK2s进行了系统的生物信息学分析，为研究MsPYL-PP2C-SnRK2s基因的生物学功能奠定了基础，揭示了新疆大叶苜蓿复杂ABA信号网络的干旱适应机制，为牧草抗旱遗传改良提供了关键靶基因及理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金(32160409)