基于转录组学分析代乳粉饲喂量对42日龄断奶牦牛犊牛脾脏和胸腺发育的影响

Transcriptomics-based analysis of the effect of feeding weaned yak calves with milk replacer powder on their spleen and thymus development

摘要

本研究基于转录组学技术，以14头42日龄健康公牦牛犊牛［体重（36.30±1.09） kg，遗传背景一致］为研究对象，随机分为低（dC组，代乳粉饲喂量为平均体重的0.8%）和高（dH组，代乳粉饲喂量为平均体重的1.2%）代乳粉饲喂量两组，探究其对脾脏和胸腺免疫功能的影响。试验期间犊牛自由采食开食料及苜蓿干草，经30 d预试期后，当体重达60 kg以上且固体饲料日采食量超过1 kg时，每组随机选取5头屠宰取样，采集脾脏和胸腺组织样品用于相关指标的测定分析。结果表明：1）转录组学结果显示，牦牛犊牛脾脏中，高代乳粉饲喂量显著促进脾脏免疫相关基因（如CXCL14、CXCL11、CXCL9）的上调，且差异表达基因显著富集在病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞DNA感应途径、趋化因子信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等，增强了脾脏的抗病能力。2）牦牛犊牛胸腺中，高代乳粉饲喂量中抗原呈递相关基因（HSPA6、HSPA1A）及Toll/Imd通路基因（MAPK10）表达增强，且差异表达基因显著富集在抗原处理和表达、细胞色素P450对外源物质代谢的影响、Toll和Imd信号通路等。3）牦牛犊牛胸腺和脾脏组织实时荧光定量PCR结果与测序结果一致，表明测序结果可靠。综上所述，相较于低代乳粉饲喂量，高代乳粉饲喂量组犊牛脾脏调节病毒蛋白与宿主免疫系统的相互作用影响病毒-宿主互作，同时还能影响病毒防御相关通路（如干扰素信号通路）的激活程度；胸腺能够优化抗原呈递细胞的加工和表达功能，进而提高犊牛的免疫能力，为牦牛犊牛早期免疫发育的营养干预提供理论依据。

Abstract

This study investigated the effects of feeding weaned yak calves with milk replacer at a range of levels on the immune function of the spleen and thymus， using a transcriptomics approach to analyze gene transcript profiles. Fourteen healthy male yak calves were selected for this experiment. The calves were 42 days old at the start of the experiment， had a consistent genetic background， and an average weight of （36.30±1.09） kg. The calves were randomly assigned to either a low milk replacer group （dC， 0.8% of average body weight） or a high milk replacer group （dH， 1.2% of average body weight）. The calves had ad libitum access to calf starter and alfalfa （Medicago sativa） hay. After a 30-day preliminary period， when calves reached a body weight of more than 60 kg and a daily solid feed intake exceeding 1 kg， five calves from each group were randomly selected for slaughter and sample collection. Spleen and thymus tissues were collected for analysis. The main results were as follows： 1） Transcriptomics analysis of spleen tissue revealed significant upregulation of immune-related genes （e.g.， CXCL14， CXCL11， CXCL9） in the spleen of the dH group. Differentially expressed genes （DEGs） between the dH and dC groups were significantly enriched in pathways such as viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor， cellular DNA-sensing pathway， chemokine signaling pathway， and RIG-Ⅰ-like receptor signaling pathway， suggesting enhanced antiviral capacity of the spleen. 2） In thymus tissue， the dH group exhibited increased transcript levels of antigen presentation-related genes （HSPA6， HSPA1A） and Toll/Imd pathway genes （MAPK10）. Furthermore， the DEGs were significantly enriched in pathways including antigen processing and presentation， cytochrome P450 xenobiotic metabolism， and the Toll and Imd signaling pathway. 3） Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） analyses of thymus and spleen tissues corroborated the transcriptomic sequencing results， confirming the accuracy of the sequencing data. In conclusion， compared with the dC group， the dH group displayed changes in gene expression in the spleen indicative of enhanced immune responses to viral proteins， including the activation of virus defense-related pathways such as the interferon signaling pathway. Similarly， antigen-presenting cell processing and presentation functions were improved in the thymus of calves in the dH group， indicative of increased immune competence. These findings provide a theoretical basis for nutritional interventions aimed at promoting early immune development in yak calves.

Graphical abstract

关键词

牦牛犊牛 / 代乳粉饲喂量 / 脾脏 / 胸腺 / 转录组学

Key words

yak calves / milk replacer feeding level / spleen / thymus / transcriptomics

脾脏作为牦牛犊牛最大的外周免疫器官，通过B细胞和T细胞介导适应性免疫应答^［1］，同时协同自然杀伤细胞和树突状细胞执行血液过滤、先天免疫防御及抗原呈递功能^［2-5］。胸腺作为T细胞发育的中枢器官^［6］，对牦牛犊牛的细胞免疫至关重要^［7］。研究表明，胸腺在犊牛早期呈现快速发育状态，并随着性成熟逐渐退化^［8］，其中的T细胞成熟后迁移至脾脏和肝脏，进一步参与局部和全身的免疫防御。此外，研究还发现牦牛犊牛胸腺中的上皮细胞表达高水平的MHC Ⅱ类分子^［9］，可能构成牦牛高海拔免疫适应的关键机制。

代乳粉的营养组成显著调控免疫器官发育，其中的蛋白质与氨基酸直接影响胸腺重量及T细胞数量^［10］。而添加的益生菌或益生元可通过双重途径增强免疫功能，既提升脾脏淋巴细胞数量^［11］，又激活胸腺免疫基因（如IL-2、IFN-γ）的表达^［12］。这种协同作用可能是由于代乳粉配方优化能够通过影响器官间互作从而提升犊牛免疫效能。

转录组学作为研究基因表达的重要工具，近年来在幼龄反刍动物免疫研究中的应用日益广泛。研究表明，幼龄反刍动物在早期发育阶段，免疫系统的成熟与特定基因的表达密切相关^［13-15］。通过RNA-seq技术分析了犊牛在初生期的免疫相关基因表达变化，发现Toll样受体（TLRs）和细胞因子（如IL-6和TNF-α）在初生期显著上调^［16］，提示这些基因在早期免疫防御中具关键作用，这为解析代乳粉的免疫调控提供了分子靶标。因此，本研究基于转录组学技术分析代乳粉饲喂量对42日龄断奶牦牛犊牛在脾脏和胸腺上的差异表达基因以及找到与免疫相关的基因本体论（gene ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路，以期获得适合牦牛犊牛的代乳粉饲喂量，系统阐明代乳粉饲喂量对42日龄断奶牦牛双重免疫器官发育的影响机制，最终建立基于免疫优化的代乳粉精准供给方案。

1 材料与方法

1.1 试验动物及地点

牦牛犊牛购自青海省大通种牛场，品种为大通牦牛。饲养试验在青海省海北州海晏县高原现代生态畜牧业科技试验示范园进行。试验期为2023年6-11月。

1.2 试验设计

动物试验已由青海大学畜牧兽医科学院实验动物管理委员会批准，审批号：2024-QHMKY-002。

试验选取14头42日龄健康公牦牛犊牛［体重（36.30±1.09） kg，遗传背景一致］，随机分为两组：dC组（代乳粉饲喂量为平均体重的0.8%，低代乳粉饲喂量）和dH组（代乳粉饲喂量为平均体重的1.2%，高代乳粉饲喂量）。试验包含30 d预试期，当犊牛体重≥60 kg且固体饲料日采食量≥1 kg时，每组随机选取5头进行称重屠宰采样。代乳粉及开食料购自北京精准动物营养研究中心，其营养水平与苜蓿（Medicago sativa）干草成分详见表1。

1.3 饲养管理

试验期间，每日07：00和17：00定时饲喂代乳粉两次，代乳粉按1∶5比例与42 ℃温水混合搅拌，冷却至38 ℃后通过专用奶瓶人工投喂。预试期第1~3天采用牦牛乳与代乳粉1∶1混合饲喂，并添加电解多维以缓解犊牛应激、补充电解质及维生素；第4~7天逐步提高代乳粉比例直至完全替代牦牛乳，实现断乳过渡。正式试验首日晨饲前对两组犊牛称重，按平均体重计算初始代乳粉饲喂量，此后每15 d依据体重调整饲喂量。试验全程采用单栏饲养，自由饮水，每日按开食料与苜蓿干草3∶7比例投喂（先投开食料后投干草），记录干物质采食量，并监测犊牛健康状况及行为表现，及时处理异常情况。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 脾脏和胸腺样品采集

在饲养试验结束时，每组随机选取5头牦牛犊牛进行屠宰，采集脾脏和胸腺组织，用生理盐水冲净脏器表面的血液并用滤纸吸干多余液体，将组织剪成碎样状置于5 mL冻存管中，投入液氮冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 转录组文库构建及测序

将脾脏和胸腺组织样本送至上海欧易生物医学科技有限公司，利用转录组学测定脾脏和胸腺的差异表达基因。采用TRIzol试剂（日本TaKaRa公司）依照说明书提取总RNA；使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo scientific，美国）鉴定RNA纯度和定量；使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent technologies，美国）评估RNA完整性；使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）依照说明书构建转录组文库。转录组测序和分析由上海欧易生物技术有限公司（上海，中国）进行。

采用llumina Novaseq 6000测序平台对文库进行测序，并生成150 bp双端reads。每个样本获得raw reads。采用fastp软件对fastq格式的raw reads进行处理，去除低质量reads后获得clean reads用于后续数据分析。使用HISAT 2软件进行参考基因组比对，并进行基因表达量（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads，FPKM）计算，并通过HTSeq-count获得每个基因的reads计数（counts）。使用R（v 3.2.0）对基因（counts）进行PCA分析以及绘图，以评估样本生物学重复。

1.4.3 差异表达基因筛选注释及PCR验证

利用DESeq 2软件进行差异表达基因分析，其中符合P-adjust<0.05且\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{C}\right|>1阈值的基因被定义为差异表达基因。使用R（v 3.2.0）对差异表达基因进行层次聚类分析，以展示基因在不同组和样本中的表达模式。

随后，基于超几何分布算法对差异表达基因进行GO、KEGG Pathway富集分析，用于筛选显著性富集功能条目。以P-adjust<0.05作为显著性富集的阈值，进行GO功能富集分析，将差异表达基因进行KEGG通路富集分析，通过GO数据库和KEGG数据库进行基因功能注释分析，分析差异表达基因参与的信号通路。

在脾脏和胸腺中随机选择6个差异表达基因，引物均由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（表2和表3），使用实时荧光定量PCR技术对测序结果进行验证。使用Nanodrop 2000分光光度计检测RNA浓度及纯度，将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200 ng·μL^-1，用于逆转录备用。使用逆转录试剂盒（G3337，武汉赛维尔生物科技有限公司），配置成20 μL反应体系，轻轻混匀并离心，于普通PCR仪（ETC811，北京东胜创新生物科技有限公司）上经过25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s完成逆转录。取0.1 mL PCR反应板（PCR-9601-NS，武汉赛维尔生物科技有限公司），配制反应体系［即7.5 μL 2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（G3326，武汉赛维尔生物科技有限公司）+1.5 μL 2.5 μmol·L^-1基因引物（上游+下游）+2.0 μL反转录产物（cDNA）+4.0 μL Water Nuclease-Free（G4700，武汉赛维尔生物科技有限公司）］，每个反转录产物配制3管。点完样用PCR封板膜（G6065，武汉赛维尔生物科技有限公司）配合封膜仪（FS-A20，武汉赛维尔生物科技有限公司）完成封膜，用微孔板离心机（SMP-2，武汉赛维尔生物科技有限公司）离心。PCR扩增反应程序为：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 30 s（40个循环）；熔解曲线65 ℃→95 ℃，每升温0.5 ℃，采集一次荧光信号（从机器中直接调出熔曲程序），于荧光定量PCR仪（CFX Connect，美国Bio-rad公司）上完成扩增。采用ΔΔCT法^［17］分析基因的相对表达量。

ΔΔCT法：

A=CT(\mathrm{目的}\mathrm{基因},\mathrm{待测}\mathrm{样本})-CT(\mathrm{内标}\mathrm{基因},\mathrm{待测}\mathrm{样本})

B=CT(\mathrm{目的}\mathrm{基因},\mathrm{对照}\mathrm{样本})-CT(\mathrm{内标}\mathrm{基因},\mathrm{对照}\mathrm{样本})

K=A-B

\mathrm{表达}\mathrm{倍数}={\mathrm{2}}^{-K}

1.5 数据处理与统计分析

采用Excel 2016初步处理试验数据后，再利用SPSS 21.0分析数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较数据差异性，Duncan氏法进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，以P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，0.05<P<0.10表示具有差异显著的趋势。组学使用R包ggradar绘图，荧光定量PCR则使用GraphPad Prism 10软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 转录组学分析代乳粉饲喂量对牦牛犊牛脾脏功能的影响

2.1.1 差异表达基因的筛选

以P-adjust<0.05和\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{C}\right|>1为标准筛选两组间脾脏组织的差异表达基因（图1），dH与dC组脾脏对比有234个差异表达基因，其中与dC组相比，dH组中有100个上调基因，134个下调基因。

2.1.2 差异表达基因的GO富集分析

以P-adjust<0.05作为显著性富集的阈值，进行GO功能富集分析（图2），结果表明差异表达基因在生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三大类上均有所富集。

dH组相较于dC组，脾脏差异表达基因在BP一类中富集到45个GO功能，在CC一类中富集到15个GO功能，在MF一类中富集到20个GO功能。在BP功能中，2组间脾脏的差异表达基因主要富集在对病毒的防御反应、对病毒的反应、病毒基因组复制的负调控、对干扰素-α的反应、对干扰素-β的反应、对干扰素-γ的反应、Ⅰ型干扰素信号通路、先天性免疫反应、对病毒物质细胞内转运的负调控、免疫反应；在CC功能中，2组间脾脏差异表达基因主要富集在核核小体、细胞外空间、与CA3锥体神经元之间的海马苔藓纤维突触、膜锚定元件、液泡、次级内体膜、质膜、细胞外空间、核小体、顶体膜；在MF功能中，2组间脾脏差异表达基因主要富集在单链RNA结合、核糖体DNA结合、金属内肽酶抑制剂活性、双链DNA结合、β-半乳糖苷酶活性、趋化因子活性、双链RNA结合、电压门控钾通道活性、氧化还原酶活性，作用于配对供体，以分子氧、还原黄素或黄素蛋白为一个供体，结合或还原一个氧原子、类固醇羟化酶活性。

2.1.3 差异表达基因的KEGG富集分析

将差异表达基因进行KEGG Pathway富集分析（图3），dH与dC组脾脏共富集到12条差异信号通路，差异表达基因主要参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、泛酸和辅酶A（coenzyme A，CoA）的生物合成、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、细胞DNA感应途径、5-羟色胺能突触、皮质醇的合成和分泌、趋化因子信号通路、甲状腺激素合成、胆汁分泌、亚油酸代谢、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。

挑选出图3中与免疫相关的KEGG通路进行富集分析，包括病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞DNA感应途径、趋化因子信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路（表4）。表明牦牛犊牛机体内正在发生一个由病毒核酸感知所触发的、强烈的固有免疫反应，其特征是Ⅰ型干扰素和趋化因子的产生，并伴随着病毒与宿主免疫系统之间的复杂相互作用。

2.1.4 实时荧光定量PCR验证结果

从dC与dH组的脾脏组织中随机选择6个差异表达基因，进行实时荧光定量PCR的测定，结果显示与转录组定量结果的显著性及趋势一致，说明转录组数据准确性较高（图4）。

2.2 转录组学分析代乳粉饲喂量对牦牛犊牛胸腺功能的影响

2.2.1 差异表达基因的筛选

以P-adjust<0.05和\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{C}\right|>1为标准筛选两组间胸腺组织的差异表达基因，结果表明dH与dC组胸腺对比有158个差异表达基因，其中与dC组相比，dH组中有78个上调基因，80个下调基因（图5）。

2.2.2 差异表达基因的GO富集分析

以P-adjust<0.05作为显著性富集的阈值，进行GO功能富集分析（图6），可以看出差异表达基因在BP、CC和MF三大类上均有所富集。

dH组相较于dC组，胸腺差异表达基因在BP一类中富集到75个GO功能，在CC一类中富集到22个GO功能，在MF一类中富集到28个GO功能。在BP功能中，2组间胸腺的差异表达基因主要富集在B细胞受体信号通路的负调控、B细胞增殖的负调控、B细胞分化调控、神经元细胞-细胞粘附、过氧化氢分解代谢过程、肿瘤坏死因子生成的负向调节、对活化T细胞增殖的正向调节、T细胞受体信号通路、免疫反应调节、参与炎症反应的白细胞迁移；在CC功能中，2组间胸腺差异表达基因主要富集在纤毛膜、突触、突触前活动区细胞质成分、细胞连接、质膜、细胞表面、突触小泡膜、突触前活跃区、膜的组成部分、神经元投射；在MF功能中，2组间胸腺差异表达基因主要富集在钙离子结合、血红素结合、二酰甘油结合、过氧化物酶活性、α-肌动蛋白结合、钙调蛋白结合、磷脂酰乙醇胺结合、NAD（P）H氧化酶活性、乙酰胆碱受体抑制剂活性、乙酰胆碱结合。

2.2.3 差异表达基因的KEGG富集分析

将差异表达基因进行KEGG Pathway富集分析（图7），dH与dC组胸腺共富集到10条差异信号通路，差异表达基因主要参与抗原处理和表达、神经活性配体与受体的相互作用、突触囊泡循环、丝裂原活化蛋白激酶信号通路-fly、胰高血糖素信号通路、酪氨酸代谢、细胞色素P450对外源物质代谢的影响、类固醇激素的生物合成、Toll和Imd信号通路、神经营养因子信号通路等。

KEGG富集分析（表5）揭示，dH组显著激活了免疫防御网络，包括由Toll和Imd信号通路介导的天然免疫、抗原处理和表达，并同时启动了细胞色素P450介导的外源物质代谢反应。

2.2.4 实时荧光定量PCR验证结果

从dC与dH组的胸腺组织中随机选择6个差异表达基因，进行实时荧光定量PCR测定，结果显示与转录组定量结果的显著性及趋势一致，说明转录组数据准确性较高（图8）。

3 讨论

3.1 转录组学分析代乳粉饲喂量对牦牛犊牛脾脏功能的影响

脾脏是动物体内最大的外周免疫器官，在哺乳动物的生长过程中起着重要的免疫作用^［18-19］，脾脏主要由白髓、红髓和边缘区构成，各部分在免疫应答中扮演着不同的角色。脾脏不仅是一个免疫应答的重要场所，还具有过滤血液、清除衰老红细胞和病原体的功能，起到免疫防御的作用^［20］。转录组结果显示脾脏的差异表达基因主要参与了免疫调控相关通路。脾脏中差异表达基因富集的与免疫相关的通路有病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞DNA感应途径、趋化因子信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。在病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用通路中，与dC组相比，dH组的CXCL14、CXCL11、CXCL9显著上调；在细胞DNA感应途径通路中，与dC组相比，dH组的DDX58、ZBP1、CGAS显著下调；在趋化因子信号通路中，与dC组相比，dH组的CXCL14、CXCL11、CXCL9显著上调，ADCY8显著下调；在RIG-Ⅰ样受体信号通路中，与dC组相比，dH组的DDX58、DHX58、ISG15显著下调。

病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用在病毒感染和免疫反应中起着关键作用。病毒蛋白可通过结合细胞因子阻止其与受体结合，抑制免疫反应，还可调节细胞因子的产生，影响炎症反应。Zheng等^［19］发现与普通牛相比，牦牛脾脏内免疫相关基因CXCL14表达上调有助于提高牦牛的抗病能力。Han等^［21］发现CXCL11是可驱动肿瘤中免疫细胞归巢的枢纽基因，促进免疫细胞分化。CXCL11等趋化因子基因可促进免疫细胞向肿瘤部位定向迁移，提高肿瘤浸润性淋巴细胞的数量，增强局部免疫反应^［22］。CXCL9的表达提示单核细胞从外周向组织迁移，激活炎症反应^［23］。在病毒蛋白与细胞因子受体的相互作用通路中，高代乳粉饲喂量组牦牛犊牛的CXCL14、CXCL11和CXCL9显著上调，这些趋化因子在抗病毒免疫中发挥关键作用，其中CXCL14可增强牦牛对病原体的清除能力，而CXCL11和CXCL9能促进免疫细胞向感染部位迁移。本研究结果显示，高代乳粉饲喂可能通过上调这些趋化因子基因的表达，增强牦牛犊牛脾脏对病毒感染的防御能力。

细胞DNA感应途径是细胞识别和响应DNA损伤或异常DNA存在的重要机制。DDX58基因是先天免疫系统中关键的细胞质模式识别受体，主要识别病毒RNA并启动抗病毒免疫应答，其不仅能够识别RNA病毒，还在某些DNA病毒感染中发挥重要作用^［24-26］。ZBP1是一种感知核酸并激活泛凋亡和炎症的先天免疫受体^［27］，ZBP1可以诱导细胞凋亡和坏死性凋亡，帮助清除受感染的细胞，还可以激活炎症小体，促进炎症因子的释放^［28］。趋化因子信号通路是细胞对外部趋化因子刺激的响应机制，主要调控细胞的迁移、增殖、存活和分化等过程^［29］。趋化因子通过与细胞表面的趋化因子受体结合，激活下游信号通路，从而引导细胞定向迁移^［30］。在细胞DNA感应途径中，高代乳粉饲喂量组的DDX58、ZBP1和CGAS显著下调，这些基因编码的蛋白可识别病毒核酸并激活炎症反应，其下调可能意味着高代乳粉组犊牛的脾脏在稳态下降低了过度免疫激活的风险，但在病原体入侵时仍能通过其他途径（如RIG-Ⅰ样受体通路）维持免疫监视功能。而趋化因子信号通路中，除CXCL家族基因上调外，ADCY8（腺苷酸环化酶8）显著下调，该基因参与调控免疫细胞的迁移和活化，其表达降低可能影响细胞内cAMP的水平，进而优化免疫细胞的趋化效率。

RIG-Ⅰ样受体信号通路是先天免疫系统中识别病毒RNA并触发抗病毒反应的关键途径，通过识别病毒RNA，刺激干扰素和炎症因子的分泌，进而触发宿主的抗病毒防御机制^［31］。高代乳粉饲喂量组的牦牛犊牛在RIG-Ⅰ样受体信号通路中，DDX58、DHX58和ISG15均下调，这一结果与细胞DNA感应途径的变化一致，提示高代乳粉饲喂可能通过精细调控先天免疫传感器的活性，避免过度炎症反应，同时维持基础抗病毒能力。

在本试验中，dH组牦牛犊牛脾脏中CXCL14、CXCL11、CXCL9显著上调；DDX58、ZBP1、CGAS、ADCY8、DHX58、ISG15显著下调影响了细胞因子与病毒蛋白的结合，改变了免疫因子的迁移方向，有效清除脾脏组织内的病原体，增强了脾脏的抗病能力。

3.2 转录组学分析代乳粉饲喂量对牦牛犊牛胸腺功能的影响

胸腺是机体重要的中枢免疫器官，主要负责T淋巴细胞的分化、发育和成熟。造血干细胞在骨髓特定的微环境中，通过一系列精确的分子调控分化为淋巴样干细胞。这些细胞表达特定的归巢受体，通过血液循环迁移至胸腺。转录组结果显示胸腺的差异表达基因主要参与了免疫调控相关通路。胸腺中差异表达基因富集的与免疫相关的通路有抗原处理和表达、细胞色素P450对外源物质代谢的影响、Toll和Imd信号通路等。在抗原处理和表达通路中，与dC组相比，dH组的HSPA6、HSPA1A、KLRC1显著上调，TRAV8-3显著下调；在细胞色素P450对外源物质代谢的影响通路中，与dC组相比，dH组的CYP2F3、GSTA1显著上调；在Toll和Imd信号通路中，与dC组相比，dH组的MAPK10显著上调，DUOX1显著下调。

抗原处理和表达通路是免疫系统中的关键过程，主要涉及抗原呈递细胞如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，这些细胞通过捕获、加工抗原并将其呈递给T细胞，激活适应性免疫应答^［32］。抗原呈递细胞通过吞噬、胞饮或受体介导的内吞作用捕获外源抗原，捕获的抗原在细胞内被降解为小肽片段，内源性抗原在胞质中被蛋白酶降解，肽段通过TAP转运蛋白进入内质网，与MHCⅠ类分子结合的内源性抗原肽呈递给CD8+T细胞，激活细胞毒性T细胞；外源性抗原在内吞体或溶酶体中被酶降解，与MHC Ⅱ类分子在内质网中结合的外源性抗原肽呈递给CD4+T细胞，激活辅助性T细胞^［33］。CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞，直接杀伤感染细胞^［34］；CD4+T细胞分化为辅助性T细胞，分泌细胞因子，调节免疫反应^［35］。激活的T细胞引发一系列免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫，最终清除病原体或异常细胞。HSPA6、HSPA1A是热休克蛋白相关基因，HSPA6的分子伴侣功能依赖于其腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的结合与水解活性，通过腺嘌呤核苷三磷酸-腺嘌呤核苷二磷酸（adenosine triphosphate-adenosine diphosphate，ATP-ADP）转换循环引发的磷酸化修饰及构象重排，动态调控底物蛋白的结合与释放过程^［36］。孔凡升^［37］在探索HSPA1A、HSPA1B和HSPA6的功能时发现这些基因在细胞应答中，尤其是在免疫反应、激素调节以及细胞信号传递中起着关键作用。高擎^［38］发现KLRC1基因在组织中的表达升高可用于激活记忆细胞的增殖和免疫功能的活化。在抗原处理和表达通路中，高代乳粉饲喂量组的HSPA6、HSPA1A和KLRC1显著上调，而TRAV8-3下调。其中，热休克蛋白（HSPA6、HSPA1A）可促进抗原肽的折叠与递呈，而KLRC1的上调可能增强胸腺中NK细胞的免疫监视功能。TRAV8-3的下调则可能影响特定T细胞克隆的发育，暗示高代乳粉饲喂优化了胸腺T细胞受体库的多样性。

细胞色素P450对外源物质代谢的影响主要反映在氧化还原反应上，P450的代谢产物通常与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等结合，代谢某些外源物质时，可能生成活性或毒性代谢物，与细胞大分子结合，导致细胞损伤或突变^［39］。细胞色素P450代谢通路中，CYP2F3和GSTA1的上调可能增强胸腺对外源物质（如代乳粉中的功能性成分）的代谢能力，减少毒性中间产物的积累，从而保护胸腺微环境的稳定性。

Toll和Imd信号通路是两条重要的先天免疫通路，负责识别和抵御病原体感染^［40］。Toll通路主要参与抗真菌和革兰氏阳性菌的免疫反应，Imd通路主要参与抗革兰氏阴性菌的免疫反应，调控抗菌肽的产生和免疫相关基因的表达，在维持宿主-微生物稳态中起重要作用^［41-43］。Toll/Imd信号通路中，高代乳粉饲喂量组MAPK10的上调和DUOX1的下调共同作用，可能通过抑制过度氧化应激，维持牦牛犊牛胸腺上皮细胞的稳态，促进T细胞的正常发育。

在本试验中，dH组牦牛犊牛胸腺中HSPA6、HSPA1A、KLRC1、CYP2F3、GSTA1、MAPK10显著上调，TRAV8-3、DUOX1显著下调使得与免疫相关的通路发生变化，对胸腺的发育起到了正向的调控作用，提高了胸腺的免疫力。

4 结论

相较于低代乳粉饲喂量，高代乳粉饲喂量显著促进了牦牛犊牛脾脏的生长发育，转录组学结果表明代乳粉饲喂量的提高影响细胞因子与病毒蛋白的结合，改变免疫因子的迁移方向，优化抗原呈递细胞的加工和表达功能，调控关键免疫信号通路的激活水平，进而提高了犊牛的免疫能力。

5 数据可用性声明

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参考文献

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基金资助

青海省科技计划项目(2025-NK-124)