紫花苜蓿AP2亚家族基因鉴定、生信分析及MsBBM基因克隆

Identification， bioinformatics analysis of AP2 subfamily genes and MsBBM gene cloning in alfalfa

摘要

AP2亚家族转录因子属于AP2/ERF超家族，参与调节植物生长发育的各种生物学过程。然而，对紫花苜蓿AP2亚家族及BBM的研究未见报道。本研究基于紫花苜蓿全基因组数据，采用HMMER鉴定了10个AP2基因，其中仅有一个BBM基因，对10个AP2成员进行生信和表达分析。结果发现，AP2成员均属于不稳定、亲水的非分泌蛋白，理化性质多样，二、三级结构特异；基序分析显示，AP2基因具有保守性，含有特定的结构域，如仅BBM含有bbm-1结构域，同时含有生长发育、植物激素响应及生物和非生物胁迫响应的顺式调控元件，表明MsAP2成员具有调控植物生长发育和应对逆境胁迫的作用；表达模式分析表明，MsAP2在不同器官的表达具有多样性和特异性，具有调节紫花苜蓿生长发育的潜在功能。进一步克隆MsBBM基因，明确其编码蛋白定位于细胞核。研究结果为后续探究AP2亚家族基因在紫花苜蓿生长发育中的作用提供了参考依据，也为揭示MsBBM基因的功能提供了研究基础。

Abstract

The AP2 subfamily transcription factors belong to the AP2/ERF superfamily and are involved in regulating various biological processes related to plant growth and development. However， there have been no reports to our knowledge on the AP2 subfamily or BBM genes in alfalfa （Medicago sativa）. In this study， based on whole-genome data of M. sativa， ten AP2 genes were identified using HMMER， among which only one was a BBM gene. Bioinformatics and expression analyses were conducted on the ten AP2 members. The results showed that all AP2 members were unstable， hydrophilic， non-secretory proteins with diverse physicochemical properties and specific secondary and tertiary structures. Motif analysis revealed that AP2 genes were conserved and contain characteristic domains； For instance， only the BBM gene possesses the bbm-1 domain. Additionally， the promoter regions of these genes contained various cis-acting elements related to growth and development， plant hormone responses， and both biotic and abiotic stress responses， indicating that MsAP2 members may play roles in regulating plant development and stress adaptation. Expression pattern analysis by qRT-PCR further demonstrated that MsAP2 genes exhibit tissue-specific and diverse expression profiles， suggesting their potential functions in the growth and development of alfalfa. Further cloning of the MsBBM gene confirmed that its encoded protein is localized in the nucleus. These findings provide a reference for future investigations into the roles of AP2 subfamily genes in the growth and development of alfalfa， and lay a foundation for elucidating the function of the MsBBM gene.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / AP2转录因子 / BBM基因 / 生长发育 / 胁迫响应

Key words

alfalfa / AP2 transcription factor / BBM gene / growth and development / stress response

作为最大的转录因子家族之一，AP2/ERF超家族广泛存在于植物中，该家族成员至少含有一个约由70个氨基酸构成的AP2结构域^［1］。根据结构域种类和数量，AP2/ERF超家族一般分为5个亚族：APETALA2蛋白（APETALA2， AP2）、乙烯响应因子（ethylene responsive factor， ERF）、与ABI3/VP1相关（related to ABI3/VP1， RAV）、脱水响应元件结合蛋白（dehydration responsive element binding-protein， DREB）和独立型亚族（Soloist）^［2］，其中AP2亚家族含有2个保守的AP2结构域，分别为AP2-R1和AP2-R2^［3］。AP2亚家族蛋白可分为前模体区域、AP2-R1、连接区域、AP2-R2和后模体区域5部分。一般情况下，前模体区域包含euANT2（NNWLGFSLSPH）、euANT3（PKLEDFLGG）、bbm-1（SIGLSMIKTWLRNQP）、euANT5（LSLSMS）和euANT4（PRKSIDTFGQR）5个保守域；后模体区域包含euANT6（ILESSSLPIGGGAAKRLKD）、bbm-2（RGWCKQEQD）、bbm-3（THNFFQP）、bbm-4（SNSVVYNG）和bbm-5（RNLYYLSQGS）5个保守基序，其中bbm-1是BBM-like基因的特有基序^［4］。当AP2蛋白后模体区域包含microRNA172结合位点时归类为euAP2基因，不包含时则为ANT亚组，ANT亚组根据前结构域的长度及是否含有3个保守基序（euANT2/3/4）分为euANT和baseANT族^［5］。AP2家族基因可通过响应乙烯、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和生长素^［6］，直接或间接参与种子发育、花和果实的形态建成等植物生长发育的多个进程^［7-8］；此外，AP2基因在植物应对高盐、干旱、低温等非生物胁迫及病害等生物胁迫方面也具有重要功能^［9-11］。如水稻（Oryza sativa）AP2基因FZP在营养生长期通过抑制生长促进因子OsMADS57的表达抑制腋芽生长^［12］；草莓（Fragaria×ananassa）FaTINY2基因可以增强转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）对盐和冷胁迫的耐受性^［13］。

Baby Boom（BBM）基因是植物细胞全能型的主要调节因子，与PLT2在促进胚胎发育及胚乳增殖方面存在功能冗余^［14］。相较于其他AP2基因，BBM的研究较少，但已证明BBM在植物胚胎发育、细胞增殖、愈伤组织生长等方面起着重要作用^［15］。研究发现，OsBBM1基因受各种植物激素诱导，具有调控水稻根和胚发育的作用，且主要在愈伤、胚、茎和根尖分生组织等具备高度分化能力的组织器官内表达^［16］。当前，BBM的功能主要在于调控植物体细胞发育、诱导孤雌生殖及提高转化率方面，如BBM通过调控生长素合成基因YUC3和YUC8介导拟南芥体胚发生^［17］；鹅掌楸（Liriodendron chinense）BBM过表达促进了体细胞胚胎发生及胚性愈伤组织诱导，而CRISPR/Cas9介导的BBM敲除则降低了体细胞胚胎发生率^［18］；异位表达BBM1或BBM4均能成功诱导水稻孤雌生殖^［19］；异位表达MdBBM1基因，促进了细胞分裂，并显著提高了转基因苹果（Malus domestica）植株的转化率^［20］。在拟南芥、油菜（Brassica campestris）和番茄（Solanum lycopersicum）卵细胞中异位表达BBM可绕过受精作用直接进行胚胎发生，故BBM基因可用于双子叶植物的无性胚工程^［14］。另有研究发现，降低TaBBMs的表达可促进籽粒细胞生长，导致小麦（Triticum aestivum）籽粒增大，粒重提高，表明BBM是小麦籽粒大小和粒重的负调控因子^［21］。由此可见，BBM基因主要调控植物的生长发育过程。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界范围内最重要、最具经济价值的多年生豆科牧草，由于蛋白质含量高和营养成分丰富、饲喂价值高、适口性好等特征，被誉为“牧草之王”。随着基因组的测序完成和公布^［22］，紫花苜蓿多个基因家族成员已被鉴定，如Jin等^［23］鉴定到159个MsAP2/ERF成员，并对其在盐、干旱和低温胁迫下的表达模式进行了分析。同样地，温小月等^［24］分析了13个响应干旱胁迫和一氧化氮（nitric oxide， NO）的MsAP2/ERF家族基因，并表明MsERF07蛋白定位在细胞核与细胞膜中，为后续研究紫花苜蓿MsERF07基因响应干旱胁迫的分子机制提供了研究基础。然而，紫花苜蓿AP2转录因子在生长发育中的潜在功能及BBM基因的相关研究未见报道。因此，本研究利用紫花苜蓿基因组，准确鉴定MsAP2基因成员，分析其在不同组织器官中的表达水平，并对MsBBM基因进行克隆和亚细胞定位（图1），以期为揭示AP2基因参与调控紫花苜蓿生长发育的分子机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以‘中苜1号’紫花苜蓿为试验材料，种子于2024年6月27日在湿润的双层滤纸中发芽5 d至顶端冒出第一片真叶后，将幼苗移栽至蛭石为基质的花盆中，置于宁夏大学林业与草业学院植物生长室培养。条件为14 h白天、温度25 ℃，10 h黑暗、温度22 ℃，湿度为50%~60%。待生长20 d后，采集幼苗的根、茎和叶，液氮速冻后于-80 ℃保存。其余植株至生殖期，分别采集花芽晚期、开花早期、开花晚期和荚果早期的芽、花和荚果，保存备用。

1.2 AP2家族成员及BBM基因的鉴定

‘中苜1号’紫花苜蓿基因组数据、核酸及蛋白序列从在线网站（https：//modms.lzu.edu.cn/）下载，并用于本地数据库构建。首先从Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载AP2/ERF蛋白的HMM模型（PF00847），并使用HMMER 3.0软件以默认参数［期望值（expectation value， E-value）阈值为0.001］筛选MsAP2/ERF家族基因。参照Shu等^［25］的分类，利用MAGA 7.0软件构建系统发育树，初步鉴定到紫花苜蓿的AP2候选基因。将其提交到SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和Conserved Domain Database（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）网站筛选具有2个完整AP2结构域的蛋白序列，作为MsAP2基因成员。

利用紫花苜蓿的AP2基因和5个已知物种［拟南芥、大豆（Glycine max）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、玉米（Zea mays）和水稻］的BBM基因构建系统发育树，初步确定MsBBM基因。再利用MEME（http：//meme-suite.org/）在线软件进行保守基序分析，通过BBM的特有基序bbm-1（SIGLSMIKTWLRNQP）准确鉴定MsBBM基因^［4］。

1.3 MsAP2家族成员生物信息学分析

通过在线工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对MsAP2蛋白序列进行理化性质预测，包括氨基酸数量、分子量、理论等电点、不稳定性指数、脂肪指数及疏水性系数。亚细胞定位通过WoLF PSORT工具（https：//www.genscript.com/wolfpsort.html）预测。利用SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0）分析信号肽，TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0）预测跨膜结构，Target P-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-2.0）分析导肽。借助Netphos（https：//services.healthtech， dtu. dk/service.php？NetPhos-3.1）进行磷酸化位点分析，并采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）分别预测二级和三级结构。利用MapGene2Chrome V 2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）分析AP2基因在染色体上的位置信息，并借助TBtools软件完成基因共线性分析。通过PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）鉴定MsAP2基因起始位点上游2000 bp序列中的顺式调控元件，并用R语言绘图。使用STRING数据库（https：//www. string-db.org/）预测蛋白相互作用，并通过苜蓿数据库（https：//modms.lzu.edu.cn/）的BLASTn比对获取MsAP2基因在非生物胁迫和不同组织部位下的表达谱数据，并进行基因本体（gene ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析。

1.4 RNA提取和cDNA合成

使用RNA easy Plant Mini Kit试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取所有样本的总RNA，采用超微量紫外分光光度计（NanoPro 2010，北京鼎昊源生物技术有限公司）检测RNA浓度，并通过1%变性琼脂糖凝胶电泳验证质量。然后使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time， TaKaRa，日本）反转录cDNA。

1.5 AP2基因在不同组织的表达模式分析

利用NCBI在线工具Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）设计10个MsAP2基因的qRT-PCR引物（表1）。以不同样本cDNA为模板，采用StepOnePlus™ Real-Time PCR System和SYBR Premix Ex Taq（Takara，日本）进行qRT-PCR分析，每个样品3次重复。反应体系为20 μL，包含10 μL 2×SuperReal PreMix Plus、3 μL ddH₂O、5 μL cDNA模板及2 μL正反向引物。反应程序包括：95 ℃预变性15 min，扩增40个循环（95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s）。MsAP2基因的相对表达水平采用2^-△△CT法计算^［26］，以MsActin为内参基因，并以叶片的表达水平作为对照。

1.6 BBM基因克隆和亚细胞载体构建

根据BBM基因序列，利用Snapgene软件（Insightful Science，美国）设计特异性扩增引物和亚细胞定位引物，序列如表1所示。以幼苗cDNA为模板，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Takara，日本）扩增MsBBM的编码序列（coding sequence， CDS）区域。50 μL反应体系为：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 µL，上、下游引物（10 µmol·L^-1）各1.5 µL，cDNA模板5 µL和灭菌ddH₂O 17 µL；反应程序为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；4 ℃保存。PCR扩增结束后，用1%凝胶电泳检测，切取胶块移至1.5 mL离心管，按照通用型DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行胶回收。按照Seamless Assembly Cloning Kit（Clonesmarter Technologies，美国）说明书，将回收的MsBBM扩增产物和线性化载体pCAMBIA2300-GFP进行同源重组反应。反应产物的质粒pCAMBIA2300-GFP-MsBBM转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆并进行PCR鉴定。鉴定正确的阳性菌落进行过夜摇菌，按照质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）说明书提取质粒。

1.7 BBM基因亚细胞定位

以重组表达载体pCAMBIA2300-GFP-MsBBM的农杆菌（GV3101）为侵染液，pCAMBIA2300-GFP空载的农杆菌菌液作为对照，选取4~5周长势良好的烟草（Nicotiana benthamiana），使用去针头的1 mL一次性注射器将含有BBM基因和空载的侵染液分别注射到烟草叶片（选择倒三叶和倒四叶）下表皮，并做好标记；将已侵染的烟草放置于人工气候箱暗培养12 h后，转移至光照条件下培养48 h，切取侵染后的烟草叶片，撕取表皮制片，于激光共聚焦扫描电子显微镜（FV3000，日本）在488 nm激光波长下观察，并拍照。

1.8 数据处理

使用Microsoft Excel 2016进行数据整理，采用Graph Pad Prism 8绘图。

2 结果与分析

2.1 MsAP2/ERF基因家族的鉴定及分类

根据HMMER搜索结果，从紫花苜蓿基因组中共鉴定到186个MsAP2/ERF转录因子，为了对MsAP2/ERF基因成员进行分类，从蒺藜苜蓿AP2/ERF家族中分别取各个分支中的一个基因，与MsAP2/ERF共同构建系统发育树。MsAP2/ERF基因家族可初步分为AP2（27个）、DREB（69个）、RAV（3个）和ERF（85个）4个亚家族和2个单独的亚族基因。其中ERF分为6个子组，分别为ERF5、ERF6、ERF7、ERF8、ERF9和ERF10；DERB分为4个子组，分别为DERB1、DERB2、DERB3和DERB4（图2）。

2.2 紫花苜蓿AP2及BBM基因的鉴定

在27个AP2候选基因中筛选包含2个完整AP2结构域的蛋白序列，最终鉴定到10个MsAP2基因，并根据其在基因组中的出现顺序命名。利用10个MsAP2基因和拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿、玉米以及水稻的BBM基因构建系统发育树，最终鉴定到一个MsBBM基因。MsBBM和蒺藜苜蓿MtBBM亲缘关系最近，并与大豆的2个BBM及拟南芥的1个BBM聚为一类。有趣的是，单子叶植物玉米和水稻的BBM聚为一类，剩下的9个MsAP2基因分为2类（图3A）。保守基序分析显示，motif 1、motif 2、motif 3和motif 5存在于所有AP2基因中，其中motif 1和motif 5组成了完整的AP2-R2结构，motif 2和motif 3组成了完整的AP2-R1结构，motif 4是连接（linker）区。所有的BBM基因均含有一个特有基序motif 7，比对发现其正是BBM的特有结构bbm-1（SIGLSMIKTWLRNQP），证实了MsBBM鉴定的准确性（图3B，C）。保守结构域分析发现，所有的AP2基因都包含2个AP2结构域，表明MsAP2基因鉴定的真实性和可靠性（图3D）。

2.3 BBM蛋白序列比对

利用MEGA软件进行双子叶植物拟南芥、大豆、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿BBM蛋白的序列比对，除了AP2-R1、linker、AP2-R2和BBM特有基序bbm-1外，BBM中也含有其他基序，包括euANT1、euANT2、euANT3、euANT4、euANT5和euANT6，以及bbm-2、bbm-3、bbm-4和bbm-5，其中euANT3最保守，bbm类基序变异较大（图4）。

2.4 MsAP2蛋白的理化性质分析

10个MsAP2蛋白的氨基酸数目、分子量和理论等电点之间存在较大差异，MsAP2-7编码892个氨基酸，数目最多，分子量也最大，可达99767.58 Da。MsAP2-4编码的氨基酸数目最少，分子量也最小，仅为42048.77 Da。MsAP2家族成员的理论等电点为5.37（MsAP2-7）~8.69（MsAP2-4），不稳定性指数为42.72（MsBBM）~58.60（MsAP2-6）。10个MsAP2的不稳定性指数均高于40，表明MsAP2均为不稳定蛋白。MsAP2蛋白的脂肪指数为52.32（MsAP2-3）~79.61（MsAP2-9），均小于100，且只有MsAP2-9的蛋白疏水性系数介于-0.5~0.5，表明MsAP2-9为两性蛋白，其余9个MsAP2均为亲水蛋白（表2）。

2.5 MsAP2蛋白的亚细胞定位及结构分析

对MsAP2家族成员进行亚细胞定位预测发现，2个MsAP2蛋白（MsAP2-5和MsAP2-9）定位在叶绿体，其余7个MsAP2和MsBBM定位在细胞核（表3）。所有MsAP2均无信号肽、导肽和跨膜结构，表明MsAP2基因不进行转运输出或分泌，直接在细胞核或叶绿体中发挥作用。蛋白磷酸化位点分析显示，MsAP2-2和MsAP2-7各含有66个丝氨酸，数量较多，MsAP2-1和MsAP2-4数量较少，仅28个；MsAP2-7的苏氨酸数量最多，为31个，MsAP2-6最少，仅为10个；MsAP2-1的酪氨酸最多，为13个，MsAP2-5仅为4个（表3）。分析MsAP2蛋白的二级结构发现，其中所占比例最大的是无规则卷曲，其组成百分比表现为无规则卷曲>α螺旋>延伸链，均无β转角（表3）。同时构建了MsAP2蛋白的三级结构，由于二级结构组成百分比不同，三级结构也表现出明显差异，10个MsAP2编码蛋白具有各自的特异空间构型（图5）。

2.6 MsAP2基因的染色体定位和同源性分析

旁系同源基因对关系鉴定显示，10个MsAP2基因不均匀地分布在紫花苜蓿的6条染色体（chromosome， Chr）上，其中8号染色体分布最多（5个），Chr 2、Chr 3、Chr 4、Chr 6和Chr 7均定位到1个AP2基因上，MsBBM基因在7号染色体上（图6A）。基因重复事件检测发现，共鉴定到2对片段重复，分别为MsAP2-1/MsAP2-3和MsAP2-2/MsAP2-8（图6B）。分析发现，2对片段重复对的K_a/K_s均小于1，表明它们在重复后经历了纯化选择（表4）。

2.7 MsAP2家族基因启动子的顺式调控元件分析

利用基因启动子，分析MsAP2家族成员的顺式调控元件发现，除MsAP2-4和MsAP2-9分别含有6和5个非生物和生物胁迫顺式调控元件外，其余的MsAP2基因均含有10个以上非生物和生物胁迫顺式调控元件。MsBBM仅含有2个植物激素响应顺式调控元件，数量最少；MsAP2-3和MsAP2-4的植物激素响应元件较多，均为13个。MsAP2-6和MsAP2-1含有的植物生长发育类顺式调控元件数量较多，而MsAP2-8和MsAP2-9较少。总体而言，大多数MsAP2基因含有数目较多的植物生长发育类顺式调控元件，表明AP2基因在调控紫花苜蓿生长发育方面具有重要作用（图7）。

2.8 MsAP2基因家族的功能富集分析

为确定功能分类，对10个MsAP2基因进行GO和KEGG富集分析。10个MsAP2均未鉴定到富集的KEGG通路。GO富集分析表明，MsAP2基因主要富集在含核碱基化合物代谢过程的调控、大分子生物合成过程的调控、细胞大分子生物合成过程的调控、RNA代谢过程的调控、RNA生物合成过程的调控、核酸模板转录的调控、DNA模板转录的调控、转录调控因子活性及DNA结合转录因子活性等（图8）。

2.9 MsAP2基因家族的表达模式分析

表达谱数据分析发现，10个MsAP2基因分为3类，第1类的3个基因（MsAP2-1、MsAP2-3和MsBBM）主要在铅胁迫时低表达，并受甘露醇和冷处理诱导；第2类的3个基因（MsAP2-4、MsAP2-7和MsAP2-6）在冷胁迫下具有较高的表达水平；第3类的4个基因（MsAP2-2、MsAP2-8、MsAP2-9和MsAP2-5）主要受铅胁迫诱导（图9A）。组织表达分析显示，第1类的5个基因（MsAP2-1、MsAP2-3、MsBBM、MsAP2-7和MsAP2-4）主要在茎伸长阶段和伸长后期的茎中高表达；第2类的5个基因（MsAP2-2、MsAP2-8、MsAP2-9、MsAP2-6和MsAP2-5）主要在花和根瘤中高表达（图9B）。有趣的是，与胁迫处理相比，MsAP2基因在特有组织中的表达水平较高，表明MsAP2主要参与调控紫花苜蓿的生长发育。

2.10 MsAP2基因的组织表达水平测定

采集紫花苜蓿不同器官进行AP2基因的组织特异性表达分析（图10A），结果发现，部分基因在某些器官中不表达或表达很低，检测不到，如开花早期的MsAP2-1、MsAP2-3、MsAP2-4、MsAP2-7和MsAP2-9，以及开花晚期的AP2-6，与叶片相比，其余基因均在花中上调表达，且4个基因（MsAP2-2、MsAP2-5、MsAP2-8和MsBBM）在开花早期和开花晚期表达水平相差不大（图10B）。与叶片相比，大部分基因在根和茎中上调表达，如MsAP2-1、MsAP2-2、MsAP2-3、MsAP2-4、MsAP2-6、MsAP2-8和MsBBM，剩余的MsAP2-5和MsAP2-9仅在茎中上调表达。另外，相较于叶片，所有基因在花芽晚期中均下调表达。与其他器官相比，MsAP2基因在荚果中的表达相对多样化，其中MsAP2-2和MsAP2-9与叶片相比下调表达，MsAP2-1、MsAP2-7、MsAP2-8和MsBBM与叶片相比无明显差异，MsAP2-4、MsAP2-5和MsAP2-6上调表达。

2.11 MsBBM基因克隆和亚细胞定位分析

特异性PCR扩增结果显示，目的条带大小约为1776 bp，编码560个氨基酸（图11A）。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，结果显示，泳道1、2、3、5、7和8与目标基因长度一致，条带单一清晰，且无杂带或非特异性扩增，为阳性克隆；泳道4无明显条带，可能为假阳性克隆；泳道6出现两条条带，需进一步验证（图11B）。为揭示BBM蛋白在细胞内的具体位置和分布情况，通过注射烟草叶片表皮细胞观察荧光信号。结果显示，空载在细胞膜及细胞核中的荧光信号均匀且强度较高，无特异性亚细胞定位现象，BBM仅定位在细胞核，且表达效果良好（图11C），与生信预测结果相同，表明MsBBM蛋白主要在细胞核中发挥作用。

3 讨论

3.1 紫花苜蓿AP2家族基因在进化过程中的多样性

不同物种含有的AP2亚家族基因成员数量存在差异，相关学者指出，AP2亚家族成员的数量在高等植物中高度保守，如在蒺藜苜蓿中鉴定出21个AP2家族成员^［25］，拟南芥^［27］、水稻^［28］和龙眼（Dimocarpus longan）^［29］中分别鉴定到18、19和26个。本研究根据系统进化分析在紫花苜蓿中初步鉴定到27个AP2成员（图2），这与其他物种的AP2成员数量接近。值得注意的是，本研究后续根据两个完整的AP2结构域，仅筛选到10个AP2基因（图3），这可能是由于不同筛选方法导致的差异。不同物种中AP2成员数量不同，可能是由基因复制引起，包括串联复制和片段复制^［30］。本研究发现，AP2基因存在2对片段重复，K_a/K_s值均小于1（图6B和表4），表明AP2基因在数量上的扩张可以更好地适应多变的环境，对物种进化具有重要意义。生信分析结果表明，10个AP2基因的性质均符合AP2作为转录因子调控下游基因表达的特性^［31］，也与大多数研究结果相似，表明MsAP2主要在细胞核内发挥转录因子的调控作用^［32］。10个AP2基因不均匀地分布在6条染色体上，其中有5个均定位在8号染色体上（图6A），这种定位导致的基因簇及基因复制是物种形成和进化的基础。蛋白二级结构分析发现，具体基因的二级比例存在差异，这种差异导致三级结构各不相同（图5），表明AP2基因在进化过程中保持了理化性质和空间结构的多样性。不同AP2蛋白的磷酸化位点均表现为丝氨酸>苏氨酸>酪氨酸，但具体的AP2个体间差异较大（表3），表明AP2基因可能在功能上存在相似性或一致性，但是不同成员依然通过参与不同的信号转导途径起作用，表现出多样性^［33］。

3.2 AP2家族成员在植物生长发育调节和应对逆境胁迫中的重要作用

AP2作为植物常见的转录因子，通常含有一些决定其功能的保守结构域和基序^［34］，AP2基因在功能上主要表现为调控植物形态发生、各种胁迫响应、植物激素信号转导、代谢产物等过程^［2］，表明AP2蛋白中含有与功能对应的结构域。本研究中，10个保守基序中，motif 1、motif 2、motif 3和motif 5存在于所有AP2基因中，而这4个保守基序组成了完整的2个AP2保守域；同时也鉴定到motif 7是BBM基因的特有结构域bbm-1（图3），表明这些结构域的特有性是决定AP2基因功能分化的主要原因。同时，该结果也表明本研究中BBM和AP2基因鉴定的准确性和真实性。除了基序结构外，顺式作用元件在启动子区域中对基因表达的调控也起着关键作用^［35］。本研究中，在MsAP2家族成员中，鉴定出许多顺式作用元件，包括植物生长发育、植物激素响应以及生物和非生物胁迫等，除了BBM基因仅含有2个植物激素响应元件外，其余基因均含有数量超过5个的同类元件（图7），表明MsAP2基因广泛参与了紫花苜蓿的生长发育、植物激素和逆境响应过程，这也与其他研究结果相似^［28］，表明AP2基因的功能可能在高等植物中具有保守性。

基因的表达模式与其功能关系密切，本研究基于转录组数据分析发现，不同处理条件下的AP2基因表达存在差异，MsAP2-1、MsAP2-3和MsBBM基因在铅胁迫下低表达，表明它们可能具有负调控铅胁迫的功能，与此相反的是，MsAP2-2、MsAP2-8、MsAP2-9和MsAP2-5受铅胁迫诱导上调表达，可能正向调控铅胁迫；另外的3个基因（MsAP2-4、MsAP2-7和MsAP2-6）主要受冷胁迫诱导（图9A）。总的来看，即使部分基因受到胁迫诱导，但表达水平依然较低。与此不同的是，MsAP2基因在不同器官中的表达差异更为突出，如MsAP2-1、MsAP2-3、MsBBM、MsAP2-7和MsAP2-4在茎中高表达；MsAP2-2、MsAP2-9和MsAP2-6在根瘤，以及MsAP2-8和MsAP2-5分别在花和叶中高表达（图9B），表明相较于应对逆境胁迫，AP2基因的主要功能可能体现在参与植物的生长发育方面。多个基因在同一处理或组织中的高表达表明，这些基因可能在功能上存在冗余，如AP2家族成员ANT和AIL6在参与调控花发育和分生组织确定性方面存在功能冗余^［36］。

3.3 MsAP2成员在调节紫花苜蓿生长发育过程中的潜在功能

拟南芥AP2成员PLT1、PLT2、PLT3、BBM和AIL1均可参与调控根的生长发育^［37-38］。随后的研究报道表明，AP2基因家族成员广泛参与植物花、叶、腋芽、种子、果实以及根等组织和器官的发育过程^［39-40］，尤其在决定花器官身份及重瓣花形成中发挥关键作用^［41］。本研究对10个MsAP2基因在紫花苜蓿幼苗根、茎、叶及生殖生长时期的花芽晚期、开花早期、开花晚期和荚果早期的表达水平测定发现，AP2基因在不同组织中的表达水平存在差异（图10）。AtWRI1主要在根中表达，通过调控生长素响应基因表达维持根系的生长素含量，最终调控拟南芥的根系发育^［42］。玉米中ZmRAP2-7也主要在根中表达，刺激根发育^［43］。本研究发现，MsAP2-1、MsAP2-2、MsAP2-3、MsAP2-4、MsAP2-6、MsAP2-8和MsBBM也在根中上调表达，其中MsAP2-1、MsAP2-3和MsBBM分别比叶片上调600、400和500倍（图10），表明与其他物种MsAP2成员相似，紫花苜蓿MsAP2-1、MsAP2-3和MsBBM可能也具有调控根系发育的作用。除此之外，本研究发现，与叶片相比，除了MsAP2-7，其余基因均在茎中上调表达，表明MsAP2基因可能在紫花苜蓿茎的发育过程中发挥重要作用，但这还需要后续进一步验证。

生殖器官中，AP2基因也具有重要功能，如拟南芥AtAIL6在花中的表达量最高，功能分析发现，其调节发育中的花器官生长和形态建成^［44］。单子叶植物研究也发现，在不同发育时期小麦和大麦（Hordeum vulgare）的根、茎、幼叶和穗等组织中均发现了AP2基因的表达，其中穗中的表达量最高^［45］；水稻AP2基因在根、花、叶、种子、茎中均有表达，且在花序和茎中表达量较高^［28］。本研究结果发现，与叶片相比，AP2基因均在芽中下调表达；而在花中的表达具有高特异性，部分基因检测不到表达量；荚果中，AP2基因的表达呈现多样性（图10）。这些结果表明，AP2基因在生殖器官中的表达特异性较高，这可能暗示了其在生殖器官中的特殊功能。另一方面，这种组织特异性表达同样也会介导抗逆性，如金银花（Lonicera japonica）的AP2_7、AP2_24和AP2_30在低温胁迫下高表达，且叶中的表达量明显高于茎和根；而AP2_10在胁迫下3 h表达量显著增加，且在根中的表达水平明显高于茎和叶，表明这些基因可能介导了不同器官对低温的抗性^［33］。这可能是由于植物不同器官应对非生物胁迫时发挥着不同的功能，且在胁迫不同阶段可协同作用。因此，MsAP2基因的组织特异性表达是否介导不同器官对特定胁迫的特异性响应，还需要进一步试验。

BBM基因的重要功能已被多次报道，然而对紫花苜蓿BBM基因的研究十分匮乏。本研究从鉴定、生信分析、表达模式以及克隆和亚细胞定位的全流程对MsBBM基因进行了系统解析，明确了其在不同组织的表达特征及响应非生物胁迫的潜在功能。MsBBM仅包含2个水杨酸响应元件，且主要在根和花中表达量较高，表明其可能介导水杨酸信号参与苜蓿根和花的生长发育。克隆获得的CDS序列及亚细胞定位均与生信预测结果一致，为后续MsBBM基因的遗传转化和功能验证提供了基础。

4 结论

本研究利用生物信息学手段在全基因水平下鉴定到紫花苜蓿的10个AP2基因成员，其中仅有一个MsBBM基因。AP2成员均属于不稳定、亲水的非分泌蛋白，理化性质多样，含有生长发育、植物激素响应及生物和非生物胁迫响应的多个顺式调控元件，在不同器官的表达模式中具有多样性和特异性。进一步克隆了MsBBM基因，其编码560个氨基酸，含特有结构域bbm-1，不具备跨膜结构、信号肽和导肽，与蒺藜苜蓿MtBBM亲缘关系最近。烟草瞬时表达结果显示，MsBBM蛋白亚细胞定位于细胞核。MsBBM在根中表达量最高，在花芽晚期表达量最低，但在开花早期和开花晚期表达水平上升，表明MsBBM基因可能是调控紫花苜蓿根系生长和花器官发育的关键候选基因。

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基金资助

宁夏自然科学基金(2024AAC03095)

宁夏高等学校科学研究项目(NYG2024-045)