低磷胁迫下外源褪黑素对紫花苜蓿幼苗内源激素及有机酸的影响

Effects of exogenous melatonin on endogenous hormones and organic acids in alfalfa seedlings under low-phosphorus stress

摘要

以耐低磷（7890）和磷敏感（15578）苜蓿为研究材料，设置常磷（1.0 mmol·L⁻¹， NP）、低磷（0.01 mmol·L⁻¹， LP，磷源均为KH₂PO₄）及LP胁迫下分别根灌30、60、90、120、150 μmol·L^-1褪黑素（melatonin，MT）共7个处理，探究外源MT对LP胁迫苜蓿内源激素及有机酸的影响。结果表明：供试苜蓿株高、叶面积、地上及地下生物量、叶片相对含水量，根系玉米素、生长素、赤霉素、草酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸含量随MT浓度的增加均呈先升后降趋势，在90 μmol·L^-1的MT处理下达最大值，与LP胁迫相比，材料7890的增幅分别为16.55%、34.62%、32.41%、86.78%、15.77%、10.45%、49.56%、15.74%、37.34%、20.05%、61.21%、50.14%、11.50%和39.06%；材料15578的增幅分别为26.75%、32.00%、44.88%、108.91%、27.45%、28.64%、70.21%、107.20%、29.50%、9.17%、55.24%、56.09%、12.00%和30.71%；而脱落酸含量随MT浓度的增加呈先降后增趋势，在150 μmol·L^-1的MT处理下达最大值。隶属函数分析表明，在90 μmol·L^-1的MT处理下对苜蓿遭受低磷胁迫伤害的缓解效果最佳。耐低磷材料（7890）和磷敏感材料（15578）对褪黑素的响应趋势一致，但后者改善幅度更大，表明褪黑素对磷敏感材料的修复效应更为突出。本研究为利用褪黑素提升作物磷效率提供了理论依据和技术途径。

Abstract

This study aimed to investigate the effects of exogenous melatonin （MT） on endogenous hormones and organic acids in alfalfa （Medicago sativa） seedlings under low-phosphorus stress. Two alfalfa varieties， one tolerant to low-phosphorus conditions （7890） and one sensitive to phosphorus deficiency （15578）， were subjected to seven treatments： normal phosphorus （1.0 mmol·L⁻¹， NP）， low phosphorus （0.01 mmol·L⁻¹， LP， with KH₂PO₄ as the phosphorus source）， and LP combined with root irrigation with MT at concentrations of 30， 60， 90， 120， and 150 μmol·L⁻¹. Fourteen characteristics of alfalfa seedlings were evaluated： plant height， leaf area， aboveground biomass， underground biomass， leaf relative water content， and root zeatin， auxin， gibberellin acid， oxalic acid， lactic acid， citric acid， succinic acid， fumaric acid， and malic acid contents. The values of these 14 characteristics initially increased and then decreased with increasing MT concentration， reaching a maximum in the 90 μmol·L^-1 MT treatment. For alfalfa variety 7890， compared with the plants under LP stress， those in the 90 μmol·L^-1 MT treatment showed increases of 16.55%， 34.62%， 32.41%， 86.78%， 15.77%， 10.45%， 49.56%， 15.74%， 37.34%， 20.05%， 61.21%， 50.14%， 11.50%， and 39.06%， respectively， in the above 14 measured characteristics. For alfalfa 15578， these values were increased by 26.75%， 32.00%， 44.88%， 108.91%， 27.45%， 28.64%， 70.21%， 107.20%， 29.50%， 9.17%， 55.24%， 56.09%， 12.00%， and 30.71% respectively， in the 90 μmol·L^-1 MT treatment compared with the LP treatment. Abscisic acid content exhibited a trend of initially decreasing then increasing with rising MT concentrations， reaching its maximum in the 150 μmol·L^-1 MT treatment. The membership function analysis indicated that the 90 μmol·L^-1 MT treatment exerted the strongest effect to alleviate the symptoms of low-phosphorus stress in alfalfa plants. The trends in the responses of variety 7890 （tolerant to low phosphorus） and variety 15578 （sensitive to low phosphorus） to MT were the same， but variety 15578 showed a greater level of improvement with MT treatment under LP stress， indicating that the alleviating effect of MT is greater for materials that are sensitive to low-phosphorus conditions. The results of this study provide a theoretical basis and technical approach for using MT to improve the phosphorus-use efficiency of crops.

Graphical abstract

关键词

紫花苜蓿 / 褪黑素 / 低磷胁迫 / 内源激素 / 有机酸

Key words

alfalfa / melatonin / low phosphorus stress / endogenous hormone / organic acid

磷作为一种不可再生的矿质营养元素，其参与植物光合作用、呼吸作用、信号传递等生理生化过程，并通过调控酶活性及细胞信号转导，影响植物的生长和代谢^［1］。土壤中总磷含量丰富，但95%以上不能被植物直接吸收利用^［2］，严重限制植物磷营养的获取。紫花苜蓿（Medicago sativa）作为多年生优质豆科牧草，具有抗旱、抗寒、生物固氮能力，还兼具适口性好、粗蛋白含量及干草产量高等优点，被誉为“牧草之王”^［3］，土壤有效磷含量为10~15 mg·kg⁻¹时才能满足其正常生长发育需求^［4］。在石灰性土壤中，磷酸盐离子易与钙、镁等金属离子结合；而在酸性土壤中，则易与铁、铝等金属离子产生螯合固定^［5］，这些均导致土壤中有效磷含量短缺，难以满足苜蓿的生长需求。为实现作物高产，农业生产中投入大量磷肥，被植物吸收利用的无机磷肥大约占12.6%，滞留在土壤中的无机磷肥却高达67.2%，其加剧了水体富营养化和土地污染等环境问题，不利于农业发展^［6］。同时，伴随磷矿快速消耗，磷资源可能会在未来50~200年间面临枯竭。为应对未来缺磷对农业生产带来的危机，探究有效缓解苜蓿低磷胁迫的途径显得尤为重要。

研究表明，褪黑素（melatonin，MT）在植物生长发育、生理调节和逆境响应中发挥着多重调控作用。作为信号分子，可以调节植物的种子萌发、根系发育、开花结果等生长发育过程^［7］；作为抗氧化剂，通过提高抗氧化酶活性，不仅可有效清除胁迫诱导产生的大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），保护植物细胞免受氧化损害，还能通过调控内源激素平衡来影响植物的胁迫响应，从而增强植物抵抗逆境胁迫的能力^［8］。

内源激素是植物自身代谢所产生的一类有机物质，也是调控生长发育和逆境响应的核心信号分子。脱落酸（abscisic acid，ABA）、生长素（auxin，IAA）、玉米素（zeatin，ZT）和赤霉素（gibberellic acid，GA）等植物激素均被研究证明参与逆境胁迫^［9］，逆境胁迫下植物激素含量会发生变化以调节细胞代谢进程，而MT通过调控相关基因表达，直接或间接参与生长素载体蛋白和IAA、GA₃、ABA等植物激素的代谢^［10］。研究表明，IAA主要通过生长素响应因子（auxin response factor，ARF）结合磷酸盐转运蛋白1家族（phosphate transporter 1 family，PHT1）启动子的生长素响应元件（auxin response element，AuxRE）直接调控磷转运蛋白促进拟南芥（Arabidopsis thaliana）对磷的吸收利用^［11］；GA₃可消除抑制生长发育的DELLA蛋白（della proteins）^［12］，调控种子萌发、茎叶生长和光合作用^［13］并延缓叶片衰老^［14］；ABA通过调节耐低磷蛋白的表达水平影响磷素利用效率^［15］。王子苑等^［16］研究表明，低磷胁迫对高羊茅（Festuca arundinacea）GA₃和IAA含量促进作用明显，而对ABA含量有抑制作用。研究表明，低磷环境下，与磷低效型玉米（Zea mays）相比，磷高效基因型玉米的ZT含量降幅更小，IAA、GA₃含量增幅更大，ABA含量增幅更小^［17］。

根系分泌物是植物根系向周围环境释放的多种物质，充当植物与外界进行物质交换的重要媒介，其中有机酸、质子和酸性磷酸酶是影响土壤有效磷的主要根系分泌物^［18］。研究发现，低磷胁迫下，不同作物种类甚至是不同品种的同类作物，其分泌的有机酸种类和数量都会有所差异^［19］。低磷胁迫下，棉花（Gossypium hirsutum）根系苹果酸、柠檬酸分泌量显著增加，有效促进了Al-P、Fe-P和Ca-P等难溶性无机磷的活化与利用，显著增强了植物对磷素的吸收能力^［20］。目前，关于MT对植物影响的研究主要集中在干旱^［21］、盐碱^［22］、冷害^［23］、镉^［24］等非生物逆境胁迫方面，有关外源MT增强苜蓿幼苗抵抗低磷逆境的研究鲜见报道。因此，本研究以耐低磷、磷敏感苜蓿为对象，低磷胁迫处理后喷施不同浓度的外源MT，测定苜蓿幼苗内源激素及有机酸等生理指标，旨在分析外源MT对苜蓿幼苗耐低磷的保护作用，筛选最佳浓度，以期为低磷区苜蓿种植及栽培管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以前期筛选的耐低磷（材料zxy2008p-7890）和磷敏感（材料zxy2010p-15578）苜蓿为试验材料^［25］，2份材料均从俄罗斯瓦维洛夫植物基因库引进。

1.2 试验方法

于2024年9月在甘肃农业大学植物生长室进行试验，供试苜蓿种子经表面消毒后，播种于经高温灭菌的砂质基质中。幼苗培养在光周期14 h/10 h（昼/夜）、昼夜温度（25±1） ℃/（20±1） ℃、光强400 μmol·m⁻²·s⁻¹、相对湿度60%的人工气候室内。每杯保留长势一致、健康无病害的15株幼苗，定期定量（每24 h 70 mL）浇灌Hoagland营养液直至幼苗高度达15 cm时开始处理。参考Xia等^［26］的试验设计，以仅浇灌Hoagland营养液的幼苗作为对照（常磷：1.0 mmol·L^-1，NP），浇灌含0.01 mmol·L^-1的Hoagland营养液作为低磷胁迫处理（LP），用KCl平衡调整K⁺。胁迫20 d后，对其进行不同浓度MT根灌处理，即LP+30 μmol·L^-1 MT（T₁）、LP+60 μmol·L^-1 MT（T₂）、LP+90 μmol·L^-1 MT（T₃）、LP+120 μmol·L^-1 MT（T₄）、LP+150 μmol·L^-1 MT（T₅）。每2 d于18：00时以根灌外源MT，每次70 mL；共根施6次，12 d后测定相关指标；NP和LP处理根灌等量的营养液。

1.3 测定指标及方法

用卷尺随机测量10株植株的绝对高度，求均值为株高；采用叶面积仪（LI-3000C，美国LI-COR公司）测定叶面积；用蒸馏水将苜蓿植株上的砂土洗净，地上与地下部交界处进行分离，分别称重地上和地下鲜生物量，在烘箱105 ℃下杀青30 min，调至70 ℃烘干至恒重后分别称干重；参考邹琦^［27］的方法：叶片相对含水量采用饱和称重法进行测定。即取2片完全展开叶片称其鲜重，浸泡在蒸馏水中静置24 h，取出擦干后称量饱和鲜重；烘干至恒重，称其干重，叶片相对含水量=（鲜重-干重）/（饱和鲜重-干重）×100%。

参考汪堃等^［28］的方法进行植物激素含量测定：即取苜蓿根系，于液氮中快速研磨成细粉，分装至离心管，加入预冷的色谱级甲醇于4 ℃下浸提24 h。冷冻离心机8000 r·min^-1离心15 min并吸取上清液，在旋转蒸发仪下浓缩去除甲醇。浓缩至2 mL左右时取出浓缩液并过0.22 μm有机膜，于四元梯度超快速液相色谱仪Waters Arc-2998PDA Waters（沃世特公司，美国）进样测定内源激素（ZT、IAA、ABA、GA₃）含量。

取新鲜苜蓿根系，用去离子水充分冲洗，滤纸吸干表面水分，准确称取10 g根，磨成匀浆，转移到离心管中。加入25 mL超纯水超声提取1 h，使有机酸充分浸出。冷冻离心机8000 r·min^-1离心15 min并吸取上清液，将残留物加入10 mL超纯水中重新提取。上清液混合后过0.22 μm水系膜，将样品注入色谱柱（Thermo Fisher， Hypesil Gold， C18）中，测定有机酸（草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸）含量^［29］；每个指标重复3次。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2021进行数据整理，Origin 2021软件绘图，SPSS 25.0进行方差分析，Duncan’s进行多重比较。

通过隶属函数法综合评价后得出最适MT浓度。与LP胁迫呈正相关的指标，计算公式为F_{ij}=(X_{ij}-X_{j\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}})/(X_{j\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-X_{j\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}})；与LP胁迫呈负相关的指标，计算公式为F_{ij}=\mathrm{1}-(X_{ij}-X_{j\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}})/(X_{j\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-X_{j\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}})。式中：F_{ij}为i材料的j性状的隶属函数值；X_{ij}为i材料j性状测定值；X_{j\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}为j性状中最小值；X_{jmax}为j性状中最大值。

采用客观赋权法计算各指标权重（W_j），计算公式为：W_j=I_j/{\sum }_{j=\mathrm{1}}^n{I}_j。与LP胁迫呈正相关的指标为I_j=C_j/S_j，与LP胁迫呈负相关的指标为I_j=S_j/C_j。式中：I_j为测定值与对照组的比值，C_j为对照组第j个指标的测定值，S_j为处理组第j个测定指标的平均值。耐低磷性综合评价值为D={\sum }_{j=\mathrm{1}}^n(F_{ij}\times W_j)。

2 结果与分析

2.1 苜蓿材料生长差异分析

与NP相比，LP下供试苜蓿株高、叶面积、地上及地下生物量、叶片相对含水量均显著降低（P<0.05，图1），其中耐低磷材料7890分别下降了19.67%、33.33%、31.99%、53.10%、9.91%；磷敏感材料15578分别下降了25.69%、34.21%、38.25%、53.24%、68.59%。随外源MT浓度的增加，2份供试苜蓿的株高、叶面积、地上及地下生物量、叶片相对含水量均先升后降，且以T₃处理效果最佳，T₃处理下，材料7890较LP分别显著上升了16.55%、34.62%、32.41%、86.78%、9.80%（P<0.05），材料15578较LP分别显著增加了26.75%、32.00%、44.88%、108.91%、20.24%（P<0.05）。

2.2 苜蓿材料内源激素对比分析

与NP相比，LP胁迫导致2份苜蓿材料根系ZT、GA₃及IAA的含量均显著下降（P<0.05，图2）。随着外源MT浓度增加，材料7890和15578根系ZT、GA₃及IAA含量均先上升后下降，在T₃浓度达到最大值，相较于LP，分别上升了10.45%、15.74%、49.56%和28.64%、107.20%、70.21%，但均低于NP（P<0.05）。根系ABA含量在LP胁迫下均较NP显著上升（P<0.05），随着外源MT浓度增加，ABA含量均先下降后上升，且在T₃浓度降到最低（P<0.05），相较于LP，材料7890和15578含量分别显著下降13.95%、24.80%。施加低浓度（30、60 μmol·L^-1）MT时，2份材料的ZT、IAA含量与LP无显著差异。总体上，耐低磷材料7890根系的ZT、GA₃及IAA含量显著高于磷敏感材料15578（P<0.05）。

2.3 苜蓿材料有机酸对比研究

与NP相比，LP胁迫下供试苜蓿根系琥珀酸、富马酸、柠檬酸、草酸及苹果酸含量均显著增加（P<0.05，图3）。施加外源MT后，随着MT浓度增加，琥珀酸、富马酸、柠檬酸、草酸、苹果酸及乳酸含量均先上升后下降，在T₃达到最大值，材料7890和15578的琥珀酸、富马酸、柠檬酸、草酸、苹果酸及乳酸含量较LP处理分别显著上升了50.14%、11.54%、61.21%、37.34%、39.06%、20.05%和56.09%、12.00%、55.24%、29.50%、30.71%、9.17%（P<0.05）。

2.4 隶属函数综合评价

基于隶属函数综合评价结果（表1）显示，不同外源MT处理对提高苜蓿耐低磷性的效果依次为T₃>T₂>T₄>T₁>LP>T₅，T₃处理（90 μmol·L^-1 MT）下D值最高，表明该浓度对缓解苜蓿低磷胁迫损伤的效果最佳。

3 讨论

3.1 外源MT对低磷胁迫下苜蓿生长的影响

植物苗期对磷元素的缺失尤为敏感，低磷胁迫显著抑制植物的生长发育，表现为植株发育延缓、矮化、叶片呈现暗绿色或紫红色等^［14］。有研究发现，盐胁迫下施加MT可促进大豆（Glycine max）生长，株高、叶面积等指标随MT浓度增大呈先升后降的趋势^［30］；低磷胁迫下，外源添加MT使大麦（Hordeum vulgare）根系生长受抑制程度减缓^［31］。本研究发现，LP胁迫降低了2份苜蓿材料的株高、地上、地下生物量及叶面积；但施加MT后，LP胁迫对苜蓿幼苗生长的抑制作用有所缓解，且T₃处理的缓解效果最为明显，其各形态指标及相对含水量达最大值，但T₁和T₂处理下增幅较小，表明90 μmol·L^-1MT浓度能有效改善其形态特征，提升叶片保水能力。这是因为MT作为植物生长调节剂，能够促进植株营养器官的发育，协调地上部与地下部之间养分与同化物的分配，有效促进渗透调节物质的积累，使植物的株高、叶面积、生物量及相对含水量增加^［32］。

3.2 外源MT对低磷胁迫苜蓿内源激素的影响

苜蓿对逆境胁迫的适应性与其内源激素网络的精密调控密切相关^［11］。研究发现，外源MT处理显著降低了黑麦草（Lolium perenne）中IAA的水平^［33］。Li等^［34］研究表明添加MT抑制了ABA合成相关基因环氧类胡萝卜素裂解酶1（NCED1）的上调，减轻胁迫带来的抑制等作用。本研究中，外源MT对苜蓿内源激素的调控呈现出典型的浓度依赖效应。与LP相比，适宜浓度（T₃）的MT处理显著提升了根系中ZT、IAA和GA₃的含量，并显著降低了ABA含量，这种激素水平的变化与Shi等^［35］在拟南芥等植物中的研究结果相吻合，进一步证实了适宜浓度MT通过优化激素平衡以增强植物抗逆性的普遍规律。说明适宜浓度MT通过提高IAA和GA₃含量，激活生长相关生理代谢途径，最终增强苜蓿对LP胁迫的耐受能力^［36］。然而，当MT浓度高于90 μmol·L^-1时缓解效果减弱，ZT、IAA、GA₃和ABA的含量显著低于T₃（P<0.05），表明过量MT可能干扰了内源激素的稳态平衡，抑制了其合成或信号转导，从而抵消甚至逆转其缓解胁迫的积极作用，导致生长受到抑制^［37］。

3.3 外源MT对低磷胁迫苜蓿有机酸含量的影响

低磷胁迫诱导有机酸积累与分泌是植物提高磷素利用效率的重要适应机制之一^［38］。崔会婷等^［39］研究发现，对狗牙根（Cynodon daclylon）施加MT可通过激活抗氧化系统并调控代谢稳态，显著增强其对盐、干旱和冷胁迫的抗性，同时诱导有机酸、氨基酸等胁迫响应代谢物积累。本研究中，LP胁迫显著诱导苜蓿根系有机酸（草酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等）的积累，且外源MT进一步提升了7890和15578两种苜蓿材料根中分泌的柠檬酸、草酸、苹果酸、乳酸含量，表明MT通过增强苜蓿根系有机酸的分泌能力，促进土壤中难溶性磷的活化^［22］，进而提高苜蓿对低磷环境的耐受性^［40］。此外，本研究中，随着MT浓度增加，琥珀酸、富马酸、柠檬酸、草酸、苹果酸及乳酸含量呈先升后降趋势，且材料间增幅存在显著差异。这与任立飞等^［41］在耐低磷黄花苜蓿（Medicago falcata）中的发现一致，可能是由于材料间本身的遗传差异或相关基因的表达水平引起。

4 结论

本研究探明根灌90 μmol·L⁻¹外源褪黑素是缓解紫花苜蓿幼苗低磷胁迫的最佳浓度，且2份材料在响应方式上存在明显差异。其中磷敏感材料15578以生长恢复为主，其株高、叶面积、生物量和相对含水量显著增加；耐低磷材料7890则通过维持更高的根系内源激素（ZT、IAA、GA₃）及有机酸（草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸）水平来保持生理活性。综上所述，2份材料采用不同资源分配策略，增强苜蓿幼苗对低磷胁迫的耐受性。

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基金资助

甘肃省重大专项(25ZDNA005)

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系(CARS-34)