MfERF053增强活性氧清除能力和抗逆相关基因表达提高拟南芥抗旱性

MfERF053 enhances drought resistance of Arabidopsis thaliana by improving reactive oxygen species scavenging capacity and promoting expression of stress-resistance-related genes

摘要

干旱胁迫制约植物生长与农业生产，挖掘抗旱基因并解析其机制对分子育种至关重要。黄花苜蓿MfERF053属于AP2/ERF家族，前期发现其在干旱下表达上调且过表达拟南芥具有抗旱表型，但机制未明。本研究以拟南芥Col-0野生型（Col）及MfERF053过表达株系（#19、#20、#33）为材料，经自然干旱胁迫处理后，测定植株表型、生理及分子指标，以明确其抗旱机制。结果显示：干旱胁迫下，过表达株系萎蔫延迟、复水恢复好；相对含水量显著高于Col（P<0.05），相对电导率与丙二醛含量显著低于Col（P<0.05）；光系统Ⅱ功能更稳定，最大光化学效率、电子传递速率显著高于Col（P<0.05）；过表达株系叶片氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、3，3'-二氨基联苯胺（DAB）染色程度明显浅于Col，表明·O₂⁻、H₂O₂积累减少，且过氧化氢酶和过氧化物酶活性显著高于Col（P<0.05）。分子层面，干旱胁迫下MfERF053过表达株系中，活性氧（ROS）清除相关基因（AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4）及干旱响应（AtRD22、AtRD29A）、低温/干旱交叉响应（AtCOR15A、AtCOR47）、钾离子转运（AtHAK5）、脱落酸（ABA）信号通路（AtABI5）等抗逆相关基因的表达量均显著上调（P<0.05），且多数基因表达量显著高于Col（P<0.05），仅AtRD29A和AtABI5在个别过表达株系中与Col无显著差异。综上，MfERF053可通过增强ROS清除能力、上调抗逆相关基因的表达、协同改善拟南芥干旱下的生理稳态与分子响应，最终提高其抗旱性，为耐旱作物/牧草分子育种提供重要的基因资源与理论依据。

Abstract

Drought stress restricts plant growth and agricultural production， and mining drought-tolerannce genes and analyzing their mechanisms are crucial for molecular breeding. Medicago falcataMfERF053 belongs to the AP2/ERF transcription factor family. Previous studies have shown that its expression is upregulated under drought stress， and Arabidopsis thaliana overexpressing this gene exhibits a drought-tolerant phenotype. However， the underlying mechanism remains unclear. In this study， A. thaliana Col-0 wild type （Col） and MfERF053-overexpressing lines （#19， #20， #33） were used as materials. After natural drought stress treatment， plant phenotypic， physiological， and molecular indicators were determined to clarify the drought-tolerance mechanism of MfERF053. The results showed that under drought stress： the overexpressing lines exhibited delayed leaf wilting and better recovery ability after rehydration； their relative water content （RWC） was significantly higher than that of Col （P<0.05）， while their relative electrical conductivity （REC） and malondialdehyde （MDA） content were significantly lower than those of Col （P<0.05）； the function of photosystem Ⅱ （PSⅡ） was more stable， with the maximum photochemical efficiency （F_v/F_m） and electron transport rate （ETR） significantly higher than those of Col （P<0.05）； the degree of nitroblue tetrazolium （NBT） ［for superoxide anion （·O₂⁻） localization］ and 3，3'-diaminobenzidine （DAB） ［for hydrogen peroxide （H₂O₂） localization］ staining in leaves of the overexpressing lines was significantly lighter than that in Col， indicating reduced accumulation of ·O₂⁻ and H₂O₂， and the activities of catalase （CAT） and peroxidase （POD） were significantly higher than those in Col （P<0.05）. At the molecular level， under drought stress， the expression levels of stress-tolerance-related genes in MfERF053-overexpressing lines， including reactive oxygen species （ROS）-scavenging-related genes （AtCAT1， AtPOD3， AtSOD4）， drought-responsive genes （AtRD22， AtRD29A）， cold/drought cross-responsive genes （AtCOR15A， AtCOR47）， potassium ion transport gene （AtHAK5）， and abscisic acid （ABA） signaling pathway gene （AtABI5）， were all significantly up-regulated （P<0.05）. Most of these genes exhibited significantly higher expression levels in overexpressing lines than in Col （P<0.05）， except that AtRD29A and AtABI5 in individual overexpressing lines showed no significant difference compared with Col. In conclusion， MfERF053 was found to enhance ROS scavenging capacity， upregulate the expression of stress-tolerant-related genes， and synergistically improve the physiological homeostasis and molecular response of A. thaliana under drought， ultimately improving its drought tolerance. This study provides important genetic resources and a theoretical basis for the molecular breeding of drought-tolerant crops/forages.

Graphical abstract

关键词

MfERF053 / 拟南芥 / 抗旱性 / 活性氧清除 / 抗逆相关基因

Key words

MfERF053 / Arabidopsis thaliana / drought resistance / reactive oxygen species scavenging / stress-resistant-related genes

干旱胁迫是全球农业生产面临的首要非生物胁迫因子，其通过破坏植物水分平衡、抑制光合代谢及诱导氧化损伤，导致作物生长受阻、生物量锐减及品质退化，对全球粮食安全构成严峻威胁^［1-3］。因此，解析植物干旱响应的分子调控网络、挖掘具有应用价值的抗旱关键基因，是培育耐旱作物/牧草品种、缓解干旱胁迫对农业生产制约的核心途径，具有重要的理论意义与实践价值^［4-5］。

在长期适应干旱环境的进化过程中，植物形成了多层次、复杂化的抗旱调控体系，其中转录因子作为信号通路的“核心开关”，通过特异性结合下游靶基因启动子的顺式元件（如GCC-box、DRE/CRT），协调基因表达以启动抗旱响应，在调控网络中发挥不可替代的作用^［6-8］。AP2/ERF家族是植物特有的转录因子超家族，其成员广泛参与激素信号转导、生长发育及非生物胁迫（干旱、盐渍、低温等）响应过程，已成为植物抗逆研究领域的核心靶点之一^［9-11］。

近年来，大量研究证实ERF基因可通过多维度机制协同增强植物耐旱性：在激素信号整合层面，ERF蛋白可交叉调控脱落酸（abscisic acid， ABA）、油菜素内酯（brassinosteroid， BR）及乙烯（ethylene）通路，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）TINY通过抑制BR信号通路中BIN2激酶的磷酸化活性，解除其对干旱响应基因的抑制作用，同时激活ABA合成关键基因NCED3以促进ABA积累，最终调控气孔关闭^［12］；杨树（Populus spp.）PalERF2通过乙烯信号通路诱导抗旱相关基因PalRD20与PalSAG113的表达^［13］；水稻（Oryza sativa）OsERF48则通过钙信号通路调控OsCML16的表达，进而增强根系发育以提升水分吸收能力^［14］。在氧化应激防御层面，ERF可通过上调抗氧化酶基因表达或直接激活酶活性，清除干旱诱导积累的活性氧（reactive oxygen species， ROS），如玉米（Zea mays）ZmEREBP60过表达株系中过氧化物酶（peroxidase， POD）活性显著升高，导致过氧化氢（hydrogen peroxide， H₂O₂）与丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量降低^［15］；杨树ERF194通过上调氧化还原酶基因的表达，增强超氧阴离子（superoxide anion， ·O₂^-）的清除能力，减轻干旱导致的氧化损伤^［16］。在渗透调节与次生代谢方面，ERF可调控脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质及花青素的合成，如大豆（Glycine max）GmERF3过表达可显著提高转基因烟草（Nicotiana tabacum）叶片中脯氨酸与可溶性碳水化合物的积累量^［17］；苹果（Malus domestica）MdERF38通过与MdMYB1蛋白互作，促进花青素合成以增强干旱耐受性^［18］。在光合作用保护与气孔行为调控层面，ERF可通过维持光系统稳定性、调控碳代谢及ABA依赖/非依赖通路的气孔运动，保障干旱条件下的光合效率，如水稻OsERF83过表达株系在干旱胁迫下仍保持较高的光化学效率^［19］；番茄（Solanum lycopersicum）TSRF1异源表达可上调水稻光合相关基因的表达^［20］；拟南芥TINY、番茄SlERF84分别通过ABA通路增强ABA敏感性，促进气孔闭合以减少水分蒸腾^{［12，21］}；此外，拟南芥AtRAP2.4还可通过激活表皮蜡质合成基因，降低蒸腾速率并延缓叶绿素降解，揭示了ERF对气孔调节与光合保护的协同作用^［22］。

黄花苜蓿（Medicago falcata）是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有极强的干旱耐受性与抗逆适应性，是挖掘抗旱基因的优质种质资源^［23］。前期研究通过转录组分析发现，黄花苜蓿AP2/ERF家族成员MfERF053在干旱胁迫下表达量显著上调；进一步通过花序侵染法将MfERF053基因转化拟南芥（Columbia-0生态型，Col），获得的过表达株系（overexpression line， OE）相较于野生型（Columbia-0， Col）表现出根系发育增强（主根变长、侧根增多）及干旱胁迫下萎蔫延迟的表型^［24］。但该基因调控抗旱性的核心生理与分子机制尚未解析。本研究以拟南芥野生型（Col）及上述MfERF053高表达株系（OE）为材料，通过自然干旱胁迫处理，结合植株表型观察及水分生理、氧化应激、叶绿素荧光特性与抗逆相关基因表达的测定，明确MfERF053调控拟南芥抗旱性的关键环节，阐明其作用机制，为该基因在耐旱分子育种中的应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

使用拟南芥生态型Columbia-0（Col）作为试验材料，通过花序侵染法^［25］将黄花苜蓿中的MfERF053基因转化至拟南芥中。利用该转化方法共获得25株转基因拟南芥纯合株系，通过荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各株系的MfERF053基因表达量，筛选出3个高表达株系（命名为#19、#20、#33）^［24］，用于后续抗逆性分析。

1.2 试验方法

该验证试验于2025年3-8月在新疆农业大学西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室开展。将野生型（Col）和转基因拟南芥种子用75%乙醇消毒5 min，5%次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水清洗3~4次后，均匀播种于1/2 MS培养基（索莱宝科技有限公司，北京，中国）上。播种后将培养皿置于4 ℃冰箱春化3 d，随后转移至人工气候培养箱中，在16 h光照/8 h黑暗、22 ℃条件下培养。待种子萌发长出子叶（约7 d），将幼苗移栽至装有草炭土∶蛭石=3∶1混合基质的花盆中。每个株系设置9个生物学重复（即9盆），每盆种植9株植株，置于培养箱培养，条件为16 h光照/8 h黑暗、22 ℃，平均光照强度400 μmol·m^-2·s^-1。期间采用定期浇水方式维持基质湿润，每4 d浇一次水。待植株生长至30 d时开始胁迫处理，对照组延续每4 d浇水一次的常规灌溉；处理组则停止人工补水，实施自然干旱胁迫，持续观察植株状态，直至叶片边缘呈现明显黄化表型，此时记录植株表型变化，并采集样品用于后续指标测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 相对含水量（relative water content， RWC）

在干旱胁迫第8天时，分别收集对照组和处理组形状大小相似的叶片，测定鲜质量（fresh weight， W_f）后，将植物置于室温下密封管中的蒸馏水中浸泡4 h，然后在5 ℃下过夜，次日测定饱和质量（turgid weight， W_t）。随后，用锡箔包裹材料在80 ℃干燥至恒定重量（约72 h），这被视为干质量（dry weight， W_d）。按以下公式计算：RWC=（W_f-W_d）/（W_t-W_d）^［26］，各株系重复5次。

1.3.2 相对电导率（relative electrical conductivity， REC）

在干旱胁迫第8天时，分别收集对照组和处理组形状大小相似的叶片，取0.1 g去杂质的样品，放入25 mL试管中，加入去离子水20 mL，将样品浸没，静置3 h，静置过程中每隔30 min振荡一次。在20~25 ℃恒温下用电导仪（DDS-307，上海仪电科学仪器股份有限公司，上海，中国）测定其电导率C₁，再用100 ℃水浴加热10 min，取出静置冷却至室温，在20~25 ℃恒温下测其煮沸电导率C₂。按以下公式计算：REC（%）=（C₁/C₂）×100^［27］，各株系重复5次。

1.3.3 叶绿素荧光

采用植物光合表型测量系统PlantExplorer XS［慧诺瑞德（北京）科技有限公司，北京，中国］测定叶绿素荧光参数；每次测量前，先将供试植物置于黑暗环境中适应30 min，以确保光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ， PSⅡ）反应中心完全开放、消除前期光照对荧光信号的干扰，随后用弱测量光束诱导并记录最小荧光产量（minimum fluorescence yield， F_o），施加饱和脉冲（终止PSⅡ反应中心电子传递）后测定最大荧光产量（maximum fluorescence yield， F_m），计算叶绿素可变荧光（variable fluorescence yield， F_v）=F_m-F_o，并依据最大光化学效率公式（maximum photochemical efficiency， F_v/F_m）=（F_m-F_o）/F_m测定PSⅡ最大量子产额（反映光合系统潜在光化学活性）；暗适应参数测定完成后，将叶片置于感光光线下暴露5 min以达到光适应稳态，再施加饱和光脉冲量化稳态荧光值（steady-state fluorescence yield， F_s）与光适应下最大荧光产量（maximum fluorescence yield under light adaptation， F_m′），接着依据公式测定非光化学淬灭（non-photochemical quenching， NPQ）=（F_s/F_m′）-（F_s/F_m），反映叶片耗散过剩光能以保护光合系统的能力，同步记录电子传递效率（electron transport rate， ETR）（表征PSⅡ反应中心电子传递速率）与光能利用效率（light use efficiency， Alpha）（反映叶片对光能的捕获与转化效率）；各株系重复21次。

1.3.4 生理指标

过氧化氢酶（catalase， CAT）、过氧化物酶（peroxidase， POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量，氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium chloride， NBT）用于超氧阴离子（superoxide anion，·O₂^-）定位染色，3，3′-二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine， DAB）用于过氧化氢（hydrogen peroxide， H₂O₂）定位染色，染色程度直观反映活性氧（reactive oxygen species， ROS）积累水平。均使用相应的试剂盒进行检测（索莱宝科技有限公司，中国北京），3次重复。

1.3.5 RNA提取和RT-qPCR分析

使用TRIzol试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，上海，中国］提取每个样品的总RNA，使用含有gDNase的FastQuant RT试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，北京，中国］合成第一链cDNA。RT-qPCR反应在ABI 7500快速实时PCR系统进行（应用生物系统，福斯特，加利福尼亚州，美国），使用2xSG Fast qPCR主混合［生工生物工程（上海）股份有限公司，上海，中国］。引物使用Primer 5.0软件设计，经NCBI BLAST验证特异性（表1）；测定基因：AtCAT1（编码过氧化氢酶，参与ROS清除）、AtPOD3（编码过氧化物酶，参与ROS清除）、AtSOD4（编码超氧化物歧化酶，参与ROS清除）、AtRD22/AtRD29A（干旱响应基因，参与干旱信号通路）、AtCOR15A/AtCOR47（低温/干旱交叉响应基因，增强逆境适应性）、AtHAK5（钾离子转运基因，维持细胞内渗透压）、AtABI5（ABA信号通路关键基因，调控抗逆响应），均为3次重复。所选基因均为拟南芥中被证实的抗逆通路关键成员，这些基因的功能（ROS清除、干旱信号传导、渗透压维持等）与MfERF053介导的抗旱调控方向契合，因此推测其为MfERF053的下游潜在靶基因。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2010软件整理所有数据；应用SPSS 27.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Duncan多重比较法，检验不同株系（野生型与过表达株系）在相同处理（对照/干旱）下的差异显著性；采用独立样本t检验，比较同一株系在对照与干旱胁迫下的差异显著性（P<0.05为差异显著）；用GraphPad Prism 9.5.1软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下过表达MfERF053正向调控拟南芥的耐旱性

胁迫处理前，野生型（Col）与MfERF053过表达株系（#19、#20、#33）的生长状态一致，均表现为叶片舒展、色泽鲜绿，无明显表型差异（图1）。自然干旱胁迫第8天，Col叶片开始出现轻微萎蔫，叶缘略微卷曲；而过表达株系#19、#20、#33仍保持较好的挺立状态，仅少数株系下部叶片出现轻度失水迹象。胁迫第12天，Col萎蔫程度明显加剧，叶片大面积卷曲且颜色变淡；过表达株系虽有部分叶片萎蔫，但整体株型仍较完整。胁迫持续至第16天，Col叶片已完全萎蔫，部分开始黄化；过表达株系仅中下部叶片严重萎蔫，上部新叶仍保持一定的含水量。胁迫第20天，Col植株整体枯萎，叶片全部黄化；过表达株系虽损伤加重，但仍有少量叶片维持绿色。复水后第5天，#19、#20、#33株系的萎蔫叶片基本恢复舒展，株型逐渐恢复正常；而Col仅少数基部叶片略有恢复，大部分叶片仍处于枯萎状态，且无法恢复生长（图1）。

干旱胁迫下，植株的相对含水量（RWC）、相对电导率（REC）及丙二醛（MDA）含量是反映水分状况与细胞膜完整性的核心指标。对照组，Col与过表达株系的RWC、REC及MDA含量均无显著差异（P>0.05），其中RWC均维持在0.90以上，REC低于10%，MDA含量处于较低水平（低于10 nmol·g^-1），表明各组植株初始生理状态一致（图2）；且各株系干旱胁迫处理组与其对照组相比，RWC显著降低、REC与MDA含量显著升高（P<0.05）。干旱胁迫第8天，Col与过表达株系（#19、#20、#33）的水分生理及膜损伤相关指标呈显著差异（图2）：Col的RWC下降至0.56，而过表达株系#19、#20、#33的RWC分别维持在0.75、0.85、0.84，显著高于Col（P<0.05）；Col的REC升高至53.76%，而过表达株系的REC仅为21.91%~34.13%，显著低于Col（P<0.05）；Col的MDA含量上升至41.69 nmol·g^-1，而过表达株系的MDA含量仅为17.20~20.75 nmol·g^-1，显著低于Col（P<0.05）。综合表型与生理指标（图1和图2）可知，过表达MfERF053能延缓拟南芥干旱损伤进程，同时维持更高的含水量、降低膜损伤，明确其具备正向调控拟南芥耐旱性的能力。

2.2 干旱胁迫下过表达MfERF053提升拟南芥的叶绿素荧光参数

叶绿素荧光参数可直接反映光系统Ⅱ（PSⅡ）的功能状态及光合系统对逆境的适应能力。对照组，Col与过表达株系的最大光化学效率（F_v/F_m）、非光化学淬灭（NPQ）、电子传递效率（ETR）及光能利用效率（Alpha）均无显著差异（P>0.05），其中F_v/F_m维持在0.75~0.77，表明各组植株的光合系统初始状态正常（图3）；且各株系干旱胁迫处理组与其对照组相比，F_v/F_m、ETR、Alpha显著降低（#20的Alpha降低，但不显著），NPQ显著升高（P<0.05）。干旱胁迫第12天，Col与过表达株系（#19、#20、#33）的叶绿素荧光参数存在明显差异（图3）：Col的F_v/F_m下降至0.58，而过表达株系#19、#20、#33的F_v/F_m分别维持在0.69、0.70、0.69，显著高于Col（P<0.05）；Col的NPQ升至0.99，而过表达株系的NPQ为0.35~0.41，显著低于Col（P<0.05）；Col的ETR下降至36.93，而过表达株系的ETR维持在49.78~52.95，显著高于Col（P<0.05）；Col的Alpha下降至0.79，而过表达株系的Alpha维持在0.85~0.87，显著高于Col（P<0.05）。综上可知，过表达MfERF053能减少干旱对PSⅡ的破坏、维持电子传递效率与光能利用能力，有效保护拟南芥的光合系统功能。

2.3 干旱胁迫下过表达MfERF053提高拟南芥抗氧化酶活性以增强ROS清除能力

干旱胁迫会诱导植物体内超氧阴离子（·O₂^-）、过氧化氢（H₂O₂）等活性氧（ROS）大量积累，NBT染色（·O₂^-定位）与DAB染色（H₂O₂定位）可直观反映ROS积累程度（染色越多，含量越高）。由图4A，B可知，对照组，Col与MfERF053过表达株系（#19、#20、#33）叶片均仅轻微染色，·O₂^-与H₂O₂含量低且无明显差异；干旱胁迫第12天，Col叶片经NBT染色呈深紫色、DAB染色呈深褐色，表明·O₂^-与H₂O₂大量积累，而过表达株系仅叶脉附近出现少量浅色斑点，染色程度明显更轻，说明过表达MfERF053可显著抑制干旱下·O₂^-与H₂O₂的积累，降低氧化损伤。同时，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是清除ROS的核心抗氧化酶，由图4C~E可知，对照组的CAT、POD活性表现为，Col与部分过表达株系（#19、#33）存在显著差异（P<0.05），但SOD活性在Col与过表达株系间无显著差异（P>0.05）。干旱胁迫情况下，与对照组相比，各株系3种酶活性显著上升（P<0.05）；Col的CAT、POD、SOD活性分别仅为1030.56、3209.85、76.00 U·g^-1，而过表达株系3种酶活性分别升高至1539.06~2153.78、5394.93~10507.00、79.89~97.66 U·g^-1，除SOD活性在Col与过表达株系#19无显著差异外（P>0.05），过表达株系酶活性显著高于Col（P<0.05）。表明过表达MfERF053可通过提高抗氧化酶活性增强ROS清除能力。

为解析抗氧化酶活性升高的分子机制，检测拟南芥抗氧化酶关键编码基因（AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4）表达水平（图5），结果显示，对照组Col与过表达株系的3种基因相对表达量均处于低水平；干旱胁迫后，与对照组相比，各株系3种基因相对表达量显著上升（P<0.05），Col的AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4相对表达量分别提高5.93、3.18、3.69倍，而过表达株系3种基因的相对表达量分别提高5.18~10.87倍、6.02~32.87倍、6.49~10.72倍，显著高于Col（P<0.05）。这一结果表明，过表达MfERF053可通过上调AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4的转录水平，促进下游CAT、POD、SOD的合成与活性提升，最终增强拟南芥的ROS清除能力。

2.4 过表达MfERF053促进拟南芥中抗逆相关基因的表达

抗逆相关基因的表达调控是植物应对干旱胁迫的核心分子机制，本研究针对拟南芥中不同功能类型的抗逆相关基因展开检测，包括干旱响应基因（AtRD22、AtRD29A）、低温/干旱交叉响应的COR家族基因（AtCOR15A、AtCOR47）、钾离子转运基因（AtHAK5）及脱落酸（ABA）信号通路关键基因（AtABI5），结果如图6所示。对照组，Col与过表达株系（#19、#20、#33）的上述基因均处于低表达状态，表明各组植株初始基因表达水平相对一致；这一现象符合AP2/ERF家族转录因子的调控特征-多数ERF成员需依赖胁迫信号（如干旱诱导的ABA积累、ROS爆发）激活下游共调控因子（如bZIP类AtABI5、MYB类转录因子），或通过逆境触发的靶基因启动子区域修饰（如组蛋白乙酰化、DNA甲基化动态调整）解除转录抑制，才能有效结合DRE/CRT等顺式元件并启动表达。非干旱条件下，缺乏上述胁迫信号与共激活因子，即使MfERF053过表达，也难以单独驱动抗逆相关基因的高表达。且各株系干旱胁迫处理组的抗逆相关基因表达量均显著高于对照组（P<0.05）。干旱胁迫后，Col与过表达株系的基因表达水平呈明显差异：在干旱响应基因方面，AtRD22在Col中的相对表达量提高3.47倍，而过表达株系#19、#20、#33的AtRD22相对表达量分别升高3.14、47.91、52.81倍（图6A），AtRD29A在Col中的相对表达量提高3.91倍，而过表达株系的AtRD29A相对表达量显著升高8.53~50.07倍（图6B），除AtRD29A相对表达量在Col与过表达株系#33无显著差异外（P>0.05），二者的过表达株系基因相对表达量均显著高于Col（P<0.05）；在COR家族基因方面，AtCOR15A在Col中的相对表达量提高2.69倍，而过表达株系的AtCOR15A相对表达量升高10.79~30.59倍（图6C），AtCOR47在Col中的相对表达量提高3.75倍，而过表达株系的AtCOR47相对表达量显著升高9.38~39.36倍（图6D），2个基因的相对表达量均表现为过表达株系显著高于Col（P<0.05）；在钾离子转运基因AtHAK5方面，Col的AtHAK5相对表达量提高24.11倍，而过表达株系的AtHAK5相对表达量显著升高37.43~142.78倍（图6E），且显著高于Col（P<0.05）；在ABA信号通路基因AtABI5方面，Col的AtABI5相对表达量提高1.91倍，而过表达株系的AtABI5相对表达量显著升高7.18~81.28倍（图6F），除过表达株系#19与Col无显著差异外（P>0.05），过表达株系#20和#33均显著高于Col（P<0.05）。综上，过表达MfERF053可通过上调干旱响应、COR家族、钾离子转运及ABA信号通路等多类抗逆相关基因的表达，强化拟南芥对干旱胁迫的分子响应机制。

3 讨论

3.1 MfERF053通过“保水-膜保护”协同维持干旱下的水分平衡

水分平衡与细胞膜完整性是植物应对干旱的首要生理屏障，前者保障细胞代谢的基础水分供应，后者维持胞内生理环境稳定^［28］。本研究结果显示，干旱胁迫第8天，MfERF053过表达株系叶片相对含水量（RWC，0.75~0.85）显著高于Col（0.56），而相对电导率（REC，21.91%~34.13%）与丙二醛（MDA，17.20~20.75 nmol·g^-1）含量显著低于Col（53.76%、41.69 nmol·g^-1）（图2）。这一结果表明，MfERF053可通过双重途径维持干旱下的细胞稳态：一方面减少细胞水分流失，确保代谢所需水分；另一方面抑制膜脂过氧化——MDA作为膜脂过氧化的特征产物，其含量降低直接反映膜损伤减轻^［29］，REC降低则说明细胞膜透性稳定，避免胞内电解质外渗导致的代谢紊乱，这与多数抗逆基因通过“水分保留-膜保护”协同提升抗逆性的核心逻辑一致^［30］。

从调控逻辑来看，MfERF053这种“保水-膜保护”的双重协同模式，与同类ERF基因的调控策略既有共性也存在差异。Zhu等^［15］研究玉米ZmEREBP60时发现，其过表达株系虽能通过降低MDA与REC减轻膜损伤，但对植株RWC的提升效果未达显著水平，推测该基因更侧重通过膜保护缓解干旱损伤，而缺乏对水分运输相关过程的调控；Liu等^［31］发现玉米ZmSDD1通过降低气孔密度减少蒸腾失水，虽能提升RWC，但对膜脂过氧化的抑制作用较弱，表明其调控重心集中在水分保留环节。相比之下，MfERF053同时实现“高保水-低膜损伤”，可能源于其对水分运输基因（如水孔蛋白基因）与膜修复基因（如膜脂合成基因）的同步调控，这种多靶点调控模式进一步拓展了ERF基因调控水分平衡的维度。此外，拟南芥TINY基因通过激活ABA合成基因NCED3促进气孔关闭以减少水分流失^［12］，但未检测到其对膜完整性的保护作用；拟南芥AtRAP2.4通过激活表皮蜡质合成同时实现“保水-膜保护”^［22］，与MfERF053的调控逻辑相似，体现了ERF基因在多维度抗逆中的保守性。

3.2 MfERF053通过维持光系统Ⅱ功能稳定光合电子传递，保障干旱下的能量供应

光合作用是植物干旱胁迫下能量积累的核心来源^［32］，光系统Ⅱ（PSⅡ）作为光合电子传递链的关键组件，其功能稳定性直接影响光合效率^［33］。本研究结果显示，干旱胁迫第12天，Col的PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）降至0.58、电子传递速率（ETR）降至36.93，表明PSⅡ反应中心因干旱胁迫出现严重失活；而MfERF053过表达株系的F_v/F_m维持在0.69~0.70、ETR维持在49.78~52.95，且光能利用效率（Alpha）更高、非光化学淬灭（NPQ）更低（图3）。这一结果表明，MfERF053可通过维持PSⅡ反应中心活性、优化光能分配，减轻干旱对光合系统的损伤，为植株生长发育提供必要的能量支撑。

已有研究中，不同物种ERF基因对光合系统的调控功能呈现差异，这主要源于各研究设定的核心观测方向与检测指标不同。Jung等^［19］在水稻OsERF83的研究中，仅将PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）作为核心检测指标，未延伸分析电子传递速率（ETR）与光能利用效率（Alpha），因此仅揭示了该基因对PSⅡ反应中心潜在活性的保护作用；Yang等^［22］研究拟南芥AtRAP2.4时，重点关注表皮蜡质合成与蒸腾失水过程，虽发现其可间接缓解光合抑制，但未针对PSⅡ功能相关指标展开深入检测，未能明确其对PSⅡ本身的调控作用。本研究中MfERF053对F_v/F_m、ETR、Alpha及NPQ的同步调控效应，是基于对拟南芥干旱胁迫下PSⅡ功能多维度指标的系统检测所得，反映了该基因在本试验体系中对光合系统的直接调控作用。从潜在机制来看，PSⅡ反应中心的D1蛋白是干旱胁迫的敏感靶点，胁迫下易发生损伤降解，而AtFTSH家族基因编码的蛋白酶可促进受损D1蛋白降解与新蛋白合成，维持PSⅡ的结构稳定^［34］；这一研究结果为理解MfERF053如何维持PSⅡ功能提供了参考方向，提示其可能通过调控PSⅡ修复相关基因表达发挥作用，但具体调控靶点仍需后续试验进一步验证。

3.3 MfERF053通过调控抗氧化酶相关基因与活性，增强拟南芥干旱下的ROS清除能力

干旱胁迫下，植物呼吸代谢紊乱与光合电子传递受阻会导致活性氧（ROS，如·O₂⁻、H₂O₂）过量积累，进而引发膜脂过氧化、蛋白质变性及核酸损伤，而抗氧化酶系统（CAT、POD、SOD）是植物清除ROS、维持细胞氧化还原稳态的关键防线^［35-36］。本研究结果显示，干旱胁迫第12天，通过NBT与DAB染色可直观观察到，MfERF053过表达株系叶片中·O₂⁻与H₂O₂的积累量低于Col（图4A，B）；定量检测进一步证实，过表达株系的CAT活性（1539.06~2153.78 U·g^-1）、POD活性（5394.93~10507.00 U·g^-1）分别为Col（1030.56 U·g^-1、3209.85 U·g^-1）的1.5~2.1倍、1.7~3.3倍（P<0.05），表明MfERF053的表达可提升拟南芥的ROS清除能力，从而减轻氧化损伤。从分子调控来看，过表达株系中抗氧化酶编码基因AtCAT1（升高5.18~10.87倍）、AtPOD3（升高6.02~32.87倍）、AtSOD4（升高6.49~10.72倍）的相对表达量显著高于Col（5.93、3.18、3.69倍）（图5），提示MfERF053可能通过上调这些基因的转录水平，促进抗氧化酶蛋白合成，进而提升酶活性，最终增强ROS清除效率，这一调控逻辑与ERF家族基因常通过激活抗氧化酶基因参与抗逆响应的报道相符^［37］。

不同物种中ERF基因对ROS清除系统的调控，往往与研究中关注的基因类型、酶活性指标及胁迫条件相关，呈现出不同的功能侧重点。Huan等^［16］对杨树ERF194的研究，重点分析了其对氧化还原酶基因及`O₂⁻清除的影响，未涉及CAT与POD活性；Zhang等^［17］对大豆GmERF3的研究，则主要观测了CAT、POD活性及部分相关基因，对SOD的调控分析较少，这些差异更多源于研究设计的聚焦方向不同。本研究中MfERF053对AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4及对应酶活性的调控，是基于拟南芥干旱胁迫下ROS清除关键环节的检测结果，反映了该基因在本试验体系中对3类抗氧化酶相关基因的调控作用。此外，过表达株系ROS清除能力的增强，与前文所述“相对电导率降低、MDA含量下降”的膜损伤减轻表型形成关联——ROS积累减少可直接降低膜脂过氧化程度^［15］，这一关联为理解MfERF053如何通过调控ROS清除过程，辅助维持细胞稳态提供了试验依据，也为后续深入验证其具体调控靶点（如是否直接结合这些基因启动子）奠定基础。

3.4 MfERF053调控多类抗逆相关基因表达，关联拟南芥干旱响应的关键生理过程

植物抗旱是多基因、多通路协同响应的复杂过程，转录因子通过调控下游靶基因的表达，整合胁迫信号并协调生理代谢适应逆境^［8，37］。本研究通过基因表达分析发现，MfERF053可显著上调拟南芥中多类与抗逆功能相关的基因，且这些基因的表达变化与前文观测到的生理表型存在明确关联：在干旱信号响应层面，过表达株系中AtRD22、AtRD29A的相对表达量显著高于Col，其中AtRD29A含ERF家族经典结合元件DRE，其表达上调通常与植物对干旱信号的感知和早期响应相关^［38］，这与过表达株系“萎蔫延迟、复水恢复好”的表型形成呼应；在交叉胁迫适应层面，AtCOR15A、AtCOR47的表达提升，这类基因此前被报道可同时响应低温与干旱胁迫^［39］，暗示MfERF053可能参与拟南芥对多重非生物胁迫的适应性调控；在离子平衡维持层面，钾离子转运相关基因AtHAK5的高表达，与过表达株系“相对含水量更高”的生理特征相匹配，因AtHAK5介导的钾离子吸收可辅助维持胞内渗透压^［40］，减少干旱下的细胞水分流失；在激素信号关联层面，ABA通路相关基因AtABI5的上调，结合AtABI5可调控气孔关闭相关基因（如AtSLAC1）与抗氧化基因（如AtCAT1）的报道^［41-42］，为过表达株系“ROS积累少、膜损伤轻”的生理表型提供了分子层面的解释（图6）。

从已报道的ERF基因功能来看，不同物种中ERF家族成员的抗逆调控方向存在研究重点的差异，这与研究设计中关注的生理过程或基因类型相关。Jung等^［14］在水稻OsERF48的研究中，重点解析了其通过钙信号通路调控根系发育的机制，该研究主要聚焦器官形态建成与水分吸收的关联；Huan等^［16］对杨树ERF194的研究，则以ROS清除相关指标与基因为核心，揭示其在氧化应激防御中的作用。本研究中MfERF053调控的基因类型，涵盖了干旱信号响应、离子平衡、激素信号关联等多个与抗旱相关的功能方向，这种调控范围的差异，本质是不同ERF基因在植物抗逆网络中功能分工的体现。值得注意的是，拟南芥中AtDREB2A也被报道可调控多类抗逆相关基因^［43］，本研究中MfERF053的调控特征与其有相似之处，但调控的基因类型和幅度有差异，这可能与拟南芥不同基因型或试验胁迫条件的差异相关，也反映了转录因子调控的物种特异性与环境依赖性。本研究中这些基因的协同表达，为理解MfERF053如何通过分子层面的调控，关联并优化拟南芥干旱下的生理适应过程提供了线索，也为后续深入解析其具体调控靶点与信号关联机制奠定基础。

4 结论

本研究证实，过表达黄花苜蓿MfERF053基因可从生理与分子层面协同增强拟南芥抗旱性：生理上，能延缓干旱胁迫下植株萎蔫进程，维持更高的相对含水量，减轻细胞膜损伤与氧化应激，同时保护光系统Ⅱ功能、维持光合效率；分子上，可显著上调抗氧化酶相关基因（AtCAT1、AtPOD3、AtSOD4）及干旱响应、COR家族、钾离子转运、ABA信号通路等抗逆相关基因的表达，进而激活ROS清除机制与干旱响应通路。综上，MfERF053是调控植物抗旱性的关键基因，可为耐旱作物/牧草分子育种提供重要的基因资源与理论支撑。

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基金资助

自治区高校基本科研业务费科研项目(XJEDU2023P054)