昭苏县绿草莓叶斑病病原鉴定及其生物学特性

Identification of the pathogen and biological characteristics of Fragaria viridis leaf spot in Zhaosu County， China

摘要

绿草莓是昭苏县部分天然草原上的优势物种，叶斑病发生普遍。为明确引起绿草莓叶斑病的病原种类及生物学特性，本研究对新疆维吾尔自治区昭苏县采集的绿草莓叶斑病病样进行分离鉴定，分离的真菌根据形态学和多基因联合系统发育树进行鉴定。结果表明，共分离得到3种病原真菌，分别为交链格孢、Colletotrichum tibetense、Ascochyta nigripycnidia。生物学特性研究结果显示，三者均在25 ℃时生长最快，且可耐受pH范围较宽，为4~11，当pH为7~8时，菌丝发育最佳，此时测得的菌落直径显著大于其他pH条件（P<0.05）。交链格孢的最适培养基为玉米粉琼脂培养基（CMA），最适碳源、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨；A. nigripycnidia在不同供试培养基中生长均较为缓慢，最适生长培养基为马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA），在菌丝生长过程中，硫酸铵和可溶性淀粉分别作为氮源和碳源，展现出最好的利用效率（P<0.05）；可溶性淀粉与蛋白胨分别为C. tibetense菌丝生长最理想的碳源与氮源（P<0.05），且该菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上菌丝生长最为迅速。3种病原菌在不同光照条件下菌丝生长较好。通过致病性测定，发现交链格孢、C. tibetense、A. nigripycnidia均为绿草莓叶斑病的致病菌。其中A. nigripycnidia分离频率最高，为40.15%，为绿草莓叶斑病的主要致病菌。

Abstract

Green strawberry （Fragaria viridis） is a dominant species in some natural grasslands of Zhaosu County， where leaf spot disease occurs widely. To clarify the causal agents responsible for leaf spot disease on green strawberry and their biological characteristics， diseased leaf samples were collected from Zhaosu County， Xinjiang Uygur Autonomous Region， and subjected to fungal isolation and identification. The isolated fungi were identified based on morphological characteristics and multi-locus phylogenetic analyses. Results showed that three pathogenic fungi were obtained： Alternaria alternata， Colletotrichum tibetense， and Ascochyta nigripycnidia. Biological characterization revealed that all three fungi exhibited optimal mycelial growth at 25 ℃ and tolerated a broad pH range （4-11）， with the best growth occurring at pH 7-8， where colony diameters were significantly larger than under other pH conditions （P<0.05）. A. alternata grew best on corn meal agar， with soluble starch and peptone as the optimal carbon and nitrogen sources， respectively. A. nigripycnidia grew relatively slowly on all tested media， with potato-carrot agar supporting the most favorable growth； ammonium sulfate and soluble starch served as the most efficiently utilized nitrogen and carbon sources， respectively （P<0.05）. For C. tibetense， soluble starch and peptone were also the preferred carbon and nitrogen sources （P<0.05）， and its mycelium grew most rapidly on potato dextrose agar. All three pathogens exhibited robust mycelial growth under various light conditions. Pathogenicity assays confirmed that A. alternata， C. tibetense， and A. nigripycnidia are all causal agents of leaf spot disease on green strawberry. Among them， A. nigripycnidia was isolated most frequently （40.15%） and is thus considered the primary pathogen responsible for this disease.

Graphical abstract

关键词

绿草莓 / 叶斑病 / 病原鉴定 / 生物学特性

Key words

Fragaria viridis / leaf spot disease / pathogen identification / biological characteristics

草莓（Fragariaananassa）属于蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）的多年生草本植物，其果实色彩鲜艳，味道独特，具有生长周期短、收获期长和高营养价值的特点，经济价值显著^［1］。我国拥有丰富的野生草莓种质资源，南北各地自然分布着13个品种，其中包括8个二倍体和5个四倍体种类^［2-5］。野生草莓在牧草中具有中等饲用价值，在草甸草原生态系统中占有重要地位，且具有一定产量。新疆地区存在两种野生草莓，分别是野草莓（Fragaria vesca）和绿草莓（Fragaria viridis）^［3］。相较于栽培品种，野生草莓在营养成分、品质、香气和抗病性方面表现更优，是进行草莓遗传改良的重要资源，具备广泛的育种应用前景^［6］。

草莓在生长发育过程中易受多种病害侵染，据国内外研究报道，其主要病害及对应的优势病原菌如下：褐色轮斑病，由暗拟茎点霉（Phomopsis obscurans）引起；白粉病，由Sphaerotheca macularis引起；叶枯病，由Diplocarpon earlianum引起；灰霉病，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起；蛇眼病，由草莓球腔菌（Mycosphaerella fragariae）引起；黑斑病，由交链格孢（Alternaria alternata）引起；炭疽病，由草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）引起^［7］。在上述病害中，叶斑病是草莓生长周期内发生普遍且危害较重的病害之一。根据现有研究，引起草莓叶斑病的主要病原菌有斑污拟盘多毛孢（Pestalotiopsis maculans）^［8］、新拟盘多毛孢（Neopestaloti-opsis rosae）^［9］、交链格孢菌^［10］和燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）^［11］等。

本研究于2023-2024年对新疆昭苏县草原病害进行调查与病原鉴定，发现当地野生草莓以绿草莓为主，是昭苏县开斯克草场、巴勒克苏星空草原、吐格勒勤布拉克村等草原的优势种，在群落中占据明显优势，平均相对盖度达33.3%。调查期间发现，绿草莓叶斑病每年5-8月均有发生，各草地田间发病率普遍超过50%。截至目前，国内尚未见对此病害的报道。本研究以昭苏县绿草莓叶斑病的病原为对象，通过对其进行种类鉴定与生物学特性分析，进而为该病害的科学防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 样品材料的调查与采集

2024年5-8月于新疆维吾尔自治区昭苏县开斯克草场、巴勒克苏星空草原、吐格勒勤布拉克村草原发现绿草莓叶斑类病害，采用随机踏查和5点取样法^［12］，在田间收集典型病叶，同一地形面积小于10 hm²时均匀设置5个1 m×1 m样方；大于10 hm²时每10 hm²为1个调查单元，每1个单元按如上方法取5点进行调查。采用发病叶片数统计样方内的发病率和病情指数，植株发病的严重程度以感病植株叶片受到侵染的面积占总面积的比例来计算（表1），分级标准参照《牧草病害诊断调查与损失评定方法》^［13］；样本带回实验室后，一部分在4 ℃条件下保存备用，另一部分则制成标本。相关公式如下：

\mathrm{发病}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\frac{\mathrm{每个}\mathrm{样方}\mathrm{内发}\mathrm{病的}\mathrm{叶片}\mathrm{数}}{\mathrm{每个}\mathrm{样方}\mathrm{内该}\mathrm{植株}\mathrm{的总}\mathrm{叶片}\mathrm{数}}\times \mathrm{100}

\mathrm{病情}\mathrm{指数}=\frac{\sum \mathrm{病害}\mathrm{级数}\times \mathrm{该级}\mathrm{叶片}\mathrm{数}}{\mathrm{叶片}\mathrm{数总}\mathrm{和}\times \mathrm{发病}\mathrm{最重}\mathrm{级的}\mathrm{代表}\mathrm{数值}}\times \mathrm{100}

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 病原菌的分离及纯化

采用常规组织分离法^［14］对患病绿草莓叶片组织进行分离，在超净工作台（HCB-1300V，青岛海尔生物医疗股份有限公司）中将绿草莓叶部组织病健交界处切取5 mm×5 mm的小块，对病块进行消毒，相继用75%酒精浸泡5 s，1%次氯酸钠浸泡30 s，最后无菌水漂洗3次，待水分自然蒸发后，将小块病组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA；20 g·L^-1葡萄糖，20 g·L^-1琼脂，200 g·L^-1马铃薯，1000 mL蒸馏水）上，每皿10片，重复3次，并在25 ℃恒温条件下培养。

将病组织块在恒温培养箱（RXZ-280C，宁波杨辉仪器有限公司）中培养3~5 d，待菌落形成后，使用接种针从病组织块边缘挑取菌丝，并将其转移到新的PDA培养基中，继续培养5~7 d后，再次挑取菌丝进行单孢分离，培养2 d后单一菌落开始显现，从中挑选出最为纯净的单菌落，移至新的PDA培养基上，从而完成病原体的分离与纯化步骤^［15］。

1.2.2 致病性的测定

对绿草莓叶片进行离体接种试验：选取健康且大小相似的绿草莓叶片进行表面消毒，用无菌接种针轻轻刺伤叶片表面，将菌丝块放置在针刺部位，对照组则接种大小相等的无菌PDA。将处理的叶片置于一次性培养皿中，并放入无菌水打湿的灭菌纱布。重复3次，所有样本放入25 ℃的培养箱中黑暗培养，每日观察叶片发病状况。待发病后，采用柯赫氏法则验证病原菌^［16］。

1.2.3 病原菌形态学鉴定

将病原菌置于PDA平板的中心位置，25 ℃环境下培养5~7 d，仔细观察菌落的外观特征，包括形态和颜色。当病原菌开始产孢时，利用显微镜（ECLIPSE Ni-U生物显微镜，上海尼康仪器有限公司）观察并拍摄分生孢子及分生孢子梗的结构，参考《真菌鉴定手册》^［17］和《中国真菌志》^［18］进行特征比对鉴定病原。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定

将待测菌株接种于PDA培养基平板上，在25 ℃条件下培养5~7 d，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取菌丝体中的基因组DNA^［19］。以纯化的病原菌DNA作为模板，针对炭疽菌属病原菌分别用ITS、GAPDH、ACT、CHS-1、TUB2共5个基因序列进行PCR扩增^［20-23］。壳二孢属分别用ITS、LSU、TUB2共3个基因序列进行扩增^［24］。链格孢属分别用ITS、GAPDH、TEF、ALT共4个基因序列进行扩增^［25］。扩增反应体系为（25 μL）：DNA模板2 μL、10 μmol·L^-1上下游引物各1 μL、2× PCR Mastermix（每1 mL含40 U Taq酶）12.5 μL、ddH₂O 8.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火温度条件下（表2）退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，以条带清晰、单一为标准，选取合格样品送交测序。双向测序结果使用DNAMAN（version 8.0.8.789）进行拼接，并在NCBI上进行BLAST同源性分析，对下载的高相似性序列，使用Phylosuite v.1.1.14软件进行多重序列比对与修剪，再通过MrBayes v.3.2.6进行贝叶斯推断法（Bayesian inference，BI）构建系统发育树。

1.3 病原菌的生物学特性

1.3.1 不同培养基对供试菌株菌丝生长的影响

配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基（potato sucrose agar，PSA，马铃薯200 g，琼脂17 g，蔗糖20 g，蒸馏水1000 mL）、查氏培养基（Czapek agar，Czapek；硝酸钠2 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾1 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL）、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（potato carrot agar，PCA；马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL）、水琼脂培养基（water agar，WA；琼脂17 g，蒸馏水1000 mL）、玉米粉琼脂培养基（corn meal agar，CMA；玉米粉30 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL）、胡萝卜水琼脂培养基（carrot agar，CA；胡萝卜200 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL）和燕麦片琼脂培养基（oatmeal agar，OA；燕麦片30 g，琼脂17 g，蒸馏水1000 mL），并测试不同培养基对供试菌株的影响^［34］。置于25 ℃恒温培养箱（RXZ-280C，宁波杨辉仪器有限公司） 中培养，7 d后采用十字交叉法^［22］测量菌落直径，并重复3次。

1.3.2 不同碳源和氮源对供试菌株菌丝生长的影响

碳源：Czapek培养基作为基础培养基，分别用葡萄糖、D-果糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、菊糖、甘露醇和山梨醇为碳源等量置换Czapek培养基中碳元素，配制成不同含碳培养基，同时设置不含任何碳源的对照组^［35］。

氮源：用硫酸铵、牛肉膏、酵母浸粉、氯化铵、蛋白胨、硝酸钾、甘氨酸和尿素为氮源等质量置换Czapek培养基中氮元素，配制成不同含氮培养基，以不加氮源的培养基为对照^［36］。以上处理均置于25 ℃培养，7 d后采用十字交叉法^［22］测量菌落直径，重复3次。

1.3.3 不同温度和光照对供试菌株菌丝生长的影响

温度处理：配制PDA培养基，分别在5、10、15、20、25、30和35 ℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。7 d后采用十字交叉法^［22］测量菌落直径，以上处理重复3次。

光照处理：在PDA培养基上设置3种光照模式（全光照、12 h光照与12 h黑暗交替以及全黑暗）。所有光照处理均在25 ℃条件下进行。7 d后采用十字交叉法^［22］测量菌落直径，重复3次。

1.3.4 不同pH对供试菌株菌丝生长的影响

配制pH分别为4、5、6、7、8、9、10和11的PDA培养基，并在25 ℃环境下进行黑暗培养^［37］。7 d后采用十字交叉法^［22］测量菌落直径，重复3次。

1.3.5 菌丝致死温度

采用水浴加热法^［38］测定致死温度，将菌饼放置于含有无菌水的离心管中，分别在45~65 ℃条件下依次处理10 min，冷却后接种培养5 d，每个温度点重复3次以初步确定致死温度范围，进而在此范围内进行精度为1 ℃的梯度试验，以确定准确的致死温度。

1.4 数据处理

使用Excel 2019进行数据整理，SPSS 23.0软件分析数据，Duncan法进行多重比较；采用PS和figtree作图。

2 结果与分析

2.1 绿草莓叶斑病田间发病率及病情指数

本研究对吐格勒勤布拉克草原、巴勒克苏星空草原及开斯克草场3个草原样地的绿草莓叶斑病进行调查，结果显示（表3），3地的发病率和病情指数从5-8月均呈持续上升态势。其中，吐格勒勤布拉克草原的发病率在46.88%~59.69%波动，病情指数为17.87~26.63；巴勒克苏星空草原发病率为44.06%~54.89%，病情指数为14.93~23.09；开斯克草场发病率为43.07%~50.70%，病情指数为13.85~21.90。从时间进程看，6-7月3地发病率快速上升，分别达到56.86%、52.92%和49.61%；进入7-8月，虽为病害高发期，但发病率的上升速度明显放缓。

2.2 绿草莓叶斑病的症状

2024年在新疆昭苏县草原中发现绿草莓的叶部病害，该病的典型病症演变过程表现为：病害初始阶段，叶表组织呈现暗紫色至紫红色微小斑块；随着病情进展，病斑呈现扩展趋势，最终形成近圆形病变区域，病斑由外缘紫红色过渡至中央灰白色。重度感染植株可观察到叶片黄化卷曲直至枯死等组织坏死现象。当环境湿度较大时，病斑表面会出现散生的小黑点，为病菌的分生孢子器（图1）。

2.3 形态学鉴定

于昭苏县3个调查地点共采集绿草莓叶斑病样品52份，田间观察显示所有样品病害症状一致。分离培养时，每份样品设3皿培养基重复处理，经分离纯化获得127株菌株。根据菌落形态，菌株初步分为3种类型，其中Ⅰ类菌株44株、Ⅱ类菌株51株、Ⅲ类菌株32株；多数叶片组织可同时分离出上述3种病原菌，存在复合侵染现象，所有菌株均保留并纳入统计。Ⅱ类菌株分离频率最高（40.15%），为优势菌株。从各类型中分别选取1株代表菌株，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类菌株编号依次为XJZSYCM-1、XJZSYCM-2、XJZSYCM-3，其形态特征描述如下。

菌株XJZSYCM-1：该病原菌的菌落形态规则，呈圆形。培养初期菌落呈白色，随培养时间延长逐渐转为棕色，最终变为黑褐色。菌丝呈辐射状向外延伸，气生菌丝稀少。分生孢子盘上着生刚毛，形态为圆形至倒卵形，结构致密，由透明角质物质构成。分生孢子为圆柱形，无色透明，两端呈钝圆形，内含油球，大小为（12.26~23.70） µm×（2.98~4.05） µm；附着孢厚壁，棕褐色，多数球状，部分棍棒状，光滑，单细胞，大小为（6.09~8.20） µm×（4.68~7.37） µm。根据形态学鉴定初步确定为炭疽菌属（Colletotrichum sp.，图2）。

XJZSYCM-2：该菌落形态规则，呈圆形，扁平铺展。培养初期为乳白色，随成熟度增加最终转为铁灰色。菌落边缘光滑整齐，气生菌丝发达。其分生孢子梗呈瓶状，颈部明显突出，表面光滑无色。产出的分生孢子为圆柱形，透明无隔，胞壁薄而光滑，两端钝圆，大小为（4.5~7.9） µm×（1.5~2.6） µm。根据形态学鉴定初步确定为壳二孢属（Ascochyta sp.，图3）。

XJZSYCM-3：在PDA培养基上28 ℃培养7 d，菌落呈现较规则的圆形，初期菌丝密集呈灰绿色，随着培养时间增加，菌落呈圆形，有轮纹，菌丝边缘灰白色。分生孢子为深褐色或橄榄褐色呈砖格状，具横纵隔膜，顶端具喙，大小为（14.80~28.82） μm×（7.18~13.10） μm^［39］，根据形态学鉴定初步确定为链格孢属（Alternaria sp.，图4）。

2.4 分子生物学鉴定

采用ITS、TUB2、GAPDH、CHS-1和ACT基因特异性引物对菌株XJZSYCM-1进行PCR扩增（表4），序列提交NCBI，GenBank登录号依次为PV920205、PX021413、PX056313、PV972777、PX115489。系统发育结果分析［以甘薯（Dioscorea esculenta）和黑痣病菌（Monilochaetes infuscans）CBS 869.96为外群］表明，XJZSYCM-1与C.tibetense LC 7364形成100%支持率（图5）。综合形态学特征与分子系统学分析，该病原菌鉴定为C. tibetense。

采用ITS、LSU、TUB2基因特异性引物对菌株XJZSYCM-2进行PCR扩增（表5），序列提交NCBI，GenBank登录号依次为PV915427、PV937034、PV927295。系统发育分析（外群为P. minima CBS 524.50）表明，菌株XJZSYCM-2与A. nigripycnidia XJAU HC77构成100%支持率的单系群（图6）。基于形态学特征与分子系统学鉴定结果，该病原菌确定为A. nigripycnidia。

采用ITS、GADPH、ALT、TEF基因特异性引物对菌株XJZSYCM-3进行PCR扩增（表6），序列提交NCBI，GenBank登录号依次为PV919569、PX021415、PX021414、PX021416。系统发育分析 ［以囊状匍柄霉（S. vesicarium）CBS 191.86为外群］显示，菌株XJZSYCM-3与交链格孢（A. alternata）CBS 612.72形成99%支持率的单系群（图7）。结合形态学特征与分子系统学鉴定结果，该病原菌确定为交链格孢（A. alternata）。

2.5 致病性测定

通过致病性测试分析（图8）发现，在为期7 d的观察中，试验菌株XJZSYCM-1（C. tibetense）、XJZSYCM-2（A. nigripycnidia）和XJZSYCM-3（A. alternata）在离体绿草莓叶片接种后第2天，接种部位周边均观察到菌丝扩展并伴随叶片褪绿现象，对照组未出现任何变化；接种后第4天，XJZSYCM-3（A. alternata）与XJZSYCM-1（C. tibetense）处理组形成黑色坏死斑，而XJZSYCM-2（A. nigripycnidia）处理组则呈现大面积褪绿；持续观察至第7天，XJZSYCM-2（A. nigripycnidia）接种叶片出现菌丝大面积生长并伴随坏死斑，最终导致全叶坏死腐烂，对照组在整个7 d内均无症状。通过对病健交界区域组织进行分离培养，成功获得与初始接种一致的菌株，符合柯赫氏法则验证标准，证实上述3株菌株均为绿草莓叶斑病的致病菌。

经不同病原菌接种处理后，叶片病害症状呈现差异。其中，接种C. tibetense的叶片，病斑呈深褐色至灰褐色，多为圆形或近圆形，边缘相对清晰；接种交链格孢（A. alternata）的叶片，病斑颜色偏深紫黑色，形状不规则；接种A. nigripycnidia的叶片，病斑呈黄褐色至棕褐色，病斑与健康组织的界限相对模糊，且叶片整体表现出黄化迹象，病斑多为不规则斑块状。

2.6 病原菌生物学特性

生物学特性结果表明，交链格孢（A. alternata）在CMA、PSA、CA、PDA培养基上均生长良好，菌落直径较大，最适生长培养基为CMA，在5~35 ℃菌丝生长速度差异显著（P<0.05），最适菌丝生长温度为25 ℃；在5 ℃时菌丝生长最慢。最适碳、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨；pH在4~11均能生长，最适pH为7（表7）。

A. nigripycnidia在供试培养基中生长均较为缓慢，最适生长培养基为PCA，25 ℃下菌落直径显著大于其他温度（P<0.05）；菌丝生长碳源和氮源利用效果最好的是可溶性淀粉和硫酸铵；pH为7~8时菌落直径显著大于其他pH（P<0.05）。

C. tibetense在PDA培养基上菌丝生长最快，其次为CA培养基，在OA和WA培养基上生长缓慢。最适生长温度为25 ℃；菌丝生长碳、氮源利用效果最好的是可溶性淀粉和蛋白胨，其利用效率均显著高于其他供试碳、氮源（P<0.05）；pH为6~8时菌落直径显著大于其他pH（P<0.05）。最适pH为7。

不同菌株的菌丝热致死温度存在差异（表8）。交链格孢（A. alternata）和A. nigripycnidia对热敏感，55 ℃水浴10 min即可致死；而C. tibetense表现出更高的热耐受性，在64 ℃下处理10 min其菌丝失活。

3 讨论

叶斑病是危害牧草生产的一种常见重要病害，目前已报道的引起牧草叶斑病的主要病原物为链格孢属、核腔菌属（Pyrenophora sp.）、平脐蠕孢属（Bipolaris sp.）、弯孢属（Curvularia sp.）和近壳多孢属（Parastagonospora sp.）等^［40］。本研究对新疆昭苏县绿草莓叶斑病开展病原研究，综合形态学与分子生物学鉴定结果，明确其病原菌为C. tibetense、A. nigripycnidia、交链格孢（A. alternata）。

炭疽菌属作为一类重要的植物病原真菌，其代表种C. tibetense在病害发生中具有显著的影响。根据文献报道^［41］，当前已鉴定的炭疽病病原菌共有23种，包含5个复合种［分别为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢炭疽菌、博宁炭疽菌、黑线炭疽菌（Colletotrichum dematium）和平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum）］和两个单体类［包括黑炭疽菌（Colletotrichum nigrum）和球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）］，本研究从绿草莓上分离获得的炭疽菌属菌株，是该病原在绿草莓这一特定寄主上的首次明确报道。A. nigripycnidia隶属于子囊菌门（Ascomycota）座囊菌纲（Dothideomycetes）格孢腔菌目（Pleosporales）亚隔孢壳科（Didymellaceae）真菌，该菌的学名由Boerema等^［42］于1997年首次描述并将其归入壳二孢属（Ascochyta）。既往研究显示，该菌具有较为广泛的寄主谱。侯刘娟^［43］在伊犁河谷野果林林木病害的调查中发现，该真菌为引起蔷薇科绣线菊属金丝桃叶绣线菊（Spiraea hypericifolia）叶斑病的病原，此外，Ghiat等^［44］研究证实，A. nigripycnidia可侵染亚麻（Linum usitatissimum）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、苜蓿（Medicago sativa）等多种豆科植物。本研究首次在绿草莓上发现A. nigripycnidia的侵染，这一研究再次证实了该病原菌可以对同科不同属植物进行侵染。交链格孢（A. alternata）是许多植物病害的致病菌，包括核桃枝枯病^［45］、芍药黑斑病^［46］等。此外，它还对甜菜（Beta vulgaris）、烟草（Nicotiana tabacum）、黄瓜（Cucumis sativus）等经济作物造成严重损害^［47］，虽然链格孢属作为多种作物的致病菌，但其侵染绿草莓的相关研究尚未见报道。

致病性结果显示，交链格孢（A. alternata）和C. tibetense在接种绿草莓叶片后第4天即可诱发典型叶斑病症状，表现为黑色坏死病斑并伴随病斑面积持续扩展。然而，分离率最高的A. nigripycnidia则表现出滞后致病性，其引发的病症直至接种后第7天才明显显现。基于上述结果推测，绿草莓叶斑病存在典型的复合侵染特征，病害的早期发生可能主要由交链格孢（A. alternata）和C. tibetense单独或共同侵染，两类病原菌的早期侵染为后续病害发展奠定基础；而在病害中后期，A. nigripycnidia作为主要病原菌，与前述病原菌形成复合侵染体系，通过时序上的协同作用加剧病害严重度。该复合侵染的动态机制有待进一步研究验证。

生物学特性分析显示，交链格孢（A. alternata）的最适菌丝生长培养基为CMA，最适菌丝生长温度为25 ℃，pH适应范围为4~11，pH为7时菌丝生长最快，该特性与邓小芸等^［45］报道的核桃枝枯病病原菌交链格孢的生物学特性略有不同；最适病原菌菌丝生长的碳源和氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨，与谷清义等^［46］对芍药黑斑病病原菌交链格孢的研究结果有差异，上述现象可能为病原菌的寄主特异性及地理气候条件共同作用，仍需后续研究深入揭示。而C. tibetense、A. nigripycnidia的生物学特性报道较为缺乏，有待深入研究。

4 结论

本研究明确了引起昭苏县绿草莓叶斑病的病原菌有交链格孢（A. alternata）、C. tibetense和A. nigripycnidia，均为在绿草莓上的首次发现。基于对3种病原菌生物学特性的测定，本研究揭示了不同培养环境对其菌丝体生长状况的具体影响，明确病害与病原菌的生物学特性可以初步了解病害的发病阈值条件（温湿度、光照） 、侵染循环关键环节（孢子萌发期、侵入期） 等特性，能精准锁定防控最佳时机。相关结果可为深入解析该病害的发生与流行规律、建立预测预报方法及制定综合防控策略提供理论支撑。

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基金资助

国家重点研发计划(2022YFD1401101)