气肿疽梭菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

为了建立一种快速而准确的气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)诊断方法,该实验根据GenBank上发表的气肿疽梭菌CctA基因,设计实时荧光定量PCR (qPCR)的特异性引物与探针,优化方法的各反应条件,并采用该方法定量分析了攻毒2～7 d后小鼠各组织的病原体载量。结果表明:优化后最佳退火温度为60℃,引物和探针浓度分别为0.5μmol/L和0.35μmol/L。标准曲线的相关系数为0.998,斜率为-3.2,扩增效率为105%。特异性实验显示,该方法仅对气肿疽梭菌产生荧光信号,对大肠杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、肉毒梭菌、腐败梭菌均无交叉反应。灵敏度检测显示,该方法可检测0.6拷贝/μL病原,重复性实验结果表明,组内变异系数(coefficientof variation,CV)为0.60%～1.23%,组间CV为0.94%～1.51%,均<10%。攻毒后,细菌载量在5～6 d达到峰值,其中血液中细菌载量最高为7.64×10～7拷贝/μL,肺部细菌载量最低为7.31×10～2拷贝/μL。综上,该研究建立的检测方法敏感、特异,并能初步检测气肿疽梭菌在小白鼠各组织中的变化规律,为气肿疽诊断和防治提供实验数据。

关键词

气肿疽梭菌 / CctA基因 / 实时荧光定量PCR