脱卤杆菌介导的厌氧微生物富集菌群对1,2,4-三氯苯的降解特性

Degradation of 1,2,4-trichlorobenzene by an anaerobic enrichment culture mediated by Dehalobacter species

摘要

1,2,4-三氯苯是我国工业污染场地土壤和地下水中典型的有机污染物,具有持久性、生物蓄积性和高毒性特点,对生态环境和人体健康危害巨大。1,2,4-三氯苯密度比水大,容易迁移至深部厌氧区域,因此,开展1,2,4-三氯苯厌氧微生物降解与修复研究具有重要实际应用价值。本文通过长期富集培养,获得一份可以稳定地将1,2,4-三氯苯还原脱氯至1,4-二氯苯,再进一步还原脱氯至氯苯的厌氧菌液。通过16S rRNA基因扩增子测序及引物特异性的定量PCR实验,证明厚壁菌门的脱卤杆菌属细菌(Dehalobacter species)是1,2,4-三氯苯和1,4-二氯苯厌氧还原脱卤的功能菌株,其生长率为(1.68±0.8)×10⁶ copies·μmol^-1(释放的氯离子)。通过PCR扩增,获得Dehalobacter菌株的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树。本研究可为1,2,4-三氯苯污染场地开展原位厌氧微生物修复提供菌株资源和理论指导。

关键词

1,2,4-三氯苯 / 地下水污染 / 生物修复 / 脱卤杆菌属 / 还原脱卤

Key words

1,2,4-trichlorobenzene / groundwater contamination / bioremediation / Dehalobacter / reductive dechlorination

0 引言

卤代有机物是我国有机污染场地中最主要的污染物^[1],其中,1,2,4-三氯苯作为一种化工原料、有机溶剂和反应中间体而被广泛使用^[2],引起了严重的环境污染问题^[3]。1,2,4-三氯苯具有持久性、潜在致癌性和生物蓄积性等特点^[4-5],已被美国环保署(USEPA)列入优先控制污染物名单^[6],也被列入我国2017年《地下水质量标准》的非常规指标中。常规有机污染物修复技术有固化稳定化、热脱附和原位化学氧化等技术,这些技术都存在能耗高、成本高和破坏土壤结构/肥力等问题。原位微生物修复具有成本低、对场地扰动小和绿色环保等优点,近年来逐渐受到重视^[7-8]。探明微生物群落结构对有机污染物迁移转化的影响是开展高效微生物修复有机污染的前提^[9];1,2,4-三氯苯密度比水大,容易形成重非水相液体(DNAPLs)向深部厌氧区域入渗,因此开展1,2,4-三氯苯厌氧微生物降解研究具有重要实际价值。

有机卤呼吸菌(Organohalide-Respring Bacteria,OHRB)是一类以卤代有机物为最终电子受体,在脱卤酶催化作用下进行脱卤呼吸产能的微生物^[10-11]。专性有机卤呼吸菌是以有机卤化合物为唯一电子受体进行脱卤呼吸产能的严格厌氧菌,包括绿弯菌门的脱卤拟球菌属(Dehalococcoides)、脱卤单胞菌属(Dehalogenimonas)和厚壁菌门的脱卤杆菌属(Dehalobacter)^{[12⇓⇓⇓-16]}。专性有机卤呼吸菌能编码更多的还原脱卤酶,因此,它们在卤代有机污染场地修复中更具优势^[17]。

多氯代苯类污染物的厌氧微生物还原脱卤研究较多,如:Dehalococcoides mccartyi 195还原脱氯六氯苯、五氯苯、四氯苯(1,2,3,5-四氯苯除外)至1,3,5-三氯苯^[18-19];Dehalococcoides mccartyi CBDB1还原脱氯六氯苯、五氯苯、四氯苯、三氯苯至1,3-和1,4-二氯苯^[20⇓-22];Dehalococcoides mccartyi DCMB5还原脱氯六氯苯至1,2,4-、1,3,5-三氯苯和1,4-二氯苯^[23];Dehalobium chlorocoercia DF-1还原脱氯六氯苯、五氯苯、1,2,3,5-四氯苯至1,3,5-三氯苯^[24]。然而,低取代氯的氯苯类物质还原脱卤研究较少。

前期,本课题组利用南京六合某工业污染场地的土壤和地下水开展了氯苯类物质厌氧微生物降解的微宇宙实验。结果表明1,2,4-三氯苯被Dehalogenimonas还原脱氯至1,2-、1,3-和1,4-二氯苯^[25-26]。但随着长达4年的连续传代富集培养,继续投喂1,2,4-三氯苯时,菌液里没有1,2-和1,3-二氯苯产生。因此,本研究将以该富集菌液为研究对象,通过分析降解过程中的代谢产物,确定1,2,4-三氯苯新的降解途径,通过16S rRNA基因扩增子测序及定量PCR实验,分析微生物群落结构演替及驱动1,2,4-三氯苯还原脱氯的功能菌,并获得关键功能菌的16S rRNA基因,确定其系统发育地位,为氯苯类污染场地的生物修复提供技术支撑、理论指导和菌株资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌液

建立微生物实验所用的土壤和地下水样品来源于南京六合某工业污染场地,土壤样品采自地面以下1.5~2 m深处,地下水样品采自4 m深地下水监测井。样品采集后,立刻密封,以隔绝空气。在实验室一次性厌氧(充满99.999% N₂)塑料手套袋(Aldrich,AtmosBag)中,将土样和地下水添加至250 mL厌氧玻璃瓶中,再用丁基胶塞密封,每实验瓶含有约15 mL(量勺称取)土壤和165 mL地下水。最后再将实验瓶转移至厌氧(体积比V(CO₂)∶V(H₂)∶V(N₂)为10∶10∶80)手套箱(COY-7150220,美国)中,定期投喂1,2,4-三氯苯和乳酸钠,在厌氧、避光、静置条件下进行富集培养。

1.1.2 试剂与仪器

1,2,4-三氯苯,1,2-、1,3-、1,4-二氯苯,氯苯,苯和乳酸钠(纯度≥99%)均购买自Sigma-Aldrich。氯苯类及苯由顶空-气相色谱进行定量检测,顶空型号为HS-10(岛津,日本),气相色谱仪型号为GC 2010 plus(岛津,日本),气相色谱仪配有J&W HP-PLOT QPT色谱柱,尺寸为30 m×0.53 mm×40 μm。PCR反应使用的PCR仪为ABI GeneAmp©9700型(ABI,美国);定量PCR仪为QuantStudio 6 Flex(Applied Biosystems, 美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 厌氧富集菌液的培养

向由土壤和地下水构建的微宇宙系统中,定期投喂15.4 μmol 1,2,4-三氯苯(约95 μmol/L)作为唯一电子受体,40 μmol乳酸钠(约250 μmol/L)作为唯一电子供体,在厌氧手套箱内进行富集培养。不定期以体积比10%的比例稀释传代至厌氧无机盐培养基中,培养基配方参考Löffler等的研究^[27],直至获得不含有土壤(sediment-free)的富集菌液。以该富集液为母液再进行稀释传代开展本研究,实验设置灭菌处理组和实验组,其中灭菌组用高温高压(121 ℃,20 min)灭菌处理。实验组中1,2,4-三氯苯和乳酸钠的前两次投喂量与前期一致,从第三次开始,投喂量均加倍。定期取样进行顶空-气相色谱污染物检测以分析其变化过程,并取样提取DNA进行微生物检测。

1.2.2 顶空-气相色谱法检测有机污染物

取1 mL菌液加入顶空瓶中,瓶内含有5 mL pH为2的酸水(用硫酸或盐酸调整),立刻用压盖器密封,进行顶空-气相色谱法分析。各项参数设置如下:恒温炉温度80 ℃,样品流路温度90 ℃,传输线温度105 ℃,样品瓶加压气压160 kPa,样品瓶搅拌时间5 min,恒温时间25 min,加压时间1 min,加压平衡时间6 s,导入时间30 s,导入平衡时间6 s,进样时间1 min,GC循环时间27 min;气化室温度200 ℃,色谱柱流量为1 mL/min,以氮气为载气,分流比为20∶1;色谱柱初始温度为40 ℃,保持1.5 min,以10 ℃/min的速率上升至180 ℃保持1 min,再以20 ℃/min的速率上升至200 ℃保持1 min;检测器温度为250 ℃,氢气流量为40 mL/min,尾吹流量为25 mL/min,空气流量为400 mL/min。

1.2.3 DNA提取、16S rRNA基因扩增子测序及分析

从实验组每个平行样中分次取出4 mL(培养第0和第30天)或6 mL(培养第90天)菌液于无菌、厌氧离心管中,以10 000 g的离心力离心15 min后弃掉上清液,使用QIAGEN的DNeasy PowerSoil Pro试剂盒,按照试剂盒说明书步骤操作提取DNA。将获得的第30和第90天的DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因扩增子测序。本实验对16S rRNA基因V4-V5可变区进行扩增,使用的上游引物是515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’),下游引物是909R(5’- CCCCGYCAATTCMTTTRAGT -3’)。测序数据在美吉生物生信云平台(https://cloud.majorbio.com/)上基于QIIME 2流程进行分析;序列降噪方法为DADA2,物种注释数据库为Silva 138/16S,物种注释方法为Bayes,分类置信度为0.7。

1.2.4 定量PCR及脱卤菌生长率计算

利用定量PCR(qPCR)来追踪1,2,4-三氯苯厌氧还原脱卤过程总细菌和Dehalobacter的生长情况。其中总细菌的正反引物分别是1055F(5’-ATGGYTGTCGTCAGCT-3’)和1392R(5’- ACGGGCGGTGTGTAC-3’)^[28];Dehalobacter的 正反引物分别是881F(5’- CGACGCAACGCGAAGAA-3’)和1002R(5’-CGAAGGGCACTCCCATATCTC-3’)^[29]。反应体系总体积为20 μL,包括10 μL SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad Laboratories)、10 μmol/L正反链引物各0.5 μL、2 μL DNA样品或者空白以及7 μL RNase free H₂O。qPCR温控程序为95 ℃保持2 min,然后(1)95 ℃保持5 s,(2)60 ℃保持34 s,其中(1)和(2)重复40次。利用外标法定量,标曲由含有Dehalobacter 16S rRNA基因扩增子片段的质粒构建,标曲浓度范围为10¹~10⁸ copies/μL。Dehalobacter生长率(μ)以拷贝数每微摩尔释放的氯离子(copies/μmol Cl^- released)来计算,计算公式如下:

μ= \frac{\mathrm{C}\mathrm{o}\mathrm{n}.{\left(\mathrm{D}\mathrm{h}\mathrm{b}\right)}_{T_2}\times V_{T_2}-\mathrm{C}\mathrm{o}\mathrm{n}.{\left(\mathrm{D}\mathrm{h}\mathrm{b}\right)}_{T_1}\times V_{T_1}}{\left[n\right(\mathrm{M}\mathrm{C}\mathrm{B})\times 2+n{\left(\mathrm{D}\mathrm{C}\mathrm{B}\right)]}_{T_2}-[n\left(\mathrm{M}\mathrm{C}\mathrm{B}\right)\times 2+n{\left(\mathrm{D}\mathrm{C}\mathrm{B}\right)]}_{T_1}}

式中:Con.(Dhb)表示Dehalobacter浓度,由qPCR实验获得;V表示体积;n(MCB)和n(DCB)表示氯苯和二氯苯的物质的量,由顶空-气象色谱检测获得,每产生1 mol氯苯可释放2 mol氯离子,每产生1 mol二氯苯可释放1 mol氯离子;T₁和T₂表示时间。

1.2.5 脱卤菌PCR及系统发育树绘制

PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,正向引物254f(5’- ACGGCT GCTAATACCGGATG-3’)和反向引物1594r(5’- CATCTACCCCACCTTCGACG-3’)用于扩增脱卤菌Dehalobacter的16S rRNA基因^[30]。使用500 μL RNase free水,配制浓度为10 μmol/L的引物待用。PCR实验总体积为50 μL,包括25 μL PCR Master Mix(Thermo Scientific,MA)、正反引物各2 μL、19 μL RNase free水和2 μL DNA样品(或空白)。PCR实验温控过程如下:首先95 ℃保持5 min,然后(1)94 ℃保持30 s,(2)57 ℃保持45 s,(3)72 ℃保持22 s,(1)~(3)重复30次,接着72 ℃保持10 min,10 ℃保持5 min。扩增产物在1×的电泳缓冲液(TAE缓冲液)中进行电泳实验,以检测扩增片段的长度。电泳条件为电压120 V,20 min。电泳条带长度正确、明亮且只有一条,送往通用生物技术有限公司(南京)进行测序。

将返回的序列导入Geneious(v8.1.9)构建系统发育树,首先将已知的氯苯类还原脱氯菌Dehalococcoides、Dehalobacter和Dehalogenimonas的16S rRNA基因作比对,并修剪片段使所有参与系统发育树构建的序列具有相同长度序列,再利用Geneious中近邻结合法(neighbor-joining method)和Jukes-Cantor(JC-69)遗传距离模型,进行系统发育树的构建,并且利用自举法(bootstrap)进行1 000次有效重复采样以评价系统发育树及进化树分支的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 1,2,4-三氯苯厌氧微生物还原脱卤过程

从南京六合某化工污染场地采集土壤和地下水样品,在室内开展1,2,4-三氯苯的厌氧微生物降解研究。在阴性组中,1,2,4-三氯苯浓度在培养期内基本保持不变,说明了1,2,4-三氯苯的持久性和实验结果的可靠性。在实验组的3个平行样中,富集菌液中微生物分布可能存在非均质性,导致平行样间1,2,4-三氯苯的降解转化趋势相同,而脱氯反应速率存在差异。因此,在描述脱氯反应过程时,均以单个实验瓶来叙述而并未将所有平行样进行平均(图1),这种现象在前人研究中也出现过^[31]。第一次投喂的1,2,4-三氯苯,脱氯速度为(1.1±0.1)μmol/d;第二次投喂的1,2,4-三氯苯,脱氯速度增加到了(3.2±0.4)μmol/d,逐渐增大的脱氯速度说明脱氯过程伴随着脱卤呼吸菌的生长及其丰度的增加。此外,在前期的微宇宙实验中,1,2,4-三氯苯被还原脱卤生成物质的量比为2%∶10%∶88%的1,2-、1,3-和1,4-二氯苯^[25-26];而随着多次传代接种,本实验中几乎没有1,2-和1,3-二氯苯产生,说明随着富集培养,微生物群落结构发生了变化,预示着富集液中关键脱卤呼吸菌的变化。多次传代后的微生物群落降解1,2,4-三氯苯的产物更单一,减少了有毒产物1,2-和1,3-二氯苯的累积,这对1,2,4-三氯苯污染场地开展微生物修复更有利。终产物氯苯相比于1,2,4-三氯苯,取代氯更少,更容易被好氧微生物进一步矿化。目前,国内外都分离纯化了较多氯苯好氧矿化菌株^[32-33]。

2.2 微生物群落结构演替

在1,2,4-三氯苯还原脱氯过程中,采集不同时间点的DNA样品进行16S rRNA基因扩增子测序,以揭示该过程中微生物群落结构的演替,结果如图2所示。从结果可以看出,该富集液中优势物种有Dehalobacter、Sedimentibacter和Methanobacterium。Dehalobacter是专性脱卤呼吸菌,只能利用卤代有机物进行脱卤呼吸获得能量进行细胞生长,它的丰度从第30天时的7%~25%逐渐增加到第90天时的15%~38%,说明Dehalobacter很可能参与了1,2,4-三氯苯和1,4-二氯苯的还原脱卤过程。Sedimentibacter可以发酵乳酸钠产生乙酸和氢气,为脱卤呼吸菌提供其生长所必须的碳源和电子供体^[10,34],还可以合成脱卤酶催化脱卤反应所必须的辅因子维生素 {{\mathrm{B}}_{12}}^{\mathrm{}}^[14,35],它的丰度从第30天时的(55.4±5.5)%降低到第90天时的(21±4.2)%。因为本系统中添加了氯代污染物为选择压力进行富集培养,因此,其他不能直接利用氯代有机物进行代谢的微生物丰度会逐渐下降。Methanobacterium为严格厌氧的产甲烷古菌,广古菌门编码了氧气清除系统,因此,产甲烷菌的存在为脱卤呼吸菌的生长提供了有利的生态位^[36],它的丰度在培养期内没有明显变化(第30天时为(7.1±1.5)%,第90天时为(6.6±3.7)%)。此外,Selenomonadales目的微生物丰度从第30天时的(11.9±9)%增加到第90天时的(21.3±5.2)%,但因为还未被注释到属,它在群落中的生物学功能还有待进一步研究。

正如前文所述,在微宇宙培养期间,1,2,4-三氯苯的厌氧微生物还原脱卤产物是1,2-、1,3-和1,4-二氯苯,前期实验证明该反应是在绿弯菌门的脱卤单胞菌属(Dehalogenimonas)催化作用下完成的^[25-26]。但随着继续传代富集直至获得Sediment-free富集液后,微生物群落结构发生演替,Dehalogenimonas逐步被Dehalobacter取代,而1,2,4-三氯苯也只被还原生成1,4-二氯苯,最终生成氯苯。这说明在1,2,4-三氯苯污染环境下,脱卤菌Dehalobacter相比于Dehalogenimonas在群落中更具有竞争优势。前人研究表明,对于脱卤菌来说,二氯苯的3种同分异构体是微生物间不可交换的代谢基质^[37],因此,本研究中以Dehalobacter为主导菌液产生单一的脱氯底物更有利于1,2,4-三氯苯污染场地微生物修复技术的应用。

2.3 脱卤菌生长过程及生长率

由上文可知,在1,2,4-三氯苯厌氧脱卤过程中,专性脱卤呼吸菌Dehalobacter的丰度逐渐增加,为了进一步证明Dehalobacter可以利用1,2,4-三氯苯进行脱卤呼吸获取生长必须的能量,开展了qPCR实验。结果(图3)显示,Dehalobacter的细胞数量从初始时刻的10⁴ copies/mL逐渐增加到第90天时的10⁶ copies/mL,占细菌的丰度也从初始时刻的约10%逐步增加到第90天时的约22%,该结果证明Dehalobacter是1,2,4-三氯苯还原脱卤至1,4-二氯苯以及1,4-二氯苯进一步还原至氯苯的功能菌。结合1,2,4-三氯苯还原脱卤过程中的监测数据,计算出Dehalobacter的生长率(表1)从第0~30天的(1.66±1.08)×10⁵ copies·μmol^-1(释放的氯离子)增加到第31~90天的(1.68±0.8)×10⁶ copies·μmol^-1(释放的氯离子),该生长率与前人报道的专性脱卤呼吸菌生长率相当^[30]。

2.4 脱卤呼吸菌Dehalobacter系统进化树

提取富集液DNA,利用Dehalobacter特异性引物进行PCR扩增,获得长度约为1 300 bp的16S rRNA基因序列。PCR产物的电泳结果如图4所示:阴性对照组没有条带,表明所使用的试剂均没有受到污染;阳性组扩增片段长度为1 000~1 500 bp,与预期相符。第90天的DNA中所含有的Dehalobacter量最高,因此条带最亮,将其送往通用生物科技有限公司进行测序。

基于专性脱卤呼吸菌属Dehalobacter、Dehalococcoides和Dehalogenimonas 的16S rRNA基因序列构建系统发生树,如图5所示。用bootstrap重抽样技术对该树进行1 000次可信度检验,结果显示bootstrap值均大于70,说明构建的系统发育树可靠^[38],此树也证明了本文确定的16S rRNA基因序列是Dehalobacter属。

3 结论

本文利用南京市六合区某化工污染场地的土壤和地下水,开展了室内厌氧微生物实验,研究厌氧条件下氯苯类物质的微生物转化过程并确定了脱氯反应的功能菌。主要结论如下。

(1)1,2,4-三氯苯在厌氧条件下被微生物还原脱氯生成1,4-二氯苯,1,4-二氯苯再进一步被还原生成氯苯;脱氯反应速率由(1.1±0.1)μmol/d逐渐增加到(3.2±0.4)μmol/d。

(2)16S rRNA基因扩增子测序结果刻画了微生物群落结构组成及其演替,qPCR实验证明了1,2,4-三氯苯和1,4-二氯苯的厌氧微生物还原脱氯功能菌是厚壁菌门的脱卤杆菌属Dehalobacter,其生长率为(1.68±0.8)×10⁶ copies·μmol^-1(释放的氯离子)。

氯苯类物质是工业污染场地土壤和地下水中的典型污染物,多分布在深部厌氧含水层,因此本研究开展的氯苯类物质厌氧微生物降解研究具有重要实际应用价值,可为实际工业污染场地的微生物修复提供菌株资源和理论指导。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2018YFC1802501)

国家自然科学基金项目(42007214)

国家自然科学基金项目(42077174)

中国博士后科学基金项目(2021M691614)

江苏省“双创博士”(JSSCBS20210278)

江苏省“333高层次人才培养工程”科研项目(680803125)

江苏省卓越博士后计划项目(2023ZB141)

江苏省地下水环境状况调查项目