土壤中铬的毒性阈值(EC_x)及其预测模型

Toxicity thresholds (EC_x) for Cr in soils and prediction models

摘要

毒物学资料的缺乏成为制约我国污染土壤中Cr生态风险评价及土壤环境质量标准修订的主要瓶颈。本研究选取了我国7种不同性质土壤,分别以蚯蚓生物量、小白菜生物量和微生物基质诱导呼吸(SIR)为毒性测试终点,基于Log-logistic剂量-效应关系及低剂量刺激效应函数模型对不同土壤中铬的毒性阈值(EC_x)进行了测定,在此基础上,对不同性质土壤中Cr的毒性阈值进行了预测。研究结果表明:不同性质土壤中Cr对蚯蚓、小白菜、土壤微生物毒性均随着土壤Cr含量的增加而表现出明显抑制效应,剂量-效应关系呈现明显的S型曲线;不同性质土壤中,基于微生物(SIR)、蚯蚓、小白菜毒性测试的EC₁₀分别为22.1~53.7、65.0~137.2和82.1~220.2 mg/kg,EC₅₀分别为50.3~103.7、103.9~369.0和159.9~441.9 mg/kg;不同物种Cr毒性阈值由大到小顺序为小白菜>蚯蚓>土壤微生物,土壤微生物对Cr毒性最为敏感;在土壤Cr低含量(<112 mg/kg)条件下,3种测试物种对Cr毒性表现出明显的低剂量刺激效应,其中,蚯蚓在不同性质土壤中最大刺激效应为102%~108%,小白菜为105%~112%,相对来说,土壤中Cr对微生物的低剂量刺激效应较小,最大刺激效应为104%;pH、黏土含量和土壤阳离子交换量(CEC)可以较好预测不同性质土壤中Cr的毒性阈值。研究结果对土壤中Cr的生态风险评价及土壤中Cr环境质量标准制、修订提供了科学依据。

关键词

铬 / 剂量-效应 / 低剂量毒物刺激效应 / 毒性阈值

Key words

chromium / dose-response / hormesis / toxicity threshold

0 引言

铬(Cr)是一种天然存在的过渡元素,被广泛用于金属、合金、陶瓷、镀铬、油漆、皮革鞣制和玻璃制造相关的不同行业^[1]。各种自然和人为过程导致土壤铬污染。不同环境介质中,Cr可以Cr(0)、Cr(III)、Cr(IV)、Cr(V)和Cr(VI)多种价态存在,土壤中Cr通常以Cr(III)和Cr(VI) 两种形态存在,Cr(VI)常以 {\mathrm{CrO}}_4^{2-}和Cr₂ {\mathrm{O}}_7^{2-}二种形式存在,在pH大于6.4的条件下以 {\mathrm{CrO}}_4^{2-}形式存在,在pH小于6.4的条件下以 {\mathrm{HCrO}}_4^{-}形式存在^[2]。Cr是最常见的金属污染物和人类致癌物质之一,其具有很强的生物毒性,不同价态中,Cr(VI)毒性高于Cr(III)。有研究表明,小鼠口服毒性LD50的Cr(VI)剂量为50~100 mg/kg,而Cr(III)的剂量达到1 900~3 000 mg/kg^[3]。土壤中,Cr(VI)会导致植物产生活性氧(ROS)胁迫,从而产生严重毒性,阻碍植物蛋白质、脂质和核酸等生物分子产生,并引起脂质过氧化^[4]。土壤中Cr(VI)对植物毒性还包括抑制电子传递与光合作用、叶绿体分解和影响矿质营养吸收等^[4-5],Cr(VI)对土壤微生物毒性表现为抑制微生物的生长代谢,如抑制土壤磷酸酶和硫酸酯酶活性等^[6]。近年来,土壤Cr污染及其环境风险引起了广泛关注,科学的土壤环境质量标准作为土壤重金属污染识别与污染土壤风险管控的重要尺度和依据,已被纳入多国的环境标准体系,在国际上得到广泛关注,美国、加拿大、英国、澳大利亚、荷兰、瑞典、丹麦等国家均对其开展了深入的研究。基于环境毒理学的土壤重金属对不同物种毒性阈值(EC_x)研究是制订土壤环境标准和开展土壤重金属污染生态风险评估的基础^[5],为此,本研究采集了7种具有代表性的不同性质土壤,以土壤动物(蚯蚓)、植物(小白菜)和土壤微生物(基础诱导呼吸SIR)3个不同物种为研究对象,测定了土壤中Cr对不同物种的毒性阈值(EC_x),建立了不同性质土壤中Cr毒性的预测模型,以期为不同性质土壤Cr环境风险评价及环境质量标准的制订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 土壤采集和处理

研究采集了中国7个不同地区的表层 (0~20 cm)土壤。土壤经过风干后分别通过2和0.15 mm尼龙筛进行理化性质测定和毒性实验测定。分别采用EDTA-铵盐法、重铬酸钾容积法、凯氏定氮法和移液管法测定土壤阳离子交换量(CEC)、有机碳(OC)含量和黏土(粒径<0.002 mm)含量^[7]。具体理化性质如表1所示,从表中可以看出,土壤pH值为4.93~8.90,CEC为8.33~20.65 cmol/kg,土壤有机质含量为0.69%~3.46%,黏土含量为12.0%~38.9%,土壤中总Cr含量为10.08~68.32 mg/kg。

根据预实验中不同性质土壤中Cr对不同测试物种产生的毒性的测定结果,本研究中按照不同性质土壤的最大田间持水量(MWHC)的70%,将不同浓度的K₂CrO₄溶液喷洒混合到土壤中,使土壤中Cr的添加含量为0~1 200 mg/kg,将土壤充分搅拌均匀后,置于常温((25±2) ℃)条件下老化4周。土壤老化期间,按照称重法补充水分,老化结束后,对土壤中Cr的实际含量进行测定。

1.2 毒性实验

1.2.1 基于底物诱导呼吸(SIR)的土壤微生物毒性测试^[8]

将每5.0 g土壤样品在70%田间最大持水量(MWHC)条件下预培养14 d,置于20 mL离心管中,加入0.125 mL 14C标记葡萄糖溶液。将离心管置于装有5 mL NaOH溶液的蓝盖瓶中,拧紧瓶盖。在黑暗条件下培育24 h后,将捕集器中的NaOH溶液转移到液体闪烁计数器(LSBC)中进行测量^[9]。每个处理重复3次。对照组土壤SIR设定为100%,各处理SIR相对量(%)为对照的比值,用Log-logistic函数拟合对土壤Cr微生物毒性(EC_x)进行测定。

1.2.2 蚯蚓毒性测定^[10]

试验前选择个体大小基本一致的赤子爱胜蚓,将赤子爱胜蚓放在与试验相同的环境条件下驯养24 h,用以去除蚯蚓体内物,然后用蒸馏水将蚯蚓冲洗干净,用滤纸吸干蚯蚓体表水分,称重。称取1 000 g平衡好土壤放入PVC筒(15 cm×10 cm)中,放入10条驯化好且清肠后的蚯蚓,用塑料薄膜(预先扎孔)封口,在温度为 (25±2) ℃、相对湿度为80%的人工气候培养箱中培养28 d后,按照培养前处理方法,用蒸馏水将蚯蚓冲洗干净,用滤纸吸干蚯蚓体表水分称重,对照组土壤蚯蚓生物量设为100%,各处理蚯蚓相对生物量(%)为对照的比值,以Log-logistic函数拟合对土壤Cr蚯蚓毒性(EC_x)进行测定。

1.2.3 小白菜毒性实验^[11]

开始实验前,将小白菜种子用H₂O₂消毒15 min后,在30 ℃温水中泡30 min。准备塑料小盆,每盆装土500 g,将统一预发芽的小白菜种子(根长2 mm左右)10颗播种到塑料盆中,7 d后定植为5根,胚根朝下置于土表以下1 cm处,在人工气候箱中培养28 d后,收获植株地上部分,用去离子水洗净,在烘箱中105 ℃杀青,60 ℃烘干24 h称量地上部分干物质质量,对照组土壤小白菜生物量设为100%,各处理小白菜相对生物量(%)为对照的比值,以Log-logistic函数拟合对土壤Cr小白菜生长抑制毒性(EC_x)进行测定。

1.3 毒性数据拟合

土壤中Cr对不同测试物种毒性的剂量-反应曲线采用Log-logistic函数模型拟合^[9]:

(1)y= \frac{y_0}{1+e^{b(x-M)}}

式中:y表示不同测试物种相对数量,%;x表示土壤中Cr的对数浓度;y₀和b表示拟合参数;M为EC₁₀或EC₅₀的自然对数。EC₁₀、EC₅₀和其对应的95%置信区间由Table Curve 2D V5.01求得。

当土壤中低剂量Cr对不同试验终点产生低剂量毒物刺激效应时,采用Hormesis模型^[12]拟合剂量-反应曲线:

(2)Y= \frac{a+bX}{1+\left(\frac{k}{100-k}+\frac{100}{100-k}·\frac{bc}{a}\right)e^{d\mathrm{l}\mathrm{n}(X/c)}}

式中:Y为试验终点相对量,%;X为土壤Cr的测定含量,mg/kg;a,b,c,d表示方程参数;k为常数,当k为10或50时,参数c定义为EC₁₀和EC₅₀。

1.4 统计分析

利用SPSS 26.0软件建立EC_x与土壤性质之间的单线性或多元线性回归方程。不同处理间差异显著,单因素方差分析为5%(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同性质土壤中Cr对不同物种毒性的剂量-效应关系拟合

基于剂量-效应关系的不同性质土壤中Cr对蚯蚓生物量、小白菜生物量和微生物SIR的毒性试验如图1所示。从图1可以看出,7种不同性质土壤中,Cr对3种不同测试物种(蚯蚓、小白菜和土壤微生物)毒性均随着土壤Cr含量的增加而表现出明显的抑制效应,剂量-效应关系呈现明显的S型曲线。从图1横坐标3种S型曲线位置可以看出,7种不同性质土壤中,3种不同物种Cr毒性的剂量-效应曲线从左到右均呈现出土壤微生物、蚯蚓和小白菜的顺序一致,这表明上述3种测试物种中,土壤微生物对Cr毒性最为敏感(EC_x值最小),土壤蚯蚓次之,而小白菜对Cr毒性具有相对较高的耐性(EC_x值最大)。

2.2 土壤中Cr对不同物种的毒性阈值(EC_x)

根据Log-logistic函数模型对土壤Cr的毒性阈值(EC_x,x=10,50)拟合得到不同测试物种的毒性阈值(表2)。从表2可以看出,不同性质土壤中Cr的毒性阈值具有显著差异。不同性质土壤中,基于蚯蚓生长抑制毒性测定的EC₁₀和EC₅₀分别为65.0~137.2和103.9~369.3 mg/kg,EC₁₀和EC₅₀的最大值分别是最小值的2.1和3.6倍。不同性质土壤Cr对小白菜生长抑制毒性EC₁₀和EC₅₀分别为82.1~220.2和159.9~441.9 mg/kg,最大值与最小值之比分别为2.7和2.8。基于土壤微生物基础诱导呼吸(SIR)毒性的EC₁₀和EC₅₀分别为22.1~53.7和50.3~103.7 mg/kg,EC₁₀和EC₅₀的最大值分别是最小值的2.4和2.1倍。总体而言,土壤中Cr毒性阈值(EC_x)呈现出随着土壤pH升高而增大,也即Cr毒性降低的趋势。

基于不同测试物种的土壤中Cr毒性阈值(EC_x,x=10,50)见图2。对7种不同性质土壤中相同物种的EC₁₀(图2A)与EC₅₀(图2B)均值的测定结果表明,在不同性质土壤中,不同物种毒性阈值(EC_x,x=10,50)的均值由低到高的顺序均为微生物(SIR)、蚯蚓、小白菜。不同性质土壤中,基于微生物(SIR)、蚯蚓和小白菜毒性测试的EC₁₀分别为22.1~53.7、65.0~137.2和82.1~220.2 mg/kg,EC₅₀分别为50.3~103.7、103.9~369.0和159.9~441.9 mg/kg,这表明,不同性质土壤中,土壤微生物对Cr毒性胁迫最敏感。从不同测试物种在7种土壤中毒性阈值(EC₁₀和EC₅₀)的平均值来看,均表现为SIR最小,蚯蚓次之,小白菜最大(图2C),而从EC₁₀和EC₅₀的测定值95%置信区间范围来看,EC₁₀的95%置信区间范围比EC₅₀的95%置信区间范围更宽(表2),这说明在以不同抑制浓度的毒性测试中,EC₁₀的毒性测试结果具有较大的变异性特点。

2.3 土壤中Cr毒性的低剂量刺激效应

在土壤中Cr对不同物种的毒性剂量效应关系测定中,除了德州潮土与海口砖红壤外,小白菜与蚯蚓对土壤Cr在低含量(<112 mg/kg)条件下,均表现出明显的低剂量刺激效应(图1)。如图1所示,在GL、HY、JX、XX和BD这5种土壤中出现明显Cr低剂量毒物刺激效应,3种不同的测试终点均出现低剂量毒物刺激效应,表现为随着土壤Cr含量的增加,曲线呈现先升高后降低的趋势,曲线呈倒U型。本研究中,低剂量毒物刺激(最大)效应定义为:不同测试物种的测试终点值(生物量和呼吸速率)与对照(CK)相比,出现最大反应的值(图1中曲线的最高点)。本研究中,不同性质土壤中,3种测试物种对Cr低剂量胁迫的刺激效应值见表3。表3显示:蚯蚓在不同性质土壤中的最大刺激效应为102%~108%;小白菜的最大刺激效应为105%~112%;相对来说,土壤中Cr对微生物的低剂量刺激效应较小,仅在HY和JX两种土壤出现低剂量刺激效应,最大刺激效应为104%。

2.4 基于土壤性质的Cr毒性阈值预测方程

在测定不同性质土壤3种不同物种Cr毒性阈值的基础上,构建了基于预测土壤Cr毒性阈值(EC_x,x=10,50)与相关土壤性质的回归预测方程(见表4)。不同土壤性质中,pH、CEC、OC含量(w(OC))和黏土含量(w(Clay))是影响Cr毒性阈值的主要因素。表4中预测方程表明,pH、CEC、w(OC)和w(Clay)与EC_x均呈正相关。对于蚯蚓生物量,EC₅₀的二元方程表明pH和w(OC)共同解释了70.2%的变异 (p<0.05)。

当EC₅₀的线性方程继续被CEC因子引入时,其R²增加到0.832(p<0.05)。继续引入w(Clay)因子,R²增加到0.864(p<0.01)。土壤pH和CEC共同解释了EC₁₀ 76.1%(p<0.05)的变异率。在方程中引入w(OC)因子后变异率增加到84.9%(p<0.01)。在小白菜毒性试验中,pH和CEC可以共同解释EC₅₀ 61.5%(p<0.05)的变异率。在pH、w(OC)和CEC 3个因子的影响下,EC₁₀和EC₅₀的线性回归方程R²分别为79.9%和81.5% (p<0.05)。对于微生物SIR,土壤pH和w(OC)对EC₁₀的影响为75.0% (p<0.05)。将CEC和w(Clay)同时引入线性方程,R²变为0.860(p<0.05)。土壤pH和w(OC)共同解释了EC₅₀ 72.6%(p<0.05)的变异率。当引入CEC因子时,EC₅₀的线性方程R²提高到85.2%(p<0.01)。在pH、w(Clay)和CEC 3个因子的影响下,EC₅₀的线性回归方程R²为0.853(p<0.01)。

3 讨论

3.1 不同物种及测试终点对土壤Cr毒性阈值的影响

不同土壤中各试验物种对Cr的毒性反应显著,并且基于不同测试终点的Cr的EC_x值存在显著差异。这可能与每个测试终点对Cr的不同敏感性有关^[13]。大部分Cr的EC₁₀和EC₅₀降低的顺序为:小白菜>蚯蚓>SIR;这一结果表明,上述3种测试物种中,SIR是对Cr毒性最敏感的试验指标。Zhang等的研究^[8]也表明,微生物潜在硝化速率(PNR)和SIR中Cr(VI)的EC₅₀几乎都小于土壤无脊椎动物和植物。因此,生物学试验终点在重金属毒性阈值的确定中发挥了重要作用^[14]。如果根据敏感试验终点的毒性阈值来建立环境基准,则其值可能在本底范围内,从而导致对某些土壤的过度保护。另一方面,如果选择的物种中,大部分为不敏感的物种,则推导出的环境基准将偏宽松,土壤环境将难以得到充分保护^[15]。毒性阈值的差异很大程度上与被试物种的敏感性差异有关。因此,在确定土壤重金属的毒性阈值时,有必要选择尽可能多的不同试验物种,以保证环境基准值的科学性。不同研究表明不同测试物种(植物、无脊椎动物和微生物)对土壤Cr的毒性敏感性不同,这会导致Cr毒性阈值存在显著差异^[8,10]。目前,关于Cr在土壤环境中的毒性研究大多以地上植物为主,如:王晓南等^[11]基于白菜、黄瓜和玉米等8种植物研究了土壤中Cr的毒性阈值,并建立了相关预测模型;Amin等^[16]研究了Cr对木槿种子萌发、幼苗生长、幼苗活力指数、叶绿素含量和耐受性指标的毒害作用;王爱云等^[17]评估了Cr对3种草本植物的生长、生理特性(叶绿素、SOD、POD活性等)和积累情况的影响。相对而言,目前针对土壤重金属毒性测试研究中,对地下生态物种的毒性研究较少,而地下生态系统是植物、动物和微生物生存的基质,对重金属生态风险评估和土壤污染防治具有重要意义^[18]。

3.2 土壤中Cr毒性的低剂量刺激效应

低剂量毒物刺激效应是指低剂量毒物产生刺激反应而高浓度毒物产生抑制作用的现象,广泛存在于各种生物的剂量-效应关系中^[19]。低剂量毒物刺激效应(Hormesis)是生物体在低剂量刺激和高剂量抑制下发生的适应性反应,EC_x是通过双相剂量-反应模型Hormesis,即修正的logistic模型得到的^[20]。本研究发现,基于蚯蚓生物量、小白菜生物量和SIR的Cr毒性试验均出现低剂量毒物刺激效应,最大达112%。有研究表明,与对照相比,低浓度(12.5 μmol·L^-1) Cr(VI)显著刺激了大蒜(Allium cepa L.)根的生长^[21]。低剂量毒物刺激效应被认为是生物体对低浓度毒物的应激反应。机体产生的防御机制可能与抗氧化酶活性、金属硫蛋白(MT)合成、组织再生等生理代谢过程有关^[22]。活性氧(ROS)的消除或抗氧化剂和金属结合蛋白的合成在胁迫中发挥了重要作用。例如:在低浓度Cr环境下,龙葵(Solanum nigrum)中脯氨酸的含量增加^[23];过氧化氢酶(CAT)活性随着Cr含量从0到12.5 mg·kg^-1增加而增强,当Cr含量>12.5 mg·kg^-1时降低。Talebi等^[24]也指出了类似的结果,低剂量Cu、Zn、Cd和Ni促进了绿豆属植物MT的活性。

在重金属毒性阈值EC_x测定中,传统的剂量-效应关系采用Log-logistic模型进行拟合,拟合曲线通常为S型曲线^[22]。然而,随着毒理学研究的深入,人们发现低剂量毒物刺激效应在生物体内广泛存在,单相Log-logistic模型明显存在一些缺陷。低剂量毒物刺激效应为双相剂量-反应关系,可以采用Hormesis模型函数进行拟合,拟合曲线通常为J型或倒U型^[12]。本研究结果表明,土壤中Cr毒性的低剂量毒物刺激效应曲线呈现倒U型。因此,在评估重金属生态风险时应考虑低剂量毒物刺激效应,并将传统的剂量-反应关系拟合模型(Log-logistic模型)与Hormesis相结合^[25-26]。

3.3 基于土壤性质的Cr毒性阈值预测模型

土壤中Cr毒性阈值主要取决于土壤中Cr生物有效性和测试终点^[27],而Cr的生物有效性主要取决于土壤性质、元素间的相互作用和暴露时间因素等^[28]。pH、EC、CEC、有机质(OM)含量和土壤质地等土壤性质通过影响Cr固溶分配从而影响其生物有效性^[29]。本研究中,不同性质土壤Cr 毒性EC₁₀和EC₅₀回归分析结果表明,在不同的试验终点,土壤pH和CEC是影响Cr毒性阈值的主要因子,土壤pH、OC和黏土含量、CEC均与不同测试终点EC₁₀和EC₅₀呈显著正相关。在基于跳虫试验的10种不同土壤中Cr毒性阈值研究中,土壤OM和黏土含量与EC₅₀呈正相关,pH和OM含量一起可以解释85.4%的变异^[28]。马虹等的研究^[30]也表明,Cr污染土壤中基大麦根伸长的毒性阈值与CEC呈正相关。

土壤pH值在控制各种重金属的形态及其在土壤中的吸附/解吸过程中起着重要作用^[4]。土壤CEC在影响重金属的生物有效性中也发挥了关键作用。本研究结果表明,高CEC (JX,GL,HY)土壤中Cr的EC_x相对较大。土壤有机质在影响包括Cr在内的重金属的生物有效性和地球化学行为中起着重要的决定作用。Cr在有机质中的积累与暴露时间成正比。有机质的降解产物导致羧酸等金属离子的氧化螯合配体形成,有利于金属在土壤颗粒上的吸附^[31]。从表4可以看到,OC含量与基于小白菜生物量的毒性阈值成正相关,其与pH和CEC可以共同解释EC₅₀ 77.6%的变异(p<0.05)。毒性阈值EC_x与黏土含量成显著正相关,土壤黏土含量的增加降低了Cr的毒性(表4)。此外,黏土直接或间接地促进了Cr的还原。黏土含量被认为与较大的土壤表面积密切相关,并为金属提供了重要的吸附位点^[32]。

4 结论

本研究选择了蚯蚓、小白菜和土壤微生物为测试物种,基于Log-logistic剂量效应函数拟合、低剂量刺激效应矫正等方法,测定了7种不同性质土壤中Cr的毒性阈值,主要结论包括以下3点。

(1)不同性质土壤中,3种不同物种Cr毒性阈值由大到小顺序为小白菜>蚯蚓>土壤微生物,土壤微生物对Cr毒性最为敏感,蚯蚓次之,而小白菜对Cr毒性具有相对较高的耐性。不同性质土壤中Cr的毒性阈值具有显著差异,总体而言,Cr毒性阈值(EC_x,x=10,50)随土壤pH升高而增大。

(2)在土壤Cr低含量(<112 mg·kg^-1)条件下,上述3种测试物种对Cr毒性表现出明显的低剂量刺激效应,蚯蚓在不同性质土壤中最大刺激效应为102%~108%,小白菜为105%~112%,相对来说,土壤中Cr对微生物的低剂量刺激效应较小,最大刺激效应为104%。

(3)土壤pH、CEC、OC含量和黏土含量是影响Cr毒性阈值的主要因素,pH、黏土含量和CEC可以较好地预测不同性质土壤中Cr的毒性阈值。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFC3708703)

中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-CSGLCA-202302)