非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

摘要

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体间接ELISA检测方法，利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白，并以表达的蛋白作为包被抗原，对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列，按照本氏烟草密码子的偏好性，对p30基因(231～536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆，通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间，构建PVY-p30重组病毒质粒，以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片，14 d后，通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况，并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白，Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性，将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原，建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示，构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草；p30重组蛋白能够在本氏烟草叶片中表达，且具有良好的反应原性；纯化的p30重组蛋白效果较好，能够被p30蛋白单克隆抗体识别。建立的ELISA检测方法最佳反应条件为抗原质量浓度0.5 mg/L,37℃包被1 h;待检血清1∶400倍稀释，37℃孵育0.5 h; HRP标记二抗37℃孵育0.5 h; TMB室温避光显色10 min;阴阳性临界值为0.461。当ASFV阳性血清稀释度为1∶2 560时，仍检测为阳性，具有较高的敏感性；该方法与其他常见病阳性血清不发生交叉反应，能够特异性地检测ASFV抗体；重复性试验显示批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%;该方法与ASFV商品化检测试剂盒相比，总体符合率为85.0%。结果表明，本研究构建的PVY-p30重组病毒载体能介导p30重组蛋白在本氏烟草中表达，以植物表达的p30重组蛋白为抗原建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法可用于疾病的临床检测及疫情监测，同时为可饲疫苗的研发提供了基础材料。

关键词

间接ELISA / 非洲猪瘟病毒 / 马铃薯Y病毒 / 植物生物反应器 / p30蛋白