多重PCR方法鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌

摘要

为建立鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌(DEC)多重PCR检测方法，对陕西关中奶牛场犊牛粪便中分离的大肠埃希菌进行检测。以EAEC(astA、aggR、pic)、EHEC(stx1、stx2)、EPEC(escV、bfpB)、EIEC(invE)和ETEC(lt、stp、sth)5类DEC中11种毒力基因为目标，uidA基因为阳性对照，建立两体系(体系Ⅰ和Ⅱ)多重PCR检测方法，通过改变引物浓度、退火温度等检测条件进行优化，并对其特异性和灵敏度进行检测。结果显示，体系Ⅰ检测EAEC、EHEC,体系Ⅱ检测EPEC、EIEC、ETEC,除astA引物浓度为0.5μmol/L,其余均为0.3～0.4μmol/L;退火温度以59℃最佳；ETEC的检测下限最低(1.09×10~(3 )CFU/mL),其余依次为EHEC(1.27×10~3 CFU/mL)、EIEC(2.43×10~3 CFU/mL)、EPEC(5.71×10~3 CFU/mL)、EAEC(7.98×10~3 CFU/mL);经验证该方法只对DEC毒力基因产生特异性，而对沙门菌、化脓隐秘杆菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄葡萄球菌不产生特异性条带；应用此方法对183株犊牛腹泻源E.coli进行了检测，共检出17株DEC,其中EAEC 6株、ETEC 4株、EPEC 4株、EHEC 2株、EIEC 1株，经单一PCR验证结果一致。本研究建立的检测5类DEC多重PCR方法可对样品采用两体系、同一PCR反应程序进行检测。该方法的建立为牛源DEC中常见毒力基因的检测及分子流行病学调查提供了方法与借鉴。

关键词

致泻性大肠埃希菌 / 多重PCR / 毒力基因 / 犊牛腹泻