猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B F190A突变及免疫原性

摘要

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是造成猪肺炎和胸膜炎的重要病原菌之一，其病死率高达80%～100%。为了寻找APP转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)与猪转铁蛋白(transferrin, Tf)相互作用的关键氨基酸，以达到为APP铁摄取机制研究及相关疫苗开发奠定基础的目的，本研究在对野生型TbpB进行序列分析、三维结构建模、克隆的基础上，通过GRAMM-X分子对接软件在线预测APP TbpB与猪Tf结合的关键氨基酸，利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建突变质粒，ZYM-5052半乳糖自诱导培养基诱导大肠杆菌表达该突变蛋白后与猪Tf进行斑点结合试验，野生型TbpB、突变TbpB以及PBS分别免疫小鼠，采用间接ELISA法检测不同阶段小鼠血清中特异性抗体的水平。分子对接结果显示，预测的关键氨基酸为第190位苯丙氨酸，质粒测序结果显示，已成功将编码190位苯丙氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子；斑点结合试验结果显示，突变TbpB与猪Tf不再发生结合反应；小鼠免疫试验结果表明与野生型TbpB相比，突变TbpB可诱导产生更高水平的抗体；APP TbpB 190位苯丙氨酸在与猪Tf反应中起着关键作用，突变TbpB具有良好的免疫原性，为进一步研究TbpB的功能、结构以及开发相关疫苗奠定了理论基础。

关键词

猪胸膜肺炎放线杆菌 / 转铁结合蛋白B / 定点突变 / 斑点结合试验 / 免疫原性