贵州1株G9P[23]型猪A群轮状病毒的分离鉴定及基因组序列分析

摘要

为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系，本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测，选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定，并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示，阳性样品经胰酶预处理后接种至Vero细胞，盲传至第15代出现稳定CPE,前期细胞变圆后固缩、脱落，后期胞浆界限不清，出现拉网现象，用特异性引物对细胞培养物进行RT-PCR鉴定，成功扩增341 bp的目的条带。细胞培养物的间接免疫荧光鉴定显示有特异性绿色荧光反应，电镜观察下可见晶格状排列的无囊膜病毒粒子，大小约70 nm,表明成功分离到1株PoRV,将之命名为GZZY2021。病毒增殖曲线结果显示，用GZZY2021株感染细胞后，0～12 h病毒含量最低，12～30 h病毒增殖速度最快，30～48 h病毒增殖速度较平缓，48 h病毒滴度达到峰值(10~(-5.60)/0.1 mL),而后进入稳定期。全基因组克隆测序分析结果显示，GZZY2021分离株基因组全长为18 506 bp, 11个基因最相似序列同源性均>95.00%,VP1、VP2、VP4、VP7、NSP1、NSP3、NSP4基因与猪源毒株同源性最高，VP3基因与大熊猫源毒株相似性最高，VP6、NSP2、NSP5基因与人源毒株同源性最高，提示分离株为三元重配毒株，完整的基因型为G9-P[23]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP4、VP7基因与同型参考毒株相比，分别发生5、3处独有氨基酸位点变异；与NX疫苗株的中和表位分别存在22、4处氨基酸位点差异。重组分析结果显示，GZAS2020株的NSP5基因是以PTR(FJ422141.1)为主要亲本毒株，A411(EF990694.1)为次要亲本毒株重组产生的毒株，重组断点位于121和321 bp。综上所述，本研究应用Vero细胞成功分离到1株G9P[23]型基因重配PoRV,不但可对持续监测贵州省PoRV的流行动态趋势提供研究数据，而且对筛选该领域的候选疫苗株以及该病的深入研究打下基础。

关键词

猪A群轮状病毒 / 分离鉴定 / 序列分析