牛结节性皮肤病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

摘要

为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法，本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子，构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSDV的阳性血清识别，具有良好的反应原性。用纯化的RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠，并将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，筛选到能够稳定分泌抗体且具有竞争效果的杂交瘤细胞株1H1。以重组RPO30蛋白为包被抗原，经反应条件的优化，建立了基于RPO30蛋白的竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。本研究建立的cELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度为1 mg/L,用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST作为封闭液37℃孵育2 h,待测血清的最适稀释度为1∶2,1H1抗体稀释度为1∶2 000,兔抗鼠HRP-IgG稀释度为1∶4 000,最佳显色条件是37℃反应15 min。当检测样品的1-S/P≥0.55,判定结果为阳性；当检测样品的1-S/P<0.55,判定结果为阴性。利用该方法检测了LSDV、牛传染性鼻支气管炎病毒(IBRV)、牛支原体(M.bovis)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛布鲁杆菌(B.abortus)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清，结果显示除了LSDV检测结果阳性外，其他病原的检测结果都是阴性，说明本方法特异性强。利用本试验建立的cELISA检测有免疫背景的临床血清200份，结果显示，其可用于临床疫苗免疫效果的评估。本研究基于重组RPO30蛋白建立的cELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好，为LSDV的检测和预防提供了可靠的技术支持。

关键词

牛结节性皮肤病病毒 / RPO30基因 / 原核表达 / 竞争ELISA